程 曦,劉麗虹,劉進(jìn)峰,高亞琪
(1.河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司 河北省阿維菌素生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 石家莊 051530;2.石家莊市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,河北 石家莊 050000)
阿維菌素是阿維鏈霉菌在含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和微量元素的培養(yǎng)基中通氣攪拌、深層發(fā)酵產(chǎn)生的具有十六元大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的多組分生物殺蟲(chóng)殺螨劑[1]。在其發(fā)酵液含有的 8 種組分中,B1a 組分的殺蟲(chóng)效果最佳,是商品化阿維菌素的主要組分[2]。業(yè)內(nèi)將B1a含量作為衡量發(fā)酵效價(jià)高低的指標(biāo)。自阿維菌素被發(fā)現(xiàn)以來(lái),通過(guò)菌種改良、配方及控制工藝的優(yōu)化,生產(chǎn)水平大幅提高,不過(guò)這些措施均以提高發(fā)酵效價(jià)為目標(biāo),關(guān)于提高阿維菌素放罐體積的報(bào)道卻很少。阿維鏈霉菌作為一種絲狀菌,其發(fā)酵液總體表現(xiàn)為非牛頓流體性質(zhì),并滿(mǎn)足剪切稀化特征[3]。在其發(fā)酵過(guò)程中常有大量泡沫產(chǎn)生,泡沫的存在影響了放罐體積的提高。統(tǒng)計(jì)顯示,阿維菌素發(fā)酵放罐體積約為發(fā)酵罐容積的70%,而同為絲狀菌的慶大霉素、恩拉霉素發(fā)酵放罐體積為發(fā)酵罐容積的75%~80%。若采用半連續(xù)發(fā)酵提高放罐體積,不失為另一種提高阿維菌素發(fā)酵產(chǎn)量的途徑。
半連續(xù)發(fā)酵,我國(guó)工業(yè)界通俗地稱(chēng)其為發(fā)酵帶放工藝[4-5],是指在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,放出部分含有目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵液,然后補(bǔ)入相同體積的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵的方法[6]。在青霉素、頭孢菌素工業(yè)生產(chǎn)中已成功應(yīng)用[7-8];但在其它的以次級(jí)代謝產(chǎn)物為目標(biāo)的發(fā)酵帶放工藝中應(yīng)用較少。除了操作復(fù)雜、增加工作量及雜菌污染的機(jī)會(huì)外,更重要的原因是,補(bǔ)入新鮮培養(yǎng)基會(huì)稀釋生物量;而菌絲的生長(zhǎng)有個(gè)過(guò)程,可能對(duì)生產(chǎn)效率有一定程度的影響。阿維鏈霉菌發(fā)酵過(guò)程中,液位隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升,為防止“逃液”常需倒出部分發(fā)酵液至其它容器中繼續(xù)培養(yǎng)或隨其它發(fā)酵罐帶放[9],在這一過(guò)程中,為提高設(shè)備利用效率,需將幾種不同時(shí)期的部分發(fā)酵液倒入一臺(tái)小型容器中混合培養(yǎng)。在對(duì)這一現(xiàn)象的長(zhǎng)期觀察中,發(fā)現(xiàn)效價(jià)的增長(zhǎng)并不因幾種不同時(shí)期、不同效價(jià)發(fā)酵液混合而受到影響。以此類(lèi)推,如果發(fā)酵罐帶放后補(bǔ)入適當(dāng)時(shí)期發(fā)酵液替代傳統(tǒng)的新鮮培養(yǎng)基,既可避免生物量的波動(dòng),又有利于效價(jià)的持續(xù)增長(zhǎng)。因此,有必要研究補(bǔ)入不同的基質(zhì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響。
鑒于此,作者在100 L、50 L發(fā)酵罐中研究阿維鏈霉菌發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基和補(bǔ)入發(fā)酵液對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響,為阿維菌素工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)施半連續(xù)發(fā)酵工藝提供理論和數(shù)據(jù)支持。
菌種,阿維鏈霉菌AVS-32,河北省阿維菌素生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
20 L種子罐、50 L發(fā)酵罐、100 L發(fā)酵罐,配備有補(bǔ)料、DO和pH值等自動(dòng)控制系統(tǒng)和具有數(shù)據(jù)采集及分析功能的軟件系統(tǒng),鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司。
