李 寧，李麗紅，米文強(qiáng)，張雪霞，任風(fēng)芝*，劉建芬

(1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心河北省工業(yè)微生物藥物代謝工程技術(shù)中心，河北 石家莊 050015；2.華北制藥華坤河北生物技術(shù)有限公司，河北 石家莊 050000)

肝素鈉是由不同分子量糖鏈的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽組成的混合物[1]，是目前抗凝血和抗血栓的首選藥物[2]，還具有抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎癥、抗腫瘤及抗病毒等多種生物學(xué)功能[3]。肝素鈉可以從豬、牛的小腸黏膜和牛肺等組織中提取，但由于瘋牛病的出現(xiàn)，使牛源肝素鈉的應(yīng)用受到了限制[4]。不同動(dòng)物來(lái)源的肝素鈉具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，其不良反應(yīng)也不同，牛源肝素鈉引起血小板減少的不良反應(yīng)約是豬源肝素鈉的2倍[5]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2020年版中明確規(guī)定，肝素鈉應(yīng)從檢疫合格的豬腸黏膜中提取，并對(duì)肝素鈉的動(dòng)物來(lái)源進(jìn)行種屬鑒別[1]。因此，開發(fā)一種快速檢測(cè)粗品肝素鈉中反芻基因及豬基因的方法，對(duì)于判定肝素鈉的動(dòng)物來(lái)源尤為重要。作者采用細(xì)胞裂解和蛋白酶K消化技術(shù)，結(jié)合DNA制備柱選擇性吸附DNA的方法提取粗品肝素鈉中的動(dòng)物DNA，將DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液、粗品肝素鈉DNA提取液分別與相應(yīng)的PCR試劑混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定粗品肝素鈉DNA提取液中反芻基因及豬基因濃度。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

粗品肝素鈉(豬源)，華北制藥華坤河北生物技術(shù)有限公司；粗品肝素鈉(羊源)，廣東賽格生物技術(shù)有限公司。

基因組DNA小量試劑盒(DNA制備柱、核糖核酸酶A、裂解液、蛋白酶K、蛋白去除液、洗滌液、去鹽液、洗脫液)，康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；反芻基因熒光PCR檢測(cè)試劑盒(反芻基因PCR試劑預(yù)混劑、雙蒸餾水、TE緩沖液、反芻基因組DNA對(duì)照品)、豬基因熒光PCR檢測(cè)試劑盒(豬基因PCR試劑預(yù)混劑、雙蒸餾水、TE緩沖液、豬基因組DNA對(duì)照品)、?；蚪MDNA對(duì)照品、綿羊基因組DNA對(duì)照品、山羊基因組DNA對(duì)照品，廣東賽格生物技術(shù)有限公司。

ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；XW-80A型渦旋混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；TGL-20M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；水浴鍋，泰特實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 粗品肝素鈉DNA提取液的制備

將1.0 g粗品肝素鈉用水溶解至10 mL，10 000 r·min-1離心5 min；取上清液100 μL于離心管中，加入250 μL雙蒸餾水、0.9 μL 核糖核酸酶A，渦旋混合30 s；然后加入150 μL裂解液，渦旋混合30 s，再加入20 μL 蛋白酶 K，渦旋混合30 s， 56 ℃水浴30 min，得消化液；向消化液中加入350 μL 蛋白去除液，輕輕搖勻，12 000 r·min-1離心10 min；上清液轉(zhuǎn)移至DNA制備柱中，靜置5 min后，12 000 r·min-1離心1 min；棄去濾液，DNA制備柱用500 μL洗滌液離心洗滌后，用去鹽液離心洗滌2次，每次700 μL；最后在DNA制備柱中加入150 μL 65 ℃預(yù)熱的洗脫液，靜置2 min，離心，收集洗脫液至潔凈的滅菌離心管中，得粗品肝素鈉DNA提取液，即供試溶液。

1.3 DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 反芻基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取10 ng·μL-1反芻基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用TE緩沖液稀釋至濃度分別為1 000 pg·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、0.1 pg·μL-1、0.01 pg·μL-1的反芻基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 豬基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取10 ng·μL-1豬基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用TE緩沖液稀釋至濃度分別為10 000 pg·μL-1、1 000 pg·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1、0.1 pg·μL-1的豬基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)

1.4.1 反應(yīng)液的配制

按每孔PCR試劑預(yù)混劑11.5 μL、雙蒸餾水6.5 μL的比例分別混合稀釋反芻基因PCR試劑預(yù)混劑及豬基因PCR試劑預(yù)混劑；將粗品肝素鈉DNA提取液與DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液按2 μL/孔分別添加至對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)孔中，混合均勻。

1.4.2 測(cè)試程序

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 120 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。計(jì)算溶液中反芻基因及豬基因濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑的專屬性

在反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑中分別加入?；蚪MDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液、綿羊基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液、山羊基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液、豬基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液、雙蒸餾水(空白對(duì)照)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，考察反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑的專屬性，結(jié)果見表1。

