王中豪 賀彥 張曉波 徐霞 吳建利 施勇烽

(中國水稻研究所 國家水稻改良中心/水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室, 杭州 310006; *通信聯(lián)系人, E-mail: shiyongfeng@caas.cn)

葉色變異是一類類型豐富、表型明顯的突變性狀。Kurata等[1]將水稻葉色突變體分成白化、黃化、條紋、轉(zhuǎn)綠、黃綠和斑馬葉等幾類。轉(zhuǎn)綠突變體是在階段性失綠后能恢復(fù)到正常葉色形態(tài)的一類葉色突變體，不同轉(zhuǎn)綠突變體的失綠表型存在差異，可分為白化轉(zhuǎn)綠、條紋轉(zhuǎn)綠和黃化轉(zhuǎn)綠等類型[2-4]。白化轉(zhuǎn)綠在轉(zhuǎn)綠材料中比較常見，至今大約已鑒定了 40多個白化轉(zhuǎn)綠的突變體，絕大部分白化轉(zhuǎn)綠性狀受隱性核基因控制，但也有受顯性基因控制的報道。房賢濤等[5]對兩系不育系SE21S輻照處理后得到的6份白轉(zhuǎn)綠突變體的研究表明，白化轉(zhuǎn)黃綠突變體21W1系的葉色表型受顯性基因控制。這些白化轉(zhuǎn)綠突變體為揭示葉綠體分化與發(fā)育的分子機(jī)制提供了豐富的試驗材料，利用這些突變體已將gra3[6]、wgl[7]、gra75[8]、osv15[9]等突變基因定位到基因組特定的區(qū)間內(nèi)，也克隆了一些白化轉(zhuǎn)綠基因，如V1[10]、V2[11]、V3[12]、YSA[13]等。

穗頂端退化在水稻育種和生產(chǎn)中經(jīng)常發(fā)生，往往造成每穗粒數(shù)顯著減少，嚴(yán)重影響水稻單產(chǎn)。已報道水稻頂端退化現(xiàn)象主要受遺傳控制，一部分屬于數(shù)量性狀遺傳，相關(guān) QTL位點(diǎn)分布廣泛。如越光與桂朝2號的重組自交系群體在不同環(huán)境下種植共檢測到位于第1、2、3、5、6和7染色體上的6個控制穗頂端退化的 QTL[14]。Cheng等[15]在 PAA品種L-05261和正常穗品種IRAT129的F2鑒定到7個穗退化 QTL，其中主效基因qPAA8精細(xì)定位在RM22475與8-In112之間的37.6 kb區(qū)間內(nèi)。頂端穎花退化突變體的研究表明頂端穎花退化性狀主要受單隱性基因控制，如paa-hwa的穗退化由第4染色體上的一個隱性基因控制，候選基因LOC_Os04g56160存在一個單堿基突變[16]。目前利用突變體已克隆了DPS1[17]、OsALMT7[18]、TUTOU1[19]等穗頂端退化基因，這些基因編碼不同類型的蛋白功能，這些蛋白參與細(xì)胞凋亡、過氧化氫清除、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過程，表明穗頂端穎花正常發(fā)育可能受多個代謝途徑的影響。

本實驗室從EMS誘變秈稻IR64的突變體庫中發(fā)現(xiàn)的一份能穩(wěn)定遺傳的突變體vpa1，其苗期葉片出現(xiàn)明顯的白化現(xiàn)象，并逐漸轉(zhuǎn)綠恢復(fù)至正常葉色，抽穗期能觀查到明顯的穗頂端退化現(xiàn)象。遺傳分析表明vpa1的葉色白化轉(zhuǎn)綠和穗頂端退化性狀受獨(dú)立的兩個隱性基因控制。通過基因定位將控制vpa1的葉色白化轉(zhuǎn)綠性狀基因Osv16定位于第3染色體RM3441和RM3029之間，將控制穗頂端退化基因Ospaa10定位于第1染色體RM11157和RM5972之間，這些結(jié)果為進(jìn)一步的基因克隆和基因功能研究打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究采用的突變體vpa1是秈稻品種IR64經(jīng)過EMS誘變獲得的。經(jīng)過連續(xù)多代自交，vpa1的葉色白化轉(zhuǎn)綠和穗頂端退化性狀在浙江和海南都能穩(wěn)定遺傳。常規(guī)品種IR64和Moroberekan作為雜交親本構(gòu)建遺傳分析和定位的群體。