1.2.1 種子罐
培養(yǎng)基:淀粉20 g·L-1,黃豆餅粉5 g·L-1,酵母粉5 g·L-1,花生粉5 g·L-1,氯化鈷10 mg·L-1;消后體積為13 L,pH值7.2~7.6。
培養(yǎng)條件:溫度28~29 ℃,空氣流速1.0~1.2 L·L-1·min-1,攪拌轉(zhuǎn)速200~600 r·min-1,培養(yǎng)時(shí)間40~50 h。
1.2.2 發(fā)酵罐
培養(yǎng)基:淀粉170 g·L-1,黃豆餅粉27 g·L-1,酵母粉10 g·L-1,輕質(zhì)碳酸鈣1.5 g·L-1,硫酸銨0.3 g·L-1,淀粉酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%。接種量8%~10%。
培養(yǎng)條件:溫度 27~28 ℃,空氣流速0.8~1.2 L·L-1·min-1,攪拌轉(zhuǎn)速400~600 r·min-1,發(fā)酵周期320~340 h 。
補(bǔ)料培養(yǎng)基同發(fā)酵罐培養(yǎng)基。
1.3.1 生物量測(cè)定
準(zhǔn)確量取50 mL發(fā)酵液置于250 mL三角瓶中,加入適量助濾劑,加熱至90~100 ℃, 抽濾,適量水洗,105 ℃下烘干2 h 至恒重(W2),按式(1)計(jì)算生物量(g·L-1):
生物量=(W2-W0-W1)×20
(1)
式中:W0為濾布質(zhì)量,g;W1為助濾劑質(zhì)量,g;20為換算系數(shù)。
1.3.2 B1a效價(jià)測(cè)定
準(zhǔn)確量取2 mL發(fā)酵液置于50 mL容量瓶中,加入適量甲醇,超聲浸提15 min,定容,過(guò)濾,進(jìn)行HPLC分析。色譜柱C18(250 mm×4.6 mm),流動(dòng)相 CH3OH-H2O(90∶10,體積比),流速 1.0 mL·min-1,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm,進(jìn)樣量20 μL。記錄峰面積,采用外標(biāo)法按式(2)計(jì)算B1a 效價(jià)(g·L-1):
(2)
了解阿維菌素發(fā)酵過(guò)程中效價(jià)和生物量的變化趨勢(shì),有助于確定不同基質(zhì)補(bǔ)入工藝的優(yōu)劣。50 L 發(fā)酵罐 B1a 效價(jià)、生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖 1。
圖1 B1a效價(jià)和生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.1 Change trend of B1a titer and biomass with culture time
由圖1可知,發(fā)酵前40 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,菌絲快速生長(zhǎng),36 h時(shí)生物量相對(duì)飽和,生物量達(dá)45.6 g·L-1;此后,由于料液的蒸發(fā),發(fā)酵液體積減小,生物量仍有所增加,但增速放緩。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行約50 h時(shí),開(kāi)始阿維菌素的生物合成,合成速率逐漸加快,100 h后B1a效價(jià)呈線性增長(zhǎng)。50 L規(guī)模發(fā)酵過(guò)程顯示,阿維菌素是阿維鏈霉菌在菌絲生長(zhǎng)繁殖到一定階段后開(kāi)始合成的,為典型的次級(jí)代謝產(chǎn)物,其發(fā)酵過(guò)程為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型。
補(bǔ)料一般是指發(fā)酵進(jìn)行到產(chǎn)物生成階段,因合成產(chǎn)物或維持細(xì)胞代謝活動(dòng)的需要,選擇性地補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使之向著產(chǎn)物積累的方向發(fā)展[10]。將100 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)至237 h的發(fā)酵液等分至2臺(tái)50 L發(fā)酵罐中培養(yǎng),并分別補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)(V補(bǔ)/V混)為15%的補(bǔ)料培養(yǎng)基和培養(yǎng)67 h的發(fā)酵液,比較生物量和B1a效價(jià)的變化情況,結(jié)果見(jiàn)圖2。
由圖2a可知,補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基后由于料液的稀釋,生物量由50.8 g·L-1下降至46.7 g·L-1,此后較快增長(zhǎng);329 h時(shí)生物量達(dá)到52.7 g·L-1,與補(bǔ)入發(fā)酵液的生物量接近。這是由于,補(bǔ)料培養(yǎng)基為含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和微量元素的復(fù)合培養(yǎng)基,造成菌絲一定程度的二次生長(zhǎng)繁殖;而補(bǔ)入發(fā)酵液后,生物量增加幅度相對(duì)較小。
