羅 超，吳偉斌，林欣雨，祝春燕

（紹興文理學(xué)院1.元培學(xué)院，3.附屬醫(yī)院，浙江 紹興 312000；2.肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，廣東 肇慶 526020）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一類臨床高發(fā)病率、高死亡率的肺部炎癥性疾病，其發(fā)病與過度炎癥反應(yīng)、敗血癥、氣體交換受損、肺泡毛細血管屏障破壞和肺水腫等密切相關(guān)［1-2］。研究表明，ALI的發(fā)病機制主要為活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的積累以及過度的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，其分子機制可能與炎癥信號的激活有關(guān)，如絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶和NF-κB信號通路等［3-4］。肺微血管內(nèi)皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMEC）是肺氣血交換的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是肺部最早受到炎癥攻擊的效應(yīng)細胞［5］。炎癥刺激一方面增加PMEC細胞壁的通透性，引起肺部蛋白滲出及水腫；另一方面，炎癥損傷的血管內(nèi)皮細胞大量分泌腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-8和細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）等炎癥細胞因子，進一步攻擊肺組織并誘導(dǎo)大量中性粒細胞的聚集，導(dǎo)致肺組織的氧化損傷和炎癥反應(yīng)，促進肺損傷的發(fā)展［6-7］。

多聚（ADP-核糖）聚合酶-1〔poly（ADP-ribose）polymerase-1，PARP-1〕對炎癥反應(yīng)具有直接促進作用，參與NF-κB等多種炎癥信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控，促進多種炎癥因子的表達和釋放［8］，在腦膜炎、結(jié)腸炎、腎炎、關(guān)節(jié)炎和慢性阻塞性肺疾病等多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用［9］。米諾環(huán)素（minocycline）是一種半合成的第二代四環(huán)素類抗生素，臨床上被廣泛用于治療各種感染性及炎癥疾病，在各類支氣管肺炎、細菌性肺炎等治療中也有應(yīng)用。近年來，多項研究顯示，米諾環(huán)素具有明顯的PARP-1抑制作用，如米諾環(huán)素可通過抑制PARP-1而保護缺血再灌注心肌細胞的炎癥損傷［10-11］。本研究以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細胞為炎癥模型，研究其通過調(diào)控PARP-1通路對ALI發(fā)病過程中肺微血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷的抑制作用，并探討其抗炎作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

米諾環(huán)素，大連美侖生物技術(shù)有限公司。M131培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺和微血管細胞生長因子（microvascular growth supplement，MVGS），美國Gibco公司；LPS，美國Sigma公司；CCK-8檢測試劑盒和ROS檢測試劑盒，上海碧云天生物；TNF-α、IL-6、IL-8和ICAM-1 ELISA檢測試劑盒，深圳達科為生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光液，杭州弗德生物；兔抗人PARP-1、磷酸化P65（phosphoralated p65，p-P65）、磷酸化IκB激酶β（phosphorilated IκB kinase β，p-IKKβ）和磷 酸化抑制蛋白 κB（phosphorilated inhibitor of κB，p-IκBα）多克隆抗體購于美國Affinity Biosciences公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體，美國Jackson Immuno Research公司。生物倒置顯微鏡，日本Olympus公司；CO2細胞培養(yǎng)箱和多功能酶標儀，美國Thermo Scientific公司；電泳儀及轉(zhuǎn)移裝置，美國Bio-Rad公司；流式細胞儀，美國Beckman公司。

1.2 細胞和分組

人PMEC（HPMEC-ST1.6R）［12］，德國美因茲大學(xué)病理研究所，培養(yǎng)于含20%胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol·L-1和5% MVGS的M131培養(yǎng)基，置5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細胞生長至70%～80%融合度后進行傳代，4～6 d傳代1次。

據(jù)文獻和預(yù)實驗結(jié)果［13-14］，將實驗細胞分為4組，即細胞對照組、LPS組（LPS 10 mg·L-1作用24 h），LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組（米諾環(huán)素和LPS 10 mg·L-1同時加入，作用24 h）。

1.3 CCK-8法檢測細胞存活率

調(diào)整細胞密度為1×108L-1，加入96孔板內(nèi)，每孔100 μL，置 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后按1.2分組加藥處理；作用24 h后，每孔加入CCK-8試劑20 μL，置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育；4 h后用酶標儀于450 nm測定吸光度（A450nm）值，計算細胞存活率。存活率（%）=（加藥組A450nm-空白A450nm）/（細胞對照組A450nm-空白A450nm）×100%。