1.2 農(nóng)藝性狀考查

突變體vpa1和野生型IR64于2017年5月種植在中國水稻研究所富陽實驗基地，正常田間管理。成熟期隨機(jī)選取野生型IR64和突變體各3株考查株高、穗長、有效穗數(shù)、結(jié)實率和千粒重等農(nóng)藝性狀，取平均值進(jìn)行分析。

1.3 群體構(gòu)建及遺傳分析

以突變體vpa1為母本，分別與 IR64和Moroberekan配制雜交組合，觀查F1的表型并收獲F1單株種子。在苗期統(tǒng)計vpa1/IR64、vpa1/Moroberekan的F2群體中正常葉色和白化轉(zhuǎn)綠葉水稻株數(shù)，vpa1/Moroberekan F2群體中白化轉(zhuǎn)綠表型單株用于DNA提取和基因定位。在成熟期統(tǒng)計vpa1/IR64、vpa1/Moroberekan F2群體中正常穗型和頂端退化穗型的水稻株數(shù)，vpa1/ Moroberekan F2群體中穗頂端退化單株用于DNA提取和基因定位。進(jìn)一步觀查并統(tǒng)計vpa1/IR64 F2群體中100個單株的白化轉(zhuǎn)綠和穗頂端退化表型，分析兩個性狀是否獨(dú)立遺傳。

1.4 光合色素含量測定

分別在播種后第2周、第8周和第14周分別稱取野生型和突變體vpa1新生全展葉15 mg，剪成0.3～0.5 cm片段，每個時期野生型和突變體各取3株作為生物學(xué)重復(fù)，參照賀彥等[20]的方法提取葉綠素和類胡蘿卜素。用酶標(biāo)儀(SpectraMax i3x)測定470、649和665 nm三個波長處的光吸收值，參照Arnon和Wellburn等[21,22]的方法計算葉綠素和類胡蘿卜素含量。

1.5 基因定位

采用簡易法提取親本和突變單株DNA，苗期分別取vpa1/Moroberekan F2群體中正常表型單株與白化轉(zhuǎn)綠表型單株各 10株，抽穗期分別取vpa1/Moroberekan F2群體中正常穗型單株與頂端退化單株各10株，以等量葉片構(gòu)建野生型DNA池和突變體DNA池。利用水稻12條染色體上638對SSR標(biāo)記，對親本vpa1和Moroberekan進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記篩選，篩選到的多態(tài)性標(biāo)記用于野生池與突變池間多態(tài)性分析，找到兩個池間有多態(tài)的標(biāo)記，用于F2群體中突變單株的基因型分析，初步確定突變基因的位置。在目標(biāo)區(qū)間進(jìn)行SSR標(biāo)記加密，進(jìn)一步縮小區(qū)間范圍。所用 SSR標(biāo)記序列下載至Gramene數(shù)據(jù)庫（http://www.gramene.org)，由鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。參照Shi等[23]的方法進(jìn)行PCR和產(chǎn)物檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 vpa1的表型及主要農(nóng)藝性狀

自然生長條件下，與與野生型相比，突變體vpa1在苗期就出現(xiàn)明顯的白化表型（圖1-A)，后逐漸轉(zhuǎn)綠成白條紋葉，在分蘗期 vpa1的新生葉片仍有明顯的白條紋。突變體的生育期較野生型沒有明顯變化，但株高下降明顯（圖 1-B)。突變體vpa1的劍葉較野生型明顯變短且窄（圖1-C)。vpa1穗呈明顯的白色，穗長變短且頂端穎花退化（圖 1-B、DD)。農(nóng)藝性狀考查發(fā)現(xiàn)，突變體 vpa1的的株高、穗長、每穗粒數(shù)和和千粒重均較較野生型顯著下下降，而結(jié)實率卻沒有明顯變化（表1)。vpa1株高較較野生型下降約9.0%，穗長減減少約27.6%，每穗粒數(shù)減少約31.4%，千粒重較野生型下降約20.5%。

