張麗麗，賴倚文，陳雪瑩，高天舒*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

Graves病(Graves’disease，GD)是通過促甲狀腺激素受體抗體(Thyroid stimulating hormone receptor antibody，TRAb)介導(dǎo)的自身免疫性甲狀腺疾病，表現(xiàn)為甲狀腺毒癥的臨床癥狀及體征，如彌漫性甲狀腺腫大、特征性眼部表現(xiàn)及皮膚改變，嚴(yán)重時還引發(fā)甲亢甚至危及生命。目前，口服抗甲狀腺藥物存在毒副作用、復(fù)發(fā)率高等缺點，根治性治療，如手術(shù)、I131則有引發(fā)手術(shù)并發(fā)癥和永久性甲減的概率。中醫(yī)以“癭氣”“氣癭”為病名對本病進(jìn)行治療已有兩千余年的歷史。查閱古籍發(fā)現(xiàn)，治療此病除含碘中藥外，夏枯草是應(yīng)用較為普遍的中藥之一，目前仍廣泛應(yīng)用于臨床。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以“疾病-基因-靶點-藥物”多層次、多角度的相互作用網(wǎng)絡(luò)為理念，運用專業(yè)的可視化網(wǎng)絡(luò)分析軟件及算法，對現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行篩選和網(wǎng)絡(luò)預(yù)測，進(jìn)而綜合觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)和影響[1]。本課題通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選、判斷夏枯草主要活性成分對GD的影響，探討夏枯草治療GD的機(jī)制，以期為進(jìn)一步探究其治療及作用機(jī)制提供理論支持和思路方向。

1 方法

1.1 夏枯草活性成分篩選及夏枯草調(diào)控的疾病靶標(biāo)獲取

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，https：//tcmspw.com/)中查詢夏枯草成分。由于化合物的口服吸收程度由口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)反映，類藥性(Drug-like，DL)為化合物與已知藥物的相似性，故篩選口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18的化合物作為活性成分[2]，并參考《中國藥典》規(guī)定進(jìn)行補(bǔ)充。應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢篩選出的夏枯草活性成分對應(yīng)的人源靶標(biāo)，通過Uniprot(https：//www.uniprot.org/)、DrugBank(https：//www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶標(biāo)蛋白對應(yīng)基因簡稱查詢，并去除非人源的靶標(biāo)，從而獲得夏枯草調(diào)控GD的靶標(biāo)。

1.2 Graves病人源基因靶標(biāo)獲取

利用GeneCards網(wǎng)站(https：//www.genecards.org/)查詢Graves病的相關(guān)基因，獲得Graves病基因簡稱。

1.3 夏枯草活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將夏枯草活性成分所對應(yīng)的靶標(biāo)基因與Graves病對應(yīng)的靶標(biāo)基因取交集，獲得夏枯草活性成分治療Graves病的靶標(biāo)基因，應(yīng)用Cytoscape7.1軟件構(gòu)建夏枯草活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建夏枯草治療Graves病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

蛋白互作(Protein-protein interaction，PPI)是機(jī)體細(xì)胞功能的基礎(chǔ)，在調(diào)節(jié)機(jī)體生理、病理活動方面發(fā)揮重要作用。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)是由蛋白的互作信息構(gòu)建而成的網(wǎng)絡(luò)。將交集得到的基因應(yīng)用STRING(https：//string-db.org/)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，選擇物種為“Homo sapiens”進(jìn)行操作，相互作用閾值設(shè)為“Highest confidence=0.9”，構(gòu)建夏枯草治療Graves病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape7.1中的CytoNCA插件對上述網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，因度值(Degree)、最短路徑(Closeness)、介數(shù)(Betweenness)這三個中心性參數(shù)在中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中最重要且常用[3]，而度值體現(xiàn)某一節(jié)點與其他節(jié)點的連接個數(shù)，度值越大該節(jié)點的影響力就越大；節(jié)點通過的最短路徑數(shù)越多、度值越大則該點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。故對這三者進(jìn)行分析，篩選出夏枯草治療Graves病的重要靶點蛋白。篩選標(biāo)準(zhǔn)為度值>中位數(shù)2倍，介數(shù)、最短路徑>中位數(shù)。

1.5 KEGG富集分析

使用Cytoscape7.1軟件的ClueGO插件對最終篩選出的靶點進(jìn)行KEGG富集分析。將篩選出的夏枯草治療 GD的重要靶點導(dǎo)進(jìn) ClueGo插件，設(shè)置物種為人，設(shè)定閾值P=0.05，evidience設(shè)定為 all，進(jìn)行 KEGG富集分析。

