羅海霞，孫遠航，徐兆坤，馮婷婷，郝秀靜，李 敏

（寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）可引起綿羊及山羊傳染性胸膜肺炎（非典型性肺炎）[1]，表現(xiàn)為高熱、喘氣、咳嗽、貧血、漸進性消瘦、生長發(fā)育遲緩、胸膜炎及纖維性肺炎等臨床癥狀[1-2]。該病分布廣泛，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。研究表明支原體能夠黏附到綿羊肺臟細胞，并對宿主細胞造成極大危害[3-4]，但宿主細胞與MO 感染的關(guān)系仍不明確。

細胞自噬（Autophagy）是真核生物中維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種降解途徑[5]，可降解細胞內(nèi)的衰老細胞器和長壽蛋白，也可降解侵入性病原體[6]。在細胞的生存、抗感染免疫等方面起著重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)解脲支原體感染細胞可以誘導(dǎo)細胞自噬，并且可以利用宿主細胞膜隔室（Host cellular membrane compartments）逃避宿主細胞的自噬和免疫損傷[5-8]；肺炎支原體可通過黏附細胞誘導(dǎo)自噬炎性反應(yīng)[9]。目前關(guān)于MO 能否引起細胞自噬尚無報道，基于此本研究檢測MO 感染TC-1 細胞后自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達水平、自噬流的形成及干擾自噬后MO 在細胞內(nèi)的增殖情況，對MO 誘導(dǎo)TC-1 細胞的自噬進行初步探究，為進一步揭示MO 的感染機制提供研究思路，進而為治療該病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料支原體肉湯培養(yǎng)基購自Hope?bio 生物技術(shù)有限公司；TAE 緩沖液（10×）購自Com?Win Biotech 生物科技有限公司；RNAsimple Total RNA Kit 購自北京TIANGEN 有限公司；SYBR?Pre?mix ExTaqTMII 和PrimeScripTMMaster Mix 購 自TaKaRa公司；胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、DMEM 購自Hyclone 公司；全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物公司；蛋白BCA 定量檢測試劑盒購自賽默飛生物公司；小干擾RNA 轉(zhuǎn)染試劑SiRNA-Mate購自吉瑪基因生物公司；anti-P62、anti-LC3、anti-Atg7、anti-β-actin 抗體購自Cell Signalling Technolo?gy 公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG 購自Proteintech Group 公司；自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3）、P62-siRNA、Atg7-siRNA 購自上海漢恒生物科技有限公司；蛋白Marker、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑購自PageRuler 公司。

1.2 細胞系、MO 及其培養(yǎng)方法小鼠肺上皮細胞（TC-1）購自American Type Culture Collection 公司，在含10%胎牛血清的DMEM 中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)成單層細胞。MO 標準株Y98（MO-Y98）由寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室保存。在超凈工作臺內(nèi)取5 mL MO 按1∶5 比例加入25 mL 新鮮配制的MO 液體培養(yǎng)基（支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基含10%滅活小牛血清），置于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)，4 d～7 d 觀察顏色變化，當顏色明顯由紅色變?yōu)槌吸S色時，傳代。

1.3 MO 感染TC-1 細胞自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測根據(jù)NCBI 登錄的小鼠mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計擴增目的基因的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。待12 孔板中的TC-1 細胞密度達70%以上時，以感染復(fù)數(shù)（MOI）10 的MO 感染TC-1 細胞，收集感染前、感染后6 h、12 h、24 h 的細胞提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA 為模板，利用SYBR Premix ExTaqTMIIS試劑盒檢測LC3I、LC3II、P62、Atg7基因在感染后各時間點的轉(zhuǎn)錄水平，設(shè)未感染MO的TC-1細胞為對照。

表1 自噬相關(guān)基因檢測的qRT-PCR 引物Table 1 The primers for qRT-PCR

1.4 MO 感染TC-1 細胞后自噬相關(guān)蛋白的檢測利用上述方法將MOI 10 的MO 感染TC-1 細胞。收集感染前、感染后6 h、12 h、24 h 的細胞，利用細胞蛋白提取試劑盒提取總蛋白并通過BCA 試劑盒定量。取感染后不同時間點的100 μg 蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)膜，封閉后，分別孵育抗LC3（1∶1 000）、P62（1∶1 000）、Atg7 抗體（1∶1 000）為一抗，以HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白LC3II、P62、Atg7 的表達水平，并通過Image J 軟件對western blot結(jié)果進行灰度值分析。