表1 反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑的專屬性

從表1可知，反芻基因PCR試劑對(duì)?；蚪MDNA、綿羊基因組DNA、山羊基因組DNA可正常擴(kuò)增，結(jié)果均為陽(yáng)性；對(duì)豬基因組DNA、空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。豬基因PCR試劑對(duì)豬基因組DNA正常擴(kuò)增，結(jié)果為陽(yáng)性；對(duì)?；蚪MDNA、綿羊基因組DNA、山羊基因組DNA與空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。表明反芻基因PCR試劑和豬基因PCR試劑的專屬性滿足檢測(cè)要求。

2.2 線性范圍

2.2.1 反芻基因濃度的線性范圍

以濃度為0.01～1 000 pg·μL-1的反芻基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以雙蒸餾水為空白對(duì)照。以反芻DNA濃度的對(duì)數(shù)(logc)為橫坐標(biāo)、擴(kuò)增CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，擬合得線性回歸方程為：CT=-3.46logc+25.95，R2=0.9990，擴(kuò)增效率=94.54%。表明反芻基因濃度在0.01～1 000 pg·μL-1范圍內(nèi)與擴(kuò)增CT值線性關(guān)系良好。

圖1 反芻基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ruminant gene

2.2.2 豬基因濃度的線性范圍

以濃度為0.1～10 000 pg·μL-1的豬基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以雙蒸餾水為空白對(duì)照。以豬DNA濃度的對(duì)數(shù)(logc)為橫坐標(biāo)、擴(kuò)增CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，擬合得線性回歸方程為CT=-3.18logc+32.63，R2=0.9952，擴(kuò)增效率=106.11%。表明豬基因濃度在0.1～10 000 pg·μL-1范圍內(nèi)與擴(kuò)增CT值線性關(guān)系良好。

2.3 準(zhǔn)確度

2.3.1 反芻基因檢測(cè)準(zhǔn)確度

分別將濃度為10 000 pg·μL-1、1 000 pg·μL-1、100 pg·μL-1、10 pg·μL-1、1 pg·μL-1的?；蚪MDNA標(biāo)準(zhǔn)溶液與粗品肝素鈉DNA提取液按1∶9的比例混合，作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見表2。

由表2可知，反芻基因的平均回收率為107.66%，RSD為7.11%，表明該方法測(cè)定反芻基因濃度的準(zhǔn)確度滿足檢測(cè)要求。

圖2 豬基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of porcine gene

表2 反芻基因檢測(cè)準(zhǔn)確度

2.3.2 豬基因檢測(cè)準(zhǔn)確度

分別將濃度為10 000 pg·μL-1、8 000 pg·μL-1、6 000 pg·μL-1、4 000 pg·μL-1、2 000 pg·μL-1的豬基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液與粗品肝素鈉DNA提取液按1∶9的比例混合，作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見表3。

表3 豬基因檢測(cè)準(zhǔn)確度

由表3可知，豬基因的平均回收率為105.92%，RSD為7.77%,明該方法測(cè)定豬基因濃度的準(zhǔn)確度滿足檢測(cè)要求。

2.4 精密度

取1批豬源粗品肝素鈉與1批羊源粗品肝素鈉等比例混合均勻，由 2 名實(shí)驗(yàn)人員在不同時(shí)間分別制備供試溶液6份，測(cè)定反芻基因與豬基因濃度，結(jié)果見表4。

由表4可知，反芻基因和豬基因濃度的RSD分別為7.01%、5.60%，表明該方法的精密度滿足檢測(cè)要求。

表4 檢測(cè)精密度

2.5 穩(wěn)定性

取1批豬源粗品肝素鈉與1批羊源粗品肝素鈉等比例混合均勻，制備供試溶液，將DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試溶液于(4±2) ℃分別放置0 h、12 h、24 h、36 h、48 h，測(cè)定反芻基因與豬基因濃度，結(jié)果見表5。

表5 供試溶液的穩(wěn)定性

由表5可知，反芻基因和豬基因濃度的RSD分別為3.16%、4.62%，表明DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液于(4±2) ℃放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 樣品測(cè)定

對(duì)3批粗品肝素鈉進(jìn)行檢測(cè)，批號(hào)MHC190601、MHC190602、MHC190603的樣品中反芻基因濃度分別為3.02×10-2pg·μL-1、3.21×10-2pg·μL-1、1.64×10-2pg·μL-1，豬基因濃度分別為604.81 pg·μL-1、1 063.24 pg·μL-1、886.60 pg·μL-1。

3 結(jié)論

采用細(xì)胞裂解和蛋白酶K消化技術(shù)，結(jié)合DNA制備膜選擇性吸附DNA的方法，可同時(shí)處理多個(gè)樣品，快速提取粗品肝素鈉中的動(dòng)物DNA。將DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與含有針對(duì)豬或反芻動(dòng)物特有基因序列設(shè)計(jì)的探針、引物的PCR試劑混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反芻基因濃度在0.01～1 000 pg·μL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，豬基因濃度在0.1～10 000 pg·μL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該方法具有良好的專屬性、準(zhǔn)確度、精密度，適用于粗品肝素鈉動(dòng)物來(lái)源的種屬鑒別。