2 結(jié)果

2.1 夏枯草活性組分及人源靶標(biāo)的查詢篩選

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為限定條件篩選得到11個活性成分，參考《中國藥典》補(bǔ)充蘆丁、迷迭香酸[4]、熊果酸[5]3個活性成分，見表1?；谙目莶萑嗽窗袠?biāo)的篩選方法，篩選出235個夏枯草調(diào)控的疾病靶標(biāo)。

表1 夏枯草活性成分

2.2 Graves病人源基因靶標(biāo)獲取

利用GeneCards獲取Graves病人源基因靶標(biāo)1 461個。將夏枯草調(diào)控的疾病靶標(biāo)與Graves病基因靶標(biāo)取交集獲得98個夏枯草治療Graves病的基因靶標(biāo)，見圖1。

圖1 夏枯草Graves病交集靶點

2.3 夏枯草活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 7.1軟件進(jìn)行夏枯草活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，該網(wǎng)絡(luò)包含112個節(jié)點，其中14個節(jié)點代表夏枯草活性組分，另外98個節(jié)點代表夏枯草調(diào)控的Graves病的靶點(以靶點基因簡稱表示)，見圖2。

注：橢圓形為夏枯草成分，長方形為夏枯草與Graves病交集靶點。

2.4 夏枯草治療Graves病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)

如圖3所示，構(gòu)建的 PPI網(wǎng)絡(luò)中包含98個節(jié)點(有17個蛋白不符合篩選條件未顯示)、325條相互作用連線。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，度值：7，最短路徑：0.396 0，介數(shù)：54.884 4，按照篩選標(biāo)準(zhǔn)，共選出12個核心靶點(TNF、IL6、TP53、IL10、VEGFA、JUN、STAT3、CCL2、IL1β、IL4、CXCL8、EGFR)，見表2。提示這些蛋白在夏枯草治療Graves病藥理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由此推測夏枯草的14種活性成分中beta-sitosterol(β-谷甾醇)、kaempferol(山奈酚)、luteolin(木樨草素)、quercetin(槲皮素)、rutin(蘆丁)、ursolic acid(熊果酸)、rosmarinic acid(迷迭香酸)7種化合物為治療GD的關(guān)鍵成分。

表2 夏枯草治療GD的核心靶點

圖3 夏枯草治療Graves病PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 KEGG富集分析結(jié)果

12個基因靶標(biāo)應(yīng)用ClueGO插件進(jìn)行KEGG富集分析，得到IL-17 信號通路、Toll樣受體信號通路、C型凝集素受體信號通路、TNF 信號通路、 AGE-RAGE 信號通路、低氧誘導(dǎo)因子信號通路6個信號通路，見表3。

表3 KEGG富集結(jié)果

3 討論

GD以甲狀腺功能亢進(jìn)和甲狀腺彌漫性腫大為特征表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“癭氣”“氣癭”之范疇。中醫(yī)認(rèn)為本病之本在于肝腎陰虛，氣滯、火旺、痰凝、血瘀為本病之標(biāo)，病變涉及肝、腎、心、脾等多臟，尤以肝臟為主?！峨s病源流犀燭·頸項病源流》提到：“癭之為病，其證隸屬五臟，其原皆由肝火。”夏枯草為清肝瀉火、消腫散結(jié)之常用藥，其治療癭病由來已久。《神農(nóng)本草經(jīng)》載夏枯草可“散癭結(jié)氣”，《本草求真》云：“夏枯草……證知氣雖寒而味則辛，凡結(jié)得辛散……是以一切熱郁肝經(jīng)等證，得此治無不效?！蹦壳?，在甲亢的中醫(yī)藥治療中夏枯草仍是常用藥，其不僅用于中藥復(fù)方，夏枯草膏、夏枯草口服液、夏枯草膠囊、夏枯草顆粒等制劑也常被使用。夏枯草的應(yīng)用使GD患者在改善癥狀、縮短病程、減少不良反應(yīng)等方面受益[6-7]。

GD是受遺傳、免疫、環(huán)境等多種因素影響的器官特異性自身免疫紊亂。GD的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，涉及遺傳和環(huán)境因素、免疫紊亂、氧化應(yīng)激[8]等，其中免疫因素是GD發(fā)生發(fā)展的核心因素。既往研究認(rèn)為GD是由Th2介導(dǎo)的體液免疫[9)引發(fā)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Th1、Th2細(xì)胞共同參與GD的發(fā)病[10]，且Th1主要分泌IL-2、INF-γ、TNFα等細(xì)胞因子，在GD的早期起作用；Th2主要分泌IL4、IL-5、IL-6等細(xì)胞因子，在GD的晚期起主要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Thl7和 Treg細(xì)胞在GD的發(fā)病過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，且Th17與GD的嚴(yán)重程度，GO的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[11-12]。Th17細(xì)胞的分化由IL-6與TNF-γ協(xié)同作用下誘導(dǎo)，起加強(qiáng)甲狀腺組織局部免疫反應(yīng)的作用。

