徐婉欣, 凌玲, 查琴, 鐘姝, 姚玲, 柯慧敏, 陳敬旺, 陳磊, 詹桃, 周文天

南昌大學(xué)附屬眼科醫(yī)院角膜屈光科(江西南昌 330006)

近十年的研究表明，干細(xì)胞是多能的、緩慢循環(huán)再生的細(xì)胞[1]。角膜緣干細(xì)胞(LSCs)位于角膜緣上皮基底層,具有不斷增殖分化和向心性移動的能力[2- 3]。角膜緣干細(xì)胞給多種角膜緣干細(xì)胞缺乏或功能障礙引起的眼表疾病帶來了新的希望，如Stevens-Johnson綜合征、類天皰瘡綜合征、皰疹復(fù)合性疾病、眼的酸堿化學(xué)燒傷等，這些疾病可導(dǎo)致角膜結(jié)膜化、血管化、瘢痕化，最終視力大幅度下降，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[4-5]。近年來，隨著對角膜上皮干細(xì)胞生理的認(rèn)識逐漸深入，角膜上皮干細(xì)胞移植研究取得了較大進(jìn)展。自體角膜緣移植、異體角膜緣移植、體外培養(yǎng)的角膜上皮干細(xì)胞移植、口腔黏膜上皮細(xì)胞移植等已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床研究[6-8]。自體角膜上皮干細(xì)胞、口腔黏膜上皮干細(xì)胞是常用的細(xì)胞來源[9-11]。但是，自體角膜上皮干細(xì)胞來源少，且角膜上皮干細(xì)胞經(jīng)體外擴增后，不利于直接手術(shù)用于臨床上的角膜上皮干細(xì)胞移植。2017年11月至2019年12月，本研究擬利用以脫細(xì)胞角膜基質(zhì)為載體的角膜緣干細(xì)胞體外擴增技術(shù)，制備可用于臨床移植的含有角膜上皮干細(xì)胞的組織工程角膜，用于治療因角膜上皮干細(xì)胞缺乏所致的角膜病患者。基于兔角膜與人角膜極其相似的特征，本研究用兔角膜緣干細(xì)胞來替代人角膜緣干細(xì)胞作為研究對象，以期為人角膜細(xì)胞的研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級雄性新西蘭大白兔，體重2～2.5 kg，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動科部提供，裂隙燈顯微鏡檢查眼前節(jié)未發(fā)現(xiàn)任何眼部疾患。

1.1.2 脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì) 深圳艾尼爾角膜工程有限公司研發(fā)的“艾欣瞳”生物工程角膜。

1.1.3 主要試劑及儀器 DMEM/F12混合液(Gibco公司)；青-鏈霉素混合液及PBS溶液(Solarbio公司)；胎牛血清(Gibco公司)；小鼠單克隆抗體角蛋白K3 (AE5、特異性識別K3)、驢抗小鼠二抗及山羊多克隆抗體P63(Abcam)；免疫組化試劑盒 (SABC)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司);光學(xué)倒置顯微鏡IX50型(Olympus 公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔角膜緣組織取材 雄兔2.5 kg，采用耳緣靜脈空氣栓塞處死后，碘伏消毒眼周，置入開瞼器，PBS液沖洗結(jié)膜囊3次，無菌摘除眼球并剪除筋膜及眼肌，PBS反復(fù)沖洗后，浸泡于含雙抗的PBS溶液中，放置在4℃冰箱中30 min，將浸泡過的眼球組織置于無菌平皿中，在超凈工作臺內(nèi)操作，眼科鑷固定眼球，眼科剪取下2 mm×2 mm×1 mm淺層灰白色交界區(qū)角膜緣組織，放置于含PBS的EP管中。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)液的制備 基本培養(yǎng)基為DMEM/F12混合液(Gibco公司)，每45 mL DMEM/F12混合液中加入7.5 mL胎牛血清(Gibco公司)、500 μL青-鏈霉素混合液(Solarbio公司，雙抗液濃度為青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)、2 mmol/L L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸(NEA)，重組人表皮細(xì)胞生長因子(rhEGF，10 ng/mL)。