圖2 補(bǔ)入不同基質(zhì)對(duì)生物量(a)和B1a效價(jià)(b)的影響Fig.2 Effects of adding different matrixes on biomass(a) and B1a titer(b)
由圖2b可知,補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基和發(fā)酵液后由于稀釋作用,239 h之前B1a效價(jià)均大幅下降,此后B1a效價(jià)呈線性增長(zhǎng)(圖3),并且補(bǔ)入發(fā)酵液(斜率K=0.0375)比補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基(斜率K=0.0346)效價(jià)增長(zhǎng)快。需要特別注意的是,阿維菌素發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究表明,阿維菌素是阿維鏈霉菌生長(zhǎng)繁殖到一定階段才開(kāi)始合成的。補(bǔ)料后菌絲的二次生長(zhǎng)繁殖并未造成效價(jià)增長(zhǎng)停滯,而且多次試驗(yàn)均重復(fù)了這一現(xiàn)象??赡芘c菌絲已經(jīng)具有了次級(jí)代謝能力有關(guān);其次,補(bǔ)入的補(bǔ)料培養(yǎng)基對(duì)某些有害代謝產(chǎn)物的稀釋改善了合成環(huán)境,有助于加速阿維菌素的合成,表現(xiàn)出菌絲生長(zhǎng)繁殖與產(chǎn)物合成同時(shí)進(jìn)行的混合型發(fā)酵特征。由此,可以根據(jù)設(shè)備配置及實(shí)際生產(chǎn)情況,在某些特定情況下的工業(yè)化生產(chǎn),帶放后可適時(shí)選擇補(bǔ)入復(fù)合培養(yǎng)基,最大限度地提高生產(chǎn)效率。孫文敬等[6]也研究表明,補(bǔ)料及放料策略的優(yōu)化是提高產(chǎn)量的關(guān)鍵手段。
圖3 B1a效價(jià)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的回歸曲線Fig.3 Regression curves of B1a titer and culture time
為了既利用菌絲的次級(jí)代謝能力,又能提高發(fā)酵液培養(yǎng)設(shè)備的利用效率,選擇補(bǔ)入培養(yǎng) 50 h 后的發(fā)酵液。將100 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)至240 h的發(fā)酵液等分至 A、B 2臺(tái) 50 L 發(fā)酵罐后,分別補(bǔ)入培養(yǎng)58 h發(fā)酵液 5 L(體積分?jǐn)?shù) 15%)和 2.5 L(體積分?jǐn)?shù) 8%),繼續(xù)培養(yǎng)至336 h,觀察B1a效價(jià)變化情況,結(jié)果見(jiàn)表 1。
由表1可知,由于補(bǔ)入低含量發(fā)酵液的稀釋作用,242 h B1a效價(jià)較240 h均有所下降,而后又快速增長(zhǎng)。補(bǔ)入發(fā)酵液前后,B1a效價(jià)隨培養(yǎng)時(shí)間變化的回歸曲線見(jiàn)圖 4。
表1 B1a效價(jià)隨培養(yǎng)時(shí)間的變化
圖4 補(bǔ)入發(fā)酵液前(a)、后(b)B1a效價(jià)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間的回歸曲線Fig.4 Regression curves of B1a titer and culture time before(a) and after(b) adding fermentation broth
由圖4可知,補(bǔ)入發(fā)酵液后回歸方程的斜率(罐A0.036 4、罐B 0.029 8)大于補(bǔ)入發(fā)酵液前(0.026 6),且補(bǔ)入發(fā)酵液多的A罐大于B罐;即補(bǔ)入發(fā)酵液后效價(jià)增速更快,且補(bǔ)入的發(fā)酵液越多,效價(jià)增長(zhǎng)就越多,后續(xù)試驗(yàn)也重復(fù)了這一現(xiàn)象。這是由于補(bǔ)入發(fā)酵液,除了補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)外,還減輕了代謝產(chǎn)物的抑制,保持了菌體活力的穩(wěn)定,有利于效價(jià)的持續(xù)快速增長(zhǎng)。
由圖4b可知,補(bǔ)入低含量發(fā)酵液越多,效價(jià)增長(zhǎng)就越多;但同時(shí)對(duì)補(bǔ)發(fā)酵液前效價(jià)的稀釋作用也越明顯。為準(zhǔn)確表達(dá)補(bǔ)入發(fā)酵液后效價(jià)的相對(duì)增長(zhǎng)情況,為工業(yè)化生產(chǎn)確定放罐時(shí)間提供理論依據(jù),將試驗(yàn)效價(jià)與回歸效價(jià)進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 試驗(yàn)效價(jià)與回歸效價(jià)對(duì)比