2.2 vpa1的色素含量

在播種種后第2周、第8周和第14周分別測測定突變體與野生型葉綠素和類胡蘿卜素含量。第22周和第 8周時突變體的葉葉綠素 a、葉綠素 b、類胡胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量均較野生型顯著下降，其中中，第2周時分別下降83.1%、82.5%、78.5%和83.1%，而第 8周時則分別下降了 22.9%、25%、12.5%和23.7%（圖2-A～B)。在第14周時vpa1的葉綠素素b和類胡蘿卜素含量較野生型無明顯差別，而葉綠綠素a和總?cè)~綠素含量仍較野生型分別下降 7.6%和5.7%（圖2C)。顯然，隨著生育期的推移突變體vpa1光合色素含量呈逐漸升高趨勢，與葉片白化轉(zhuǎn)綠表型變化一致。

圖1 突變體vpaa1及其野生型在苗期和抽穗期的表型Figg. 1. Performance of vpa1 annd wild type aat the seedling and heading stages.

表1 突變體vpa1和野生型型IR64的主要農(nóng)藝性狀Table 1. Commparison of agrronomic traits between vpa1and the wild-ttype.

2.3 vpa1白化轉(zhuǎn)綠和穗頂端退化性狀的遺傳分析

以vpaa1為母本，IIR64和Morooberekan為父本構(gòu)建了vpa1/IR64和vppa1/Moroberekan群體。考查F1植株葉色和穗部性狀發(fā)現(xiàn) F1的葉色和穗部表型與IR64一致，均表現(xiàn)為正常葉色和正常穗表型，表明葉片白化轉(zhuǎn)綠和穗穗頂端退化性狀受隱性基因控制。在苗期對一個vpa1/IIR64 F2群體共980株進(jìn)進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)正常葉色有7226株，白化轉(zhuǎn)綠葉有254株，正常葉色與白化轉(zhuǎn)綠葉個體的分離比符合3∶1（χ2=0.44＜χ20.05=3.84)（表 2)。vpa1/Moroberekan F2群體的正常葉色與白化轉(zhuǎn)綠葉個體的分離比也符合3∶1，表明vpa1的白化轉(zhuǎn)綠葉性狀受單隱性核基因控制。在成熟期對vpa1/IR64的F2群體共720株進(jìn)行穗頂端退化性狀調(diào)查，發(fā)現(xiàn)正常穗型有 565株，頂端退化穗型有155株，正常穗型與穗頂端退化個體的分離符合 3∶1（χ2=3.58＜χ20.05=3.84)（表2)，表明vpa1的穗頂端退化性狀受單隱性核基因控制。但是vpa1/Moroberekan的F2群體共1435株，其中1181株表現(xiàn)為正常穗型，254株表現(xiàn)為頂端退化表型，頂端退化個體數(shù)少于理論數(shù)（表3)。

圖2 不同時期vpa1和野生型IR64葉片光合色素含量的比較Fig. 2. Comparison of pigment contents between vpa1 and WT at different growth stages.

表2 vpa1中轉(zhuǎn)綠葉性狀的遺傳分析Table 2. Genetic analysis of the virescent leaf in vpa1.

表3 vpa1中穗頂端退化性狀的遺傳分析Table 3. Genetic analysis of the paa trait in vpa1.