1.2.3 組織工程化角膜上皮的制備 在超凈工作臺中取出干燥保存的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)6片，生理鹽水復(fù)水，于DMEM/F12混合液中浸泡2 h，前彈力層面向上鋪于6孔板孔底，干燥12 h，基質(zhì)片與6孔板孔底緊密貼合后，取約1 mm×1 mm大小兔角膜緣組織貼附于基質(zhì)片上，上皮面向下，3～4塊/孔，干燥1 h，加2～3滴含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，放入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中，次日適量加液，以后隔2～3 d換液，培養(yǎng)15 d，倒置顯微鏡下每天觀察并記錄細(xì)胞生長情況。

1.2.4 組織工程化角膜上皮的移植 取雄兔5只，采用水合氯醛耳緣靜脈注射麻醉滿意后，隨機選擇一眼為手術(shù)眼，碘伏消毒眼周，置開瞼器，林格液沖洗結(jié)膜囊，用8 mm大小負(fù)壓環(huán)鉆于角膜中央鉆取150 μm深度板層角膜，取下角膜直徑8 mm、厚150 μm，板層刀修剪角膜植床，取培養(yǎng)14 d角膜上皮組織5片，用8.5 mm大小負(fù)壓環(huán)鉆鉆切同等大小植片，上皮面向上，10-0縫線連續(xù)縫合于角膜植床上，3-0尼龍線間斷縫合眼瞼中央兩針，術(shù)畢涂妥布霉素地塞米松眼膏，術(shù)后第2天拆除眼瞼縫線點抗生素及激素類滴眼液，以后左氧氟沙星滴眼液4次/d，妥布霉素地塞米松滴眼液3次/d，妥布霉素地塞米松眼膏1次/晚，隨訪的臨床檢查包括裂孔燈檢查以評估結(jié)膜充血、角膜光學(xué)清晰度、新生血管化和移植物退化等情況。

1.2.5 HE染色 取培養(yǎng)30 d后的組織工程化角膜組織1片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，100%乙醇洗去二甲苯；梯度乙醇水化；蘇木素、伊紅染色各10 min；根據(jù)顏色深淺用80%的乙醇分化，梯度乙醇脫水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明10 min；在石蠟切片中央滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 免疫熒光化學(xué)染色 于組織工程角膜上皮移植術(shù)后30 d，采用空氣栓塞的方法處死實驗動物1只，取術(shù)眼角膜行免疫熒光化學(xué)染色；(1)60℃烤片12 h；(2)切片脫蠟：先將切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次置于100%、95%、85%和75%乙醇中，每級放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min；(3)熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01 mol/L 枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0),電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，連續(xù)煮23 min后，冷卻23 min后拿出，冷卻至室溫。冷卻后0.01 mol/L PBS(pH 7.2～7.6)洗滌3 min×3次；(4)切片置于硼氫化鈉溶液中室溫下30 min，水漂洗5 min；(5)切片置于蘇丹黑染液中室溫下5 min，水沖洗3 min；(6)血清封閉液室溫封閉60 min；(7)孵育一抗：滴加適當(dāng)稀釋的一抗(HMGB1)，4℃過夜。PBS沖洗5 min×3次；(8)孵育二抗：滴加50～100 μL抗-兔-IgG標(biāo)記熒光抗體，37℃孵育90 min，PBS沖洗5 min×3次；(9)DAPI工作液37℃染核10 min，PBS沖洗5 min×3次；(10)緩沖甘油封片;(11)避光保存，置熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 組織工程化角膜上皮 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，組織塊接種第1周時進(jìn)展緩慢，只有幾個細(xì)胞出現(xiàn)在組織塊周圍，1周過后，細(xì)胞增殖狀態(tài)增強，細(xì)胞呈“沙灘樣”外觀從組織塊邊緣延伸出來，7～9 d后，逐漸形成細(xì)胞生長暈(圖1-A),10～12 d后，貼壁細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合，呈鋪路石狀(圖1-B)，15 d后，貼壁細(xì)胞逐漸形成單層，細(xì)胞形狀以多邊形和梭形為主(圖1-C)。