1.5 MO 感染TC-1 細胞后細胞自噬流的檢測將1×105個/mL TC-1細胞接種12孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃5%CO2過夜培養(yǎng)后加入腺病毒mRFP-GFP-LC3（MOI 20），轉(zhuǎn)染24 h 后將MO 以MOI 10 感染細胞，分別于感染后6 h、12 h、24 h 固定細胞、封片。設(shè)腺病毒mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染的不感染MO的細胞對照組（Con?trol）。由于GFP 蛋白對酸性敏感，在自噬溶酶體中熒光會迅速淬滅，而RFP是一種耐酸性的熒光，因此以mRFP-GFP-LC3追蹤自噬流。利用JEM-2100F熒光顯微觀察GFP、RFP的表達情況，并利用Image J 軟件分析細胞內(nèi)熒光斑點的數(shù)量分別作圖統(tǒng)計分析細胞內(nèi)綠色及紅色斑點數(shù)量，同時以綠色和紅色疊加圖中的黃色與紅色熒光圖的斑點數(shù)量作圖分析MO 感染TC- 1 細 胞 后 是 否 形 成 自 噬 流 。

1.6 siRNA 沉默P62、Atg7 基因表達效果的檢測P62 和Atg7 siRNA 序列由上海吉瑪公司設(shè)計并合成（表2）。在100 μL 無血清的1640 中分別加入3 μL 1 μmol/L siRNA-p62 和siRNA-Atg7 溶 液 后，加 入1 μL 1 μmol/L siRNA 儲存液，混勻，室溫放置5 min。再將2 μL 試劑盒中的siRNA-Mate 加到上述混合液中，室溫放置10 min，以形成siRNA oligo-siRNAmate 復(fù)合物。待12 孔板中的TC-1 密度達75%時，將siRNA oligo-siRNA-mate 復(fù)合物緩慢加入細胞培養(yǎng)孔中，混勻，37 ℃5% CO2培養(yǎng)48 h，經(jīng)1.4 的west?ern blot 檢測P62 和Atg7 蛋白的表達水平，同時設(shè)空白對照（Control）、陰性對照-siRNA 對照組（NC）。利用灰度值做圖分析TC-1 細胞中各siRNA 對P62 和Atg7 基因表達的沉默效果。

表2 siRNA 序列Table 2 The sequence of siRNA

1.7 MO 感染P62、Atg7 基因沉默后的TC-1 細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3II 表達水平的檢測按照1.6 的步驟分別轉(zhuǎn)染siRNA-P62、siRNA-Atg7 36 h 后，將MO 以MOI 10 感染細胞12 h，提取細胞總蛋白經(jīng)1.4的western blot 檢測LC3II 的表達水平。設(shè)陰性對照siRNA+MO（NC+MO）和未感染的細胞對照（Control）。

1.8 P62 和Atg7 基因沉默后TC-1 細胞中MO 增殖能力的檢測變色單元（Colour change unit，CCU）用于計算支原體的相對含量。以MOI 10 的MO 感染TC-1 細胞，收集感染后6 h、12 h、24 h、48 h 的細胞，PBS 洗3 次，重懸，靜置30 min。取12 支無菌EP 管分別標號，在每支管中加入900 μL 支原體肉湯培養(yǎng)基。將100 μL 細胞裂解液加入到第1 號EP管中，依次做10 倍倍比稀釋至11 號管，第12 號管為陰性對照。將12 支管置37 ℃培養(yǎng)7 d～8 d，以最后一支由紅色變?yōu)辄S色作為待測試MO 的CCU，統(tǒng)計分析MO 感染TC-1 細胞后的活菌數(shù)。按照1.6 的方法沉默P62 和Atg7 基因后，利用MOI 10 的MO 感染，12 h 后采用上述CCU 試驗檢測基因沉默后TC-1細胞中MO的活菌數(shù)。設(shè)NC+MO的細胞為陰性對照。

1.9 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0 軟件中的One-Way ANOVA 進行統(tǒng)計學(xué)分析，*為差異顯著（0.01＜p＜0.05），**為差異極顯著（p＜0.01）。

2 結(jié) 果

2.1 MO 感染TC-1 細胞后自噬相關(guān)基因的檢測結(jié)果為確定MO 對TC-1 細胞自噬的影響，利用熒光定量PCR 檢測MO 感染TC-1 細胞后不同時間自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，MO 感染TC-1 細胞后6 h、12 h、24 h 時的自噬相關(guān)基因LC3I、LC3II、P62 及Atg7 的轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)升高趨勢，在MO 感染6 h 時上述自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平均達到最高，與感染前相比，轉(zhuǎn)錄水平分別上升1.8 倍（p＜0.01）、1.5 倍（p＜0.05）、1.6 倍（p＜0.05）和2.3 倍（p＜0.01）（圖1）。表明MO 感染能引起TC-1 細胞中自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，從基因水平表明MO 感染可誘導(dǎo)TC-1 細胞自噬。

