易華，郭玉榮，蘇俊芳，吳紹峰，李雪，杜標(biāo)炎

（1廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州；2柳州市中醫(yī)院，廣西 柳州）

0 引言

前期系列研究證實，六味地黃丸含藥血清可以增加對惡性黑色素瘤B16細胞自殺基因系統(tǒng)的作用效果[1,2]，其機制與縫隙連接機制有關(guān)[3-5]。在實驗研究過程中，課題組發(fā)現(xiàn)對照組血清也能夠提高Cx26的表達。這到底是灌胃刺激還是鼠血清本身起到的作用？該作用能否影響B(tài)16細胞株HSV-tk/GCV自殺系統(tǒng)的治療效果？本研究通過選用不同途徑制備的三種血清，觀察它們對HSV-tk/GCV自殺系統(tǒng)的治療效果及縫隙連接蛋白Cx26、Cx43表達的影響。

1 材料

1.1 細胞

小鼠惡性黑色素瘤細胞株B16從中山大學(xué)動物中心細胞庫購入，B16/tk為本實驗室進行構(gòu)建保存。

1.2 試劑與耗材

細胞培養(yǎng)用RPMI-1640粉和0.25%含EDTA胰酶的生產(chǎn)廠商為Gibco公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒、脫脂奶粉分別來自于上海申能博采生物科技有限公司、內(nèi)蒙古伊利股份有限公司；新生牛血清來自于奧地利PAA公司；蛋白marker（cat No.SM0431,Lot No.00023933）來自于Fermentas公司；青、鏈霉素合劑的生產(chǎn)廠商是杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；異丙醇的生產(chǎn)企業(yè)為廣東新寧化工廠；過硫酸銨（AP）、二甲基亞砜（DMSO）、甘氨酸、丙烯酰胺、SDS、Tris、β-巰基乙醇、PMSF由Sigma公司生產(chǎn)；抗體稀釋液、5% BSA、一抗兔抗鼠Cx43多克隆抗體、一抗兔抗鼠Cx26多克隆抗體（cat No.BA1591）、一抗小鼠抗鼠β-actin多克隆抗體（cat No.BM0627）的生產(chǎn)企業(yè)都是武漢博士德生物工程有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（cat No.ZB-2307,Lot No.77928）和山羊抗小鼠二抗（cat No.ZB-2305,Lot No.78039）是由中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的；RNA提取試劑盒TRIzol reagent為Invitrign公司產(chǎn)品；First Strand cDNA Synthesis Kit購于TOYOBO公司；用于進行細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、凍存管的生產(chǎn)廠商都是德國Greiner bio-one公司；一次性微孔濾膜來自于美國的Corning公司。

1.3 儀器

日本ESPEC產(chǎn)品BNA-3210型CO2培養(yǎng)箱；蘇州凈化設(shè)備廠生產(chǎn)的JH型超凈工作臺；江蘇省海門其林醫(yī)用儀器廠生產(chǎn)的型號為QL-190的旋渦混合器；重慶COIC產(chǎn)品XDS-1B型倒置顯微鏡；PowerPac 300型電泳儀、Gen Doc 1000型凝膠成像系統(tǒng)均為美國Bio-Rad產(chǎn)品；來自于哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司的型號為HZQ-C的空氣浴震蕩器；超級微量恒溫器的型號為HW-8B型，生產(chǎn)廠商為上海浦江分析儀器廠；穩(wěn)流穩(wěn)壓電流系統(tǒng)型號為DYY-8C型，來自于Bio-Rad公司；SDS－PAGE蛋白垂直電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司，20型）；日本Bio-Rad的630型酶標(biāo)儀；脫色搖床型號為TY-80B，來自于南京大學(xué)；YX280B型不銹鋼蒸汽消毒器生產(chǎn)廠商為上海三申醫(yī)療器械有限公司；CSY12-R120-W型純水器來自于韓國Human Corp；電熱恒溫干燥箱的型號是400型，產(chǎn)自長沙醫(yī)療器械廠；JB-1型磁力攪拌器來自于上海雷磁儀器廠新涇分廠；電動離心機型號為XYJ-801，來自于江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；液氮器由四川省樂山市東亞機電工貿(mào)有限公司生產(chǎn)，型號為YDS-30；日本島津HZ211-220型電子天平；細胞計數(shù)板為上海求精生化試劑儀器有限公司生產(chǎn)的，型號為XB-K-25；pH計型號為HI4212，來自于意大利HANNA。