為了進(jìn)一步鑒定vpa1的這兩個性狀是否受同一個基因控制，隨機(jī)考查 100個來源于vpa1/IR64組合的F2單株表型。其中54株表現(xiàn)正常葉色和正常穗型，22株僅出現(xiàn)白化轉(zhuǎn)綠葉，19株僅出現(xiàn)穗頂端退化表型，有5株同時出現(xiàn)白化轉(zhuǎn)綠葉和穗頂端退化表型，100個單株的分離情況符合獨(dú)立分配定律，進(jìn)一步證明vpa1的白化轉(zhuǎn)綠和穗頂端退化性狀受兩個獨(dú)立的隱性基因控制。

2.4 白化轉(zhuǎn)綠基因Osv16定位

采用分池法構(gòu)建白化轉(zhuǎn)綠和正常葉色DNA池各一個，用基因組中均勻分布的638對SSR標(biāo)記進(jìn)行vpa1和Moroberekan的多態(tài)性篩選，共189對在親本間存在多態(tài)。其中，第3染色體短臂上的4個標(biāo)記RM14523、RM3545、RM218和RM232在兩個DNA池中具有多態(tài)。進(jìn)一步用這4個標(biāo)記分析F2群體的27株白化轉(zhuǎn)綠單株，分別檢測到4株、1株、1株和 4株重組個體（圖 3-A)，初步將vpa1的白化轉(zhuǎn)綠基因定位于RM14523和RM3545之間，并命名為Osv16。隨后在區(qū)間內(nèi)篩選到4個在親本間有多態(tài)的標(biāo)記（RM5755、RM7576、RM3441和RM5925)，進(jìn)一步分析F2群體的128株白化轉(zhuǎn)綠單株，將Osv16定位于RM3441和RM5925之間（圖3-B)。為了精細(xì)定位Osv16，篩選到親本間多態(tài)引物RM3029、RM14626、RM14627，并與兩側(cè)引物RM3441和RM5925分析1372個F2突變型的單株，根據(jù)標(biāo)記的物理位置和交換情況，最終將Osv16定位至RM3441和RM3029之間，物理距離約為125 kb的區(qū)間內(nèi)（圖3-C)。

圖3 白化轉(zhuǎn)綠基因Osv16在第3染色體上的定位Fig. 3. Location of Osv16 on chromosome 3.

圖4 穗頂端退化基因Ospaa10在第1染色體上的定位Fig. 4. Location of Ospaa10 on chromosome 1.

2.5 頂端退化基因Ospaa10定位

在vpa1/Moroberekan F2群體中構(gòu)建正常穗型和頂端退化穗型DNA池各一個，采用分池法快速初步定位與頂端退化性狀連鎖的標(biāo)記。其中，第 1染色體上RM23和RM3240在兩個DNA池上表現(xiàn)多態(tài)，表明vpa1的頂端退化性狀基因可能位于第1染色體上。用 RM23和 RM3240對來源于vpa1/Moroberekan F2中隨機(jī)的30株頂端退化單株分析發(fā)現(xiàn)RM23存在11個單交換，RM3240存在13個單交換（圖4-A)。在RM23和RM3240之間篩選得到3個親本間多態(tài)標(biāo)記（RM466、RM24和RM5)，并結(jié)合RM23和RM3240對152個F2突變單株進(jìn)行連鎖分析，初步將vpa1的頂端退化基因定位于RMR24和RM5之間（圖4-B)，并命名為Ospaa10。在定位區(qū)間內(nèi)進(jìn)一步發(fā)展并鑒定獲得 5個親本間有多態(tài)的標(biāo)記（RM11121、RM11134、RM11135、RM11157和 RM5972)。用這 5個標(biāo)記和RM24、RM5對254株頂端退化單株進(jìn)行分析，將Ospaa10基因定位于RM11157和RM5972之間，物理距離約190 kb（圖4-C)。