圖1 MO 感染后不同時間TC-1 細胞自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測結(jié)果Fig. 1 mRNA levels of autophagy-related genes in TC-1 after infected with MO

2.2 MO 感染TC-1 細胞后自噬相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果LC3I脂質(zhì)化形式LC3II，它可以附著到自噬體的膜上，是自噬體的結(jié)構(gòu)蛋白。MO 感染TC-1 細胞6 h、12 h、24 h 后經(jīng)western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，感染MO 的TC-1 細胞自噬相關(guān)蛋白LC3II、P62 及Atg7 的表達水平與感染前相比均明顯升高（圖2A）；利用GraphPad Prism 7做的柱狀圖結(jié)果顯示，與感染前相比，MO 感染6 h 時TC-1 細胞自噬相關(guān)蛋白Atg7、P62、LC3II 表達量分別上升1.4倍（p＜0.01）、1.2 倍（p＜0.05）、2.1 倍（p＜0.05），感染12 h 時自噬相關(guān)蛋白的表達量最高，與感染前相比分別增加2.4 倍（p＜0.01）、5.8 倍（p＜0.05）、3.1 倍（p＜0.05）。感染24 h自噬相關(guān)蛋白的表達量較12 h 呈下降趨勢（圖2B～2D）。以上結(jié)果從蛋白水平表明MO 感染可誘導(dǎo)TC-1 細胞自噬。

圖2 MO 感染TC-1 細胞后不同時間自噬相關(guān)蛋白表達的檢測結(jié)果Fig. 2 Expression of Atg7, P62 and LC3II in TC-1 cells at different points post-infection with MO

2.3 MO 感染對TC-1 細胞形成自噬流的檢測結(jié)果將mRFP-GFP-LC3 感染TC-1 細胞，24 h 后感染MO，感染后不同時間通過熒光顯微鏡觀察熒光，并利用Image J 軟件統(tǒng)計分析細胞內(nèi)綠色及紅色斑點的數(shù)量并作圖，并統(tǒng)計分析疊加后細胞內(nèi)的黃色斑點和紅色斑點的數(shù)量并作柱狀圖。紅綠熒光疊加后出現(xiàn)的黃色熒光即是自噬體，紅色的斑點指示自噬溶酶體。結(jié)果顯示，與未感染MO 的細胞（Control）相比， MO 感染后的TC-1 細胞具有更多的黃色和紅色斑點（p＜0.05），并且隨著感染時間的延長黃色和紅色斑點增多（圖3A、3B）。以上結(jié)果表明MO 感染可誘導(dǎo)TC-1 形成完整的自噬流，且隨著感染時間的延長，形成的自噬流越強。

圖3 MO 感染TC-1 細胞后不同時間點自噬流的檢測結(jié)果Fig. 3 The formation of autophagic flux in TC-1 cells at different time points post-infection with MO

2.4 siRNA 沉默P62、Atg7 基因表達效果的檢測結(jié)果分別將siRNA-P62、siRNA-Atg7 轉(zhuǎn)染TC-1，設(shè)置空白對照組（Control）和陰性siRNA 轉(zhuǎn)染組（NC），經(jīng)western blot 檢測P62 和Atg7 蛋白的表達水平，并經(jīng)灰度值分析各siRNA 沉默P62、Atg7 基因表達的效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-P62、siRNA-Atg7 的TC-1 細胞中P62、Atg7 蛋白表達量均顯著低于Control 組或NC 組，表達量均降低約50%（圖4，p＜0.01）。表明siRNA-P62、siRNA-Atg7的沉默效果良好。

圖4 P62 和Atg7 基因沉默效果的western blot（A）及灰度分析（B）結(jié)果Fig. 4 Western blot (A) and relative gray analysis (B) of silence efficiency of P62 and Atg7

2.5 MO 感染P62、Atg7 基因沉默后的TC-1 細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3II 表達水平的檢測結(jié)果將MO分別感染經(jīng)siRNA-P62 和siRNA-Atg7 轉(zhuǎn)染的TC-1細胞，12 h 后經(jīng)western blot 檢測LC3II 蛋白的表達。結(jié)果顯示，P62 和Atg7 基因沉默后，與NC+MO組相比， TC-1 細胞中LC3II 的表達水平顯著降低（p＜0.01），與未做任何處理的TC-1（Control）相比，P62 和Atg7 基因沉默后，TC-1 中LC3II 的表達水平無差異（圖5）。表明分別沉默P62 基因和Atg7 基因后，LC3II 的表達量減少說明LC3I 向LC3II 的轉(zhuǎn)變均受到抑制，從而抑制MO 感染所致的細胞自噬。