2 方法

2.1 血清的制備

新生牛血清從奧地利PAA公司購入。無灌胃刺激鼠血清：用3%戊巴比妥鈉將SD大鼠（200-220g，雄性，健康，SPF級）麻醉后，腹主動脈取血。將離心管中的全血室溫靜置3h，以每分鐘3000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速進行15min的離心處理，分離血清后，放入到56℃的水浴箱中進行滅活，時間為30min；用細胞室內(nèi)0.2μm濾膜進行過濾分裝；保存在-70℃冰箱中備用。灌胃鼠血清：用蒸餾水對SD大鼠進行灌胃處理，腹主動脈取血。

2.2 無灌胃刺激鼠血清對B16細胞株HSV-tk/GCV系統(tǒng)治療的影響

分別消化B16，B16/tk細胞，然后將細胞密度為2×104個/ml的細胞懸液，將兩種細胞混合，使B16/tk的數(shù)量為占總細胞數(shù)目的20%。使用96孔板對其進行接種，每孔中加入100μl細胞懸液（2×103個/孔），設(shè)定5%CO2培養(yǎng)箱溫度為37℃，進行24h的培養(yǎng)，然后換新鮮的無血清培養(yǎng)基，設(shè)置如下組別：即新生牛血清組、新生牛血清聯(lián)合GCV組、無灌胃刺激鼠血清組、無灌胃刺激鼠血清聯(lián)合GCV組、灌胃鼠血清組、灌胃鼠血清聯(lián)合GCV組，以上組別中GCV均為20μm的作用濃度，將96孔板放置在5% CO2培養(yǎng)箱中，在37℃條件下進行48h的培養(yǎng)，然后采用MTT法進行檢測，進行細胞存活率的計算。

2.3 RT-PCR法檢測無灌胃刺激鼠血清對B16細胞株Cx26、Cx43mRNA表達水平的影響

設(shè)置新生牛血清組、灌胃鼠血清組、無灌胃刺激鼠血清組。培養(yǎng)細胞，藥物作用48h后。各組細胞樣品應(yīng)用試劑盒提取RNA。cDNA合成25μl體系中含：RNA-Primer Mix（13μl），5×緩沖液5μl，dNTPs（25mM）1μl，100ng隨機引物，M-MLV(200U/μl)1μl,加DEPC水 至25μl。逆轉(zhuǎn)錄條件為：42℃ 60min,99℃ 5 min。各取RT產(chǎn)物10μl,進行PCR擴增，0.2g·L-1瓊脂糖凝膠觀察結(jié)果。

2.4 Western Blot法檢測無灌胃刺激鼠血清對B16細胞株Cx26、Cx43蛋白表達水平的影響

設(shè)置新生牛血清組，無灌胃刺激鼠血清組，灌胃鼠血清組。培養(yǎng)細胞，藥物作用48h后棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗三遍，每孔加入150μLRipa裂解液進行裂解，然后使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量操作，使用Ripa配置成相同濃度的蛋白溶液，-80℃保存。每組取20μl蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，之后通過轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白向PVDF膜上進行轉(zhuǎn)移，使用5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1h，Cx43、Cx26一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5min，二抗孵育2h，洗滌3次每次5min，使用HRP發(fā)光液進行顯影操作，得到結(jié)果后使用Gel-pro軟件進行灰度值分析。

3 結(jié)果

3.1 無灌胃刺激鼠血清對B16細胞株HSV-tk/GCV系統(tǒng)治療的影響

使用倒置顯微鏡進行鏡下觀察，各組中的細胞形態(tài)、細胞數(shù)目在用藥前差異均很?。粺o灌胃刺激鼠血清組、灌胃鼠血清組的細胞生長情況較好，有明顯的增殖現(xiàn)象，相比于新生牛血清組，差異不明顯。三種血清聯(lián)合GCV組中，均有細胞數(shù)目減少、密度變小的情況出現(xiàn)，一些細胞有變圓、脫落的情況。MTT檢測細胞存活率情況見圖1：新生牛血清組、無灌胃鼠血清組、灌胃鼠血清組分別為：（10 0±10.39）%、（101.77±8.53）%、（95.72±7.58）%，加GCV后以上三組細胞存活率分別為：（64.28±4.40）%、（67.42±4.42）%、（64.61±6.96）%，新生牛血清組作為對照，另外兩組血清對B16細胞存活率差異不大，三種血清分別聯(lián)合GCV則會明顯抑制B16細胞（P＜0.01）。以新生牛血清聯(lián)合GCV組作為對照，無灌胃刺激鼠血清、灌胃鼠血清聯(lián)合GCV組對B16細胞的存活率差異不大（P＞0.05）。該結(jié)果說明本研究的三種血清對B16細胞的生長以及HSV-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)治療的效果比較一致。