1.4 ELISA檢測炎癥因子水平

調(diào)整細胞密度為1×108L-1，加入96孔板內(nèi)，每孔100 μL，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按1.2分組加藥處理，作用24 h，收集細胞上清液，采用ELISA測定細胞培養(yǎng)液中TNE-α，IL-6，IL-8和ICAM-1水平。按試劑盒說明操作，酶標儀測定A450nm值，根據(jù)標準曲線計算炎癥因子濃度。

1.5 流式細胞儀檢測ROS水平

每孔1×106細胞接種6孔板，按1.2分組加藥處理24 h后，細胞收集后懸浮于終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA中，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，孵育完畢后用不含血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，流式細胞儀檢測，以DCF熒光強度反映細胞內(nèi)ROS水平。

1.6 Western印跡法檢測PARP-1，p-P65，p-IKK β和p-I κB α蛋白表達水平

每孔1×106細胞接種12孔板，按1.2分組加藥處理24 h后，收集各組細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清，以BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，然后進行SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗人PARP-1，p-P65，p-IKKβ和p-IκBα多抗（1∶1000）4℃孵育過夜；洗膜后，室溫下加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶5000）孵育1 h，最后通過ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像，利用Image J軟件進行蛋白相對積分吸光度分析，以β肌動蛋白為內(nèi)參，以目標蛋白與β肌動蛋白積分吸光度值比值表示PARP-1，p-P65，p-IKKβ和p-IκBα蛋白相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 米諾環(huán)素對LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細胞存活率的影響

CCK-8實驗結(jié)果（圖1）顯示，與細胞對照組相比，LPS組細胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與LPS組相比，LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組細胞存活率顯著升高（P＜0.01）。

2.2 米諾環(huán)素對LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細胞TNE- α，IL-6，IL-8和ICAM-1釋放的影響

如圖2所示，LPS 10 mg·L-1損傷使PMEC出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，與細胞對照組相比，細胞培養(yǎng)液中TNE-α，IL-6，IL-8和ICAM-1含量顯著升高（P＜0.01）。與LPS組相比，LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組細胞培養(yǎng)液中TNE-α，IL-6，IL-8和ICAM-1含量顯著降低（P＜0.01），提示米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1對LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細胞炎癥損傷有保護作用。

Fig.1 Effect of minocycIine on ceII viabiIity of human puImonary microvascuIar endotheIiaI ceIIs（hPMECs）.Cells were protected by minocycline 10 and 25 μmol·L-1and treated with LPS 10 mg·L-1for 24 h.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with LPS group.

Fig.2 Effect of minocycIine on tumor necrosis factorα（TNF- α），interIeukin-6（IL-6），IL-8 and interceIIuIar ceII adhesion moIecuIe-1（ICAM-1）reIease in hPMECs induced by LPS.See Fig.1 for cell treatment.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with LPS group.

2.3 米諾環(huán)素對LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細胞ROS生成的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果顯示（圖3），與細胞對照組相比，LPS刺激誘導(dǎo)PMEC ROS表達升高（P＜0.01）。與LPS組相比，LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組細胞ROS水平顯著降低（P＜0.05）。

2.4 米諾環(huán)素對LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細胞PARP-1，p-P65，p-IKK β和p-I κB α蛋白表達的影響

Western印跡法結(jié)果顯示（圖4，圖5），與細胞對照組相比，LPS損傷能顯著增加PARP-1蛋白表達（P＜0.01），并使NF-κB通路磷酸化激活，p-IKKβ，p-IκBα和p-P65蛋白表達升高（P＜0.01）。與LPS組相比，LPS+米諾環(huán)素10和25 μmol·L-1組能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細胞PARP-1蛋白表達和NF-κB通路激活（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of minocycIine on reactive oxygen species（ROS）IeveI in hPMECs induced by LPS.See Fig.1 for cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

Fig.4 Effect of minocycIine on protein expression of poIy（ADP-ribose）poIymerase-1（PARP-1）in hPMECs induced by LPS detected by Western bIotting.See Fig.1 for cell treatment.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with LPS group.

Fig.5 Effect of minocycIine on protein expressions of phosphoriIated IκB kinase β （p-IKK β），phosphoriIated inhibitor of kappa B （p-I κB α），and phosphoriIated P65（p-P65）in hPMECs induced by LPS detected by Western bIotting.See Fig.1 for cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with LPS group.