注：A：細(xì)胞生長7～9 d后，逐漸形成細(xì)胞生長暈(×4)；B：10～12 d后，貼壁細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合，呈鋪路石狀(×4)；C：15 d后，貼壁細(xì)胞逐漸形成單層，細(xì)胞形狀以多邊形和梭形為主(×10)

2.1.2 組織工程化角膜板層移植 手術(shù)完畢后，術(shù)眼角膜縫線規(guī)整，角膜邊緣平滑(圖2-A)；術(shù)后4 d對術(shù)眼進(jìn)行裂隙燈顯微鏡拍照，植入眼的角膜稍渾濁，無新生血管，無嚴(yán)重結(jié)膜水腫和充血，熒光素染色鈷藍(lán)光下拍照顯示角膜大部分著染(圖2-B，圖2-C)；術(shù)后9 d對術(shù)眼進(jìn)行裂隙燈顯微鏡拍照，植入眼的角膜下方稍渾濁，未見新生血管，無嚴(yán)重結(jié)膜水腫和充血，熒光素染色鈷藍(lán)光下拍照顯示角膜下方著染(圖2-D，圖2-E)；術(shù)后15 d對術(shù)眼進(jìn)行裂隙燈顯微鏡拍照，角膜較前透明，沒有新生血管，熒光素染色鈷藍(lán)光下拍照顯示僅角膜縫線處著染，角膜4～5點位出現(xiàn)直徑約2 mm圓形缺損(圖2-F、2-G)；術(shù)后21 d對術(shù)眼進(jìn)行裂隙燈顯微鏡拍照，植入眼的角膜透明，無新生血管，無結(jié)膜水腫和充血，角膜中央虹膜紋理清晰，熒光素染色鈷藍(lán)光下拍照顯示角膜僅縫線處著染，下方圓形缺損消失(圖2-H、2-I)。

2.2 HE染色 術(shù)后30 d HE染色光鏡下可見植入后的角膜組織與宿主角膜組織結(jié)合良好，膠原纖維排列規(guī)則，上皮細(xì)胞可見4～5層結(jié)構(gòu)，支架中見散在細(xì)胞，可見角膜緣干細(xì)胞多呈卵圓形，細(xì)胞核呈藍(lán)色，大部分為單核，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色至深紅色。見圖3。

2.3 免疫熒光染色 術(shù)后30 d免疫熒光染色光鏡下可見培養(yǎng)的細(xì)胞P63、CK3單克隆抗體呈陽性表達(dá)，CK3單克隆抗體染色呈紅色熒光，P63單克隆抗體染色呈綠色熒光，DAPI顯示細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。見圖4。

3 討論

國內(nèi)外研究顯示，角膜緣干細(xì)胞移植治療角膜緣干細(xì)胞缺乏的動物實驗中，可成功重建其眼表功能[12-13]。本實驗應(yīng)用脫細(xì)胞異種角膜基質(zhì)為支架，角膜緣干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜上皮為供體，行同種異體板層角膜移植，術(shù)后4～5 d植片霧狀混濁，14～21 d左右植片透明。于術(shù)后1個月左右脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)細(xì)胞化，HE染色顯示植片和植床結(jié)合良好，上皮細(xì)胞可見4～5層結(jié)構(gòu)，免疫熒光染色顯示角膜上皮組織中AE5、P63抗體均有表達(dá)，證實了這種組織工程化角膜上皮適合作板層移植的供體。