本課題應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索夏枯草治療Graves病的機(jī)制。篩選出14個夏枯草活性成分，其中β-谷甾醇、山奈酚、木樨草素、槲皮素、蘆丁、熊果酸、迷迭香酸7種化合物為夏枯草治療GD的關(guān)鍵成分，得到98個夏枯草與Graves病共有靶點，其中TNF、IL6、TP53、IL10、VEGFA、JUN、STAT3、CCL2、IL1β、IL4、CXCL8、EGFR，這12個核心靶點在夏枯草治療Graves病藥理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過對12個核心靶點的富集分析篩選出6條夏枯草治療Graves病的信號通路(白介素17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、低氧誘導(dǎo)因子信號通路、Toll樣受體信號通路等)，說明夏枯草可能通過調(diào)節(jié)多個生物過程以及多個通路的協(xié)調(diào)發(fā)揮治療GD的作用。

3.1 夏枯草可通過作用于VEGF靶點抑制GD患者的甲狀腺腫大

GD又稱毒性彌漫性甲狀腺腫、甲狀腺彌漫性腫。目前認(rèn)為甲狀腺腫大的機(jī)制與甲狀腺細(xì)胞的增殖和內(nèi)生血管的形成有關(guān)。本課題組前期研究證實，GD患者甲狀腺體積與血清 VEGF水平呈正相關(guān)，且含有夏枯草成分的中藥復(fù)方可降低血清 VEGF水平，減少甲狀腺內(nèi)新生血管的形成，進(jìn)而縮小甲狀腺體積[13]。VEGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長增殖及誘導(dǎo)血管形成的作用。VEGF家族包括VEGF-A、B、C、D和PIGF，其中VEGF-A與生理/病理情況下的血管生成、血管形成密切相關(guān)。有關(guān)研究[6,14]也證實，夏枯草制劑治療Graves病可以縮小甲狀腺腫。這與本課題得出的夏枯草治療GD的核心靶點相符，故推測夏枯草可通過作用于VEGF來抑制GD患者的甲狀腺腫大。此外，內(nèi)皮生長因子(EGFR)是一種細(xì)胞膜受體，具有酪氨酸蛋白激酶活性，能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞的增長，有研究[15-16]表明，EGFR在Graves病甲狀腺組織中的表達(dá)高于正常組織，由此推測EGFR也可能為夏枯草治療GD甲狀腺腫大的靶點。

3.2 夏枯草治療GD的主要調(diào)節(jié)機(jī)制預(yù)測

Th17在多種自身免疫疾病中均發(fā)揮重要作用，其在GD中的作用也逐漸受到重視。本課題發(fā)現(xiàn)IL-17信號通路顯著富集。IL-17家族通過其相應(yīng)的受體發(fā)出信號激活包括NF-κB、MAPK和C/EBP在內(nèi)的下游途徑，以誘導(dǎo)抗菌肽、細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。夏枯草能降低自身免疫性甲狀腺炎(AIT)患者的Th17細(xì)胞水平，還可降低AIT模型大鼠的IFN-γ、TL-4、IL-17等細(xì)胞因子水平[17-18]。此外，Toll樣受體信號通路(TLRs)也參與GD發(fā)病[19]，Toll樣受體與其配體結(jié)合，激活TLRs啟動下游信號，激活細(xì)胞內(nèi) MAPK信號通路和 NF-κB信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、干擾素等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。富集結(jié)果表明TNF信號通路也被顯著富集，通過KEGG數(shù)據(jù)庫查詢，TNF信號通路也可激活NF-κB途徑和MAPK途徑，也有研究表明夏枯草顆?？梢越档虶D患者TNF-α水平[20]。由于NF-κB是IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路的下游途徑，已有文獻(xiàn)研究證實甲亢患者的NF-κB通路處于激活狀態(tài)[21-22]，且夏枯草口服液可抑制NF-κB信號傳導(dǎo)通路，減輕甲狀腺炎癥[23]。故推測夏枯草或可通過IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路治療GD，但需進(jìn)一步研究證實。

本課題運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對夏枯草治療Graves 病的復(fù)雜分子網(wǎng)狀關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究，推測夏枯草主要通過β-谷甾醇、山奈酚、木樨草素、槲皮素、蘆丁、熊果酸、迷迭香酸這7種有效成分，作用于TNF、IL6、TP53、IL10、VEGFA、JUN、STAT3、CCL2、IL1β、IL4、CXCL8、EGFR這12個核心靶點，通過IL-17信號通路、Toll樣信號通路等多個通路發(fā)揮治療GD的作用。本課題為夏枯草治療GD提供了理論支持，也為進(jìn)一步研究夏枯草治療GD的機(jī)制提供了方向和思路，但仍需進(jìn)一步驗證。