3 討論

肺部過度炎癥反應(yīng)是ALI的主要病理機制，PMEC是肺氣血交換的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是肺部最早受到炎癥攻擊的效應(yīng)細胞，失控的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致PMEC損傷凋亡，通透性增加，繼而破壞肺泡-毛細血管屏障，導(dǎo)致大量富含蛋白質(zhì)的液體滲出而引起肺水腫。此外，肺泡-毛細血管屏障的破壞是各類炎癥細胞向肺組織移行、富集的基礎(chǔ)［15-17］?？梢?，控制PMEC炎癥損傷，抑制其凋亡和通透性增加，可有效緩解ALI肺水腫的發(fā)生和發(fā)展，并可抑制炎癥細胞向肺組織富集。

炎癥因子是炎癥發(fā)展過程中的重要介質(zhì)，受到炎癥損傷PMEC可分泌大量促炎因子（TNF-α和IL-6等）、趨化因子（IL-8等）和黏附分子（ICAM-1等）。TNF-α和IL-6都是重要的早期炎癥損傷因子，TNF-α是炎癥的重要啟動子，是ALI最先出現(xiàn)的細胞因子，可誘導(dǎo)IL-6和IL-8等炎癥因子的分泌，促進炎癥反應(yīng)；IL-6是最強內(nèi)源性炎癥因子，在ALI中，IL-6可直接損傷內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致血管通透性增加［5，18］。IL-8和ICAM-1對ALI發(fā)展過程中中性粒細胞的激活及向肺組織聚集具有重要的影響，中性粒細胞的激活、黏附、趨化、遷移和脫顆粒均可導(dǎo)致相應(yīng)的肺泡功能損傷，并進一步通過釋放多種介質(zhì)加重肺損傷［19-20］。本研究結(jié)果顯示，米諾環(huán)素可抑制LPS誘導(dǎo)的PMEC TNF-α，IL-6，IL-8和ICAM-1等炎癥因子的釋放，緩解細胞炎癥損傷，抑制細胞凋亡，可有效緩解ALI發(fā)病過程中的進一步炎癥級聯(lián)擴大反應(yīng)，中性粒細胞聚集和肺組織損傷等，對ALI的病情發(fā)展起到延緩和治療作用。許多研究表明，ROS對ALI的發(fā)病機制具有重要的影響，炎癥過程中ROS的增加在ALI全身性炎癥反應(yīng)的發(fā)展和局部表現(xiàn)中均發(fā)揮了重要作用［21-22］。血管內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激與其炎癥損傷和細胞凋亡密切相關(guān)，過度表達的ROS一方面破壞了體內(nèi)氧化與抗氧化的平衡，造成細胞的損傷與凋亡［23］；另一方面，細胞的氧化應(yīng)激又是PARP-1活化的關(guān)鍵因素，繼而進一步激活一系列的炎癥反應(yīng)［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素對LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細胞ROS表達具有顯著的抑制作用，可通過對ROS表達的調(diào)控繼而抑制ALI過程中PMEC的氧化應(yīng)激損傷和PARP-1活化。

PARP-1與許多調(diào)控炎癥基因表達的轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)，如 NF-κB、NF-AT、活化蛋白-1、沉默信息調(diào)節(jié)因子1和核呼吸因子-1等［8，25］。NF-κB是第一個被闡述與PARP-1調(diào)控炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB激活也是PARP-1調(diào)控炎癥的中心途徑，活化的PARP-1可激活I(lǐng)KKβ，使其磷酸化生成p-IKKβ，活化的IKK-β 可繼而磷酸化 IκB，使其從NF-κB三聚體（P65/P50/IκBα）上脫落，使得NF-κB由抑制狀態(tài)被激活，NF-κB的P65亞基磷酸化（p-P65）并進入細胞核與DNA上特異性位點結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫、炎癥等多種靶基因的表達［26-29］。Western印跡結(jié)果表明，米諾環(huán)素可通過抑制LPS誘導(dǎo)的PMEC PARP-1表達，繼而抑制IKKβ和IκBα的磷酸化激活，最終抑制了P65的磷酸化激活，從而下調(diào)ALI細胞NF-κB信號通路，抑制細胞炎癥損傷和炎癥因子的表達。

綜上所述，米諾環(huán)素可通過抑制PARP-1的表達，從而抑制IKKβ的磷酸化激活，繼而導(dǎo)致IκB不能磷酸化活化，無法從NF-κB三聚體上脫落，最終抑制NF-κB的活化，從而抑制LPS誘導(dǎo)的PMEC的一系列炎癥反應(yīng)，有望成為ALI等肺部炎癥性疾病治療的新選擇，其抗炎作用機制及對ALI動物模型的治療作用待深入研究。