2.6 P62、Atg7 基因沉默后TC-1 細胞中MO 增殖能力的檢測結(jié)果利用CCU 試驗檢測MO 感染TC-1細胞后不同時間的活菌數(shù)。結(jié)果顯示，MO 可以在巨噬細胞中存活并增殖，與感染6 h 相比，感染24 h 和48 h 后，MO 在胞內(nèi)的活菌數(shù)均明顯增加（p＜0.05）（圖6A）；同時檢測MO 感染P62 和Atg7 基因沉默后的TC-1 細胞12 h 后的活菌數(shù)。結(jié)果顯示，與NC+MO 組相比（104），分別沉默P62 和Atg7 基因后MO在胞內(nèi)的活菌數(shù)均明顯增加（105，p＜0.05）（圖6B）。上述結(jié)果表明TC-1 細胞自噬對MO 在胞內(nèi)的存活和增殖起到一定的抑制作用。

圖5 MO 感染P62、Atg7 基因沉默細胞中LC3II 蛋白表達的western blot 檢測（A）和灰度分析（B）結(jié)果Fig. 5 Western blot (A) and relative gray analysis (B) of LC3II expression in TC-1 cells with P62 and Atg7 suppressed by siRNA

圖6 MO 分別感染TC-1 細胞（A）及P62、Atg7 基因沉默后TC-1 細胞（B）中MO 活菌數(shù)的檢測結(jié)果Fig. 6 MO Intracellular proliferation inTC-1 cells (A) and MO intracellular proliferation in P62 and Atg7 suppressed TC-1 cells (B)

3 討 論

MO 是綿羊支原體肺炎的主要致病菌，能引起綿羊慢性呼吸道疾病，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。MO 可附著于綿羊肺泡巨噬細胞質(zhì)膜[10]，通過釋放毒素造成細胞損傷[9]。目前關(guān)于MO 的研究多集中于對該病菌致病因子的研究，對其與宿主細胞互作的報道較少。細胞自噬在抵抗病原微生物中發(fā)揮重要的作用[7]。自噬可以通過自噬溶酶體清除病原微生物的感染，而有些病原微生物可以利用細胞自噬為其在細胞內(nèi)的存活提供物質(zhì)和場所[5-7]。但MO 感染對細胞自噬的作用尚未見報道。本研究以TC-1細胞為研究對象，探究MO 與該細胞自噬的關(guān)系及細胞自噬對MO 增殖的影響。

LC3、P62 和Atg7 基因是細胞自噬的關(guān)鍵基因[11-12]。其中LC3 是研究最為深入的自噬標志分子。LC3 是可溶性胞質(zhì)蛋白，Atg4 能夠切除LC3 羧基端22 個氨基酸露出甘氨酸而變成LC3I 以前體形式游離于胞質(zhì)中[12]。然后通過Atg7 和Atg3 催化LC3I與磷脂酰乙醇胺PE 結(jié)合，形成LC3II[13-14]。P62 可以將LC3 蛋白連接到自噬前體而促進自噬體的成熟[15]。Atg7 在細胞自噬形成的早期和在自噬泡的形成中起重要作用[12]。本研究將MO 感染TC-1 細胞后，利用RT-PCR、western blot 檢測顯示，LC3II、P62 及Atg7 的轉(zhuǎn)錄和表達水平均顯著升高，表明MO的感染能引起TC-1 細胞自噬；進一步通過轉(zhuǎn)染串聯(lián)熒光蛋白的腺病毒，經(jīng)熒光顯微鏡觀察并統(tǒng)計分析結(jié)果表明MO 可引起TC-1 形成完全的自噬流。

RNA 干擾（siRNA）技術(shù)具有高度特異性、高效、易操作等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于基因功能的研究。細胞自噬領(lǐng)域通過siRNA 沉默相關(guān)基因表達以抑制細胞自噬的發(fā)生。本研究分別通過siRNA-P62及siRNA-Atg7 沉默TC-1 細胞中的P62 和Atg7 基因后感染MO，利用western blot 檢測細胞中LC3II 的表達水平。結(jié)果顯示TC-1 細胞中LC3II 的表達水平下降，說明P62 和Atg7 基因沉默后能夠抑制MO 感染導(dǎo)致的細胞自噬。進一步通過CCU 試驗發(fā)現(xiàn)在P62和Atg7 基因沉默后的TC-1 細胞中MO 在細胞內(nèi)的存活數(shù)升高，表明細胞自噬對MO 在細胞內(nèi)的增殖具有一定的抑制作用。MO 如何誘導(dǎo)宿主細胞自噬將是本實驗室后續(xù)開展的工作。本研究結(jié)果明確了MO 可誘導(dǎo)肺臟上皮細胞發(fā)生自噬并且該細胞的自噬對MO 的清除具有一定的作用，本研究為闡明MO的致病機制及為MO 感染疾病的防治提供參考依據(jù)。