干細(xì)胞具有多能性和增殖再生能力，是具有更新能力的未分化細(xì)胞[14-15]。眾所周知，角膜干細(xì)胞位于角膜緣，在角膜上皮的基底層，角膜創(chuàng)傷愈合和更新都需要角膜緣干細(xì)胞的支持，Stevens-Johnson綜合征、慢性角膜炎、酸堿燒傷等造成LSCD的眼表疾病，都需要通過角膜緣干細(xì)胞的移植來重建眼表功能[16]。體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的重要條件是獲得角膜緣組織。角膜緣處主要由基質(zhì)層和上皮層組成，角膜緣干細(xì)胞不斷增殖分化并向心性移動，成為角膜上皮細(xì)胞自我更新的源泉。目前研究表明，角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)主要以組織塊法和酶消化法兩種培養(yǎng)方式為主[17]，酶消化法能把組織分散成單個細(xì)胞或細(xì)胞團，獲得高比例的細(xì)胞群[18]，但其吹打、離心等操作方式繁雜，易破壞細(xì)胞，酶消化時間的長短也較難把控，時間長易損害細(xì)胞，時間短較難分離出細(xì)胞[19]；本研究采用的是組織塊培養(yǎng)法，組織塊培養(yǎng)法是目前使用最廣泛的一種培養(yǎng)方式，其具有操作簡便的優(yōu)點，減少細(xì)胞污染的機會，且可以培養(yǎng)出具有體內(nèi)生物學(xué)特性的細(xì)胞。

注：A：術(shù)后當(dāng)天：術(shù)眼角膜縫線規(guī)整，角膜邊緣平滑；B、C：術(shù)后4 d，無嚴(yán)重結(jié)膜水腫和充血，熒光素染色鈷藍(lán)光下拍照顯示角膜大部分著染。D、E：術(shù)后9 d，植入眼的角膜下方稍渾濁，未見新生血管，無嚴(yán)重結(jié)膜水腫和充血，熒光素染色顯示角膜下方著染；F、G：術(shù)后15 d，角膜較前透明，沒有新生血管，熒光素染色僅角膜縫線處著染，4～5點位出現(xiàn)直徑約2 mm圓形缺損。H、I：術(shù)后21 d，植入眼的角膜透明，角膜中央虹膜紋理清晰，熒光素染色鈷藍(lán)光下拍照顯示角膜僅縫線處著染角膜是眼球的第一道屏障，易受眼內(nèi)外各種有毒有害物質(zhì)的影響[20-21]，基質(zhì)前表面由4～5層上皮細(xì)胞組成的角膜上皮是角膜的第一防御屏障[22]，附于基質(zhì)后表面的內(nèi)皮由規(guī)則的內(nèi)皮細(xì)胞層形成，并具有脫水泵功能，以保持角膜的透明度[23]。角膜基質(zhì)是一種不可再生的組織，由約250～300層膠原層組成，由Ⅰ型膠原纖維組成[24]，它提供了角膜的大部分結(jié)構(gòu)框架，約占角膜厚度的80%～90%，角膜基質(zhì)中特殊的膠原網(wǎng)絡(luò)決定了角膜的穩(wěn)定性、機械強度和透明度[25-26]。因此，尋找一種具有良好生物相容性、高光學(xué)清晰度、抗手術(shù)韌性和組織工程角膜非免疫原性的理想支架是至關(guān)重要的。脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(APCM)具有良好的光學(xué)清晰度、耐手術(shù)韌性和生物相容性。此外，APCM還支持細(xì)胞分化、增殖和遷移[27]，APCM保存了天然角膜基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，由Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等主要分子組成，對細(xì)胞的分化、增殖和遷移非常重要[28]。到目前為止，還沒有能夠完全模仿天然角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的人工支架。更重要的是，豬角膜有豐富的來源，比合成支架更容易獲得。用APCM研制一種含有上皮和部分基質(zhì)的前角膜替代物，來重建一個完整的、健康的、分層的上皮層來進(jìn)行角膜移植以防御角膜感染是可行的。在本研究中，2～3層上皮細(xì)胞在APCM表面迅速形成，并在1個月內(nèi)形成緊密連接。APCM保存了天然角膜的結(jié)構(gòu)，包括能夠支持基質(zhì)細(xì)胞生長的孔隙和分子結(jié)構(gòu)[28]。

注：角膜組織與宿主角膜組織結(jié)合良好，膠原纖維排列規(guī)則，上皮細(xì)胞可見4～5層結(jié)構(gòu)，支架中見散在細(xì)胞，可見角膜緣干細(xì)胞多呈卵圓形，細(xì)胞核呈藍(lán)色，大部分為單核，細(xì)胞質(zhì)呈粉紅色至深