由表2可知,盡管補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)15%的發(fā)酵液(A罐),效價(jià)增速更快,但由于稀釋作用更明顯,288 h之前試驗(yàn)效價(jià)均低于回歸效價(jià),即在此之前不宜放罐;當(dāng)培養(yǎng)至312 h時(shí)試驗(yàn)效價(jià)較回歸效價(jià)高0.018 g·L-1,即宜選擇在此之后(補(bǔ)入發(fā)酵液72 h后)放罐;補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)8%的發(fā)酵液(B罐),效價(jià)增速相對(duì)較慢,但由于稀釋作用相對(duì)不明顯,288 h時(shí)試驗(yàn)效價(jià)較回歸效價(jià)高0.197 g·L-1,即宜選擇在此之后(補(bǔ)入發(fā)酵液48 h后)放罐。
工業(yè)化生產(chǎn)以最大限度的提高產(chǎn)能、降低成本為終極目標(biāo)。如何更高效地使用有限的設(shè)備是不容忽視的問(wèn)題。通常的發(fā)酵設(shè)備配置,除了大容積發(fā)酵罐,還有對(duì)應(yīng)的種子罐及其它小容積發(fā)酵罐。三級(jí)發(fā)酵工藝可以縮短發(fā)酵周期增加放罐批次,進(jìn)而提高大容積發(fā)酵罐使用效率;提高小容積發(fā)酵罐的使用效率也是提高發(fā)酵產(chǎn)能的途徑之一。帶放工藝由來(lái)已久,但用于次級(jí)代謝發(fā)酵工藝較少,其中,困擾生產(chǎn)人員的主要問(wèn)題是,帶放盡管增加了當(dāng)時(shí)的放罐體積,但隨之而來(lái)的是帶放罐批體積減小的部分怎么補(bǔ)充。首先是補(bǔ)水,在慶大霉素的產(chǎn)物合成與菌體生長(zhǎng)同時(shí)進(jìn)行的混合型高密度發(fā)酵中有所應(yīng)用;但阿維菌素發(fā)酵液總體表現(xiàn)為非牛頓流體性質(zhì),其表觀黏度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,屬于擬塑性流體[11],后期補(bǔ)水顯然不利于效價(jià)的增長(zhǎng)。其次是補(bǔ)料,單純的補(bǔ)淀粉,意味著碳氮比失衡及總生物量減少,產(chǎn)品得率不高;作者就此研究了在發(fā)酵中后期補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基并與補(bǔ)入發(fā)酵液對(duì)比,結(jié)果顯示補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基劣于補(bǔ)入發(fā)酵液。再次是補(bǔ)入發(fā)酵液,補(bǔ)入中后期發(fā)酵液意味著補(bǔ)入了一定數(shù)量的阿維菌素,對(duì)效價(jià)的稀釋作用小但也失去了帶放的意義;補(bǔ)入的發(fā)酵液培養(yǎng)時(shí)間越短,意味著小型發(fā)酵設(shè)備的利用效率越高,但還應(yīng)考慮利用菌體的次級(jí)代謝能力,所以最優(yōu)的選擇是補(bǔ)入培養(yǎng)50 h后的發(fā)酵液。就此研究結(jié)果,嘗試在單罐容積120 m3發(fā)酵罐上應(yīng)用;將30 m3或12 m3容器作為發(fā)酵液培養(yǎng)罐,采用半連續(xù)發(fā)酵工藝后發(fā)酵單罐產(chǎn)量又上新臺(tái)階。
通過(guò)在100 L、50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行平行試驗(yàn),在發(fā)酵中后期補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)15%的培養(yǎng)50 h后的發(fā)酵液優(yōu)于補(bǔ)入補(bǔ)料培養(yǎng)基,即發(fā)酵罐帶放后可選擇補(bǔ)入培養(yǎng)50 h后的發(fā)酵液替代其它基質(zhì)。補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)15%的發(fā)酵液較補(bǔ)入體積分?jǐn)?shù)8%的發(fā)酵液效價(jià)增長(zhǎng)得更快,但稀釋作用也更明顯。本研究為阿維菌素工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)施半連續(xù)發(fā)酵,高效利用小容積發(fā)酵罐提供了新思路、新方法。其本質(zhì)等效于將小容積發(fā)酵罐的發(fā)酵周期由330 h縮短至50~100 h,即大幅度縮短了發(fā)酵周期。半連續(xù)發(fā)酵是一種重要的生化培養(yǎng)方式,該研究對(duì)其它以次級(jí)代謝產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物的半連續(xù)發(fā)酵的實(shí)施具有一定的借鑒價(jià)值。