3.2 無灌胃刺激鼠血清對B16細胞株Cx26、Cx43 mRNA表達的影響

培養(yǎng)B16細胞，分別用新生牛血清、無灌胃刺激鼠血清、灌胃鼠血清三種血清作用48h，實時熒光定量PCR測定Cx26和Cx43 mRNA的表達，結(jié)果如圖2所示：對照組為新生牛血清組，進行Cx26 mRNA表達條帶變化的觀察，灌胃鼠血清組寬度增加明顯，無灌胃刺激鼠血清組變化不明顯，而在Cx43 mRNA表達條帶方面，兩組均無明顯變化。使用Imagepro-plus 5.1軟件分析各條帶的光密度值，進行Cx26 mRNA、Cx43 mRNA相對表達量的計算，結(jié)果見表1、表2。結(jié)果表明：灌胃處理后的鼠血清會促使B16細胞中Cx26 mRNA的表達升高，但不影響Cx43 mRNA表達，無灌胃刺激的鼠血清不會影響B(tài)16細胞中Cx26和Cx43 mRNA的表達。

圖1 自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合血清對B16細胞株的殺傷效應(yīng)(MTT)

圖2 各組細胞Cx26和Cx43 mRNA表達電泳圖

表1 血清對B16細胞株Cx26表達的影響

表2 血清對B16細胞株Cx43表達的影響

3.3 無灌胃刺激鼠血清對B16細胞株Cx26和Cx43蛋白表達情況的影響

培養(yǎng)B16細胞，分別用新生牛血清、無灌胃刺激鼠血清、灌胃鼠血清三種血清作用48h，Western Blot檢測Cx26、Cx43 蛋白表達情況，結(jié)果如圖3所示：以新生牛血清為對照，在Cx26蛋白表達條帶的變化方面，灌胃鼠血清組寬度出現(xiàn)明顯增加，無灌胃刺激鼠血清組未出現(xiàn)明顯改變；在Cx43蛋白的表達方面，無灌胃刺激鼠血清組、灌胃鼠血清組變化均不明顯。用Imagepro-plus 5.1軟件分析各條帶灰度值，計算Cx26和Cx43蛋白的相對表達量，結(jié)果如表3。結(jié)果表明：灌胃刺激后鼠血清可使B16細胞Cx26蛋白的表達量增加，但不影響Cx43蛋白的表達，而無灌胃刺激的鼠血清對以上兩種蛋白表達均無明顯影響。

圖3 各組細胞Cx26和Cx43表達蛋白印跡圖

表3 血清對B16細胞株Cx26，Cx43表達的影響（免疫印跡）

4 討論

血清藥理學(xué)為中藥研究中使用的新型實驗技術(shù)，可以防止中藥制劑理化性質(zhì)干擾體外實驗，目前已經(jīng)有大量的中醫(yī)藥學(xué)研究通過此方法進行開展[6-9]。血清藥理學(xué)在藥理研究中具有不可替代的作用，但是其方法、應(yīng)用仍存在不少問題。血清的成分具有復(fù)雜性，同時，血清在制備過程中，不同的物種、給藥方式、給藥時間等均可影響血清質(zhì)量[10-13]。有實驗研究指出，冷刺激可下調(diào)心肌細胞Cx43、使腎上腺嗜酪細胞Cx表達增加，但尚未發(fā)現(xiàn)對腫瘤細胞Cx表達影響方面的報道[14，15]。本課題在進行六味地黃丸含藥血清聯(lián)合自殺基因治療腫瘤的相關(guān)研究過程中，也發(fā)現(xiàn)對照血清也可提高縫隙連接蛋白Cx26的表達。鑒于此，本實驗將考慮血清種屬，探討血清藥理學(xué)中的灌胃給藥對旁觀者效應(yīng)的影響。

本實驗以新生牛血清與鼠血清做對比，研究在血清制備過程中的灌胃刺激是否會促進大鼠機體內(nèi)某些非藥物物質(zhì)的分泌，從而影響縫隙連接蛋白Cx的表達。實驗結(jié)果顯示，新生牛血清、無灌胃刺激鼠血清及灌胃鼠血清對惡性黑色素瘤B16細胞HSV-tk/GCV系統(tǒng)基因治療效果及Cx43的表達無顯著差異，但灌胃鼠血清能夠提高Cx26的表達。研究結(jié)果表明，灌胃刺激能促使機體產(chǎn)生某種活性物質(zhì)，這種活性物質(zhì)對于惡性黑色素瘤B16細胞HSVtk/GCV系統(tǒng)的殺傷效果無影響，但會對其B16細胞Cx26表達產(chǎn)生影響，還有待深入研究其作用機制。