3 討論

突變體是遺傳學(xué)研究必需的基礎(chǔ)材料，在遺傳育種、基因克隆及基因表達(dá)調(diào)控等研究中具有重要作用。EMS誘變具有技術(shù)簡單、突變率高，能在短時間內(nèi)獲得大量突變體等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于水稻突變體構(gòu)建。EMS誘變獲得的水稻突變體往往包含較多的突變位點(diǎn)，Wu等[24]對0.8%和1.0% EMS誘導(dǎo)產(chǎn)生的1000個M2單株用TILLING檢測pp2A4和cal7兩個基因，估算的突變密度為每Mb范圍約有0.5個突變，而在1.6% EMS誘導(dǎo)的群體中突變密度則上升至約每1 Mb有1個突變。Henry等[25]利用全外顯子測序的方法分析了72份M2水稻突變體，根據(jù)獲得的突變位點(diǎn)預(yù)測共有超過 2700個突變位點(diǎn)可能改變基因功能。一旦這些基因功能的改變直接導(dǎo)致突變體的表型變化，則在大田環(huán)境下容易被鑒定獲得。在本研究中，我們利用 EMS誘變獲得的突變體vpa1兼有白化轉(zhuǎn)綠葉和穗頂端退化兩種明顯的表型特征，遺傳分析表明這兩種性狀并不是由一個基因突變引起的一因多效，而是受兩個獨(dú)立分離的隱性基因控制。類似vpa1，在水稻葉、穗等器官中發(fā)生變異的多基因突變體目前報道較少。

本研究中突變體vpa1中控制白化轉(zhuǎn)綠性狀的基因Osv16定位在第3染色體RM3441和RM3029之間，約125kb的物理區(qū)間內(nèi)。目前第3染色體上已報道了多個白化轉(zhuǎn)綠基因，蔡海亞等[6]將白化轉(zhuǎn)綠基因gra3定位于RM14436和RM14450之間，約125 kb區(qū)間。劉喜等[7]將WGL的突變基因定位于RM6472和N3-15之間，約680 kb的物理距離內(nèi)。通過圖位克隆的方法在第3染色體上已鑒定了V1、V2和YSA三個白化轉(zhuǎn)綠基因，V1基因編碼1個定位于葉綠體的NUS1蛋白，NUS1蛋白主要參與葉綠體 RNA的代謝調(diào)控，其特異地在未成熟葉片上表達(dá)并促進(jìn)葉片早期低溫脅迫下質(zhì)體遺傳系統(tǒng)的建立[10,26]。V2基因編碼1個定位于質(zhì)體和線粒體的鳥苷酸激酶（pt/mt GK)，其突變導(dǎo)致葉綠體分化過程受到抑制，pt/mt GK可能參與葉綠體蛋白的合成或裝配[11,27]。YSA基因編碼一個葉綠體定位的三角狀五肽重復(fù)（PPR)蛋白，YSA基因突變致使突變體ysa三葉期前表現(xiàn)白化，后逐漸轉(zhuǎn)綠，ysa的主要農(nóng)藝性狀與野生型培矮64S無明顯差異，可作為標(biāo)記性狀直接用于雜交水稻生產(chǎn)[13]。簡磊等[28]報道的白化轉(zhuǎn)綠基因albg是ysa的等位基因，albg的株高、結(jié)實率等農(nóng)藝性狀顯著低于野生型，說明YSA基因的不同位置突變對植株的影響并不一致。Osv16定位區(qū)間與已報道的基因位置均不重疊，可能是一個新的控制葉綠體發(fā)育的基因。

王斌等[14]利用1個秈粳交重組自交系群體在3個地點(diǎn)對穗頂端退化性狀進(jìn)行 QTL分析，僅在 1個點(diǎn)檢測到位于第1染色體RM6451-OSR13區(qū)間的qASA1，這也表明穗頂端退化性狀對環(huán)境條件敏感，可能受栽培條件及氣候因子等影響。除了受數(shù)量性狀控制外，dps1[17]、tut1[19]、cipk31[29]等突變體研究表明穗頂端退化性狀主要受單隱性基因控制，但也有突變體的頂端退化性狀受單個顯性基因控制，如PAA2[30]。目前已知的穗頂端退化基因中，編碼cAMP類受體蛋白的抑制因子的TUT1位于第1染色體[19]。本研究中vpa1的穗頂端退化性狀受單隱性基因控制，頂端退化基因Ospaa10定位于第1染色體RM11157和RM5972之間，區(qū)間內(nèi)尚未有其他頂端退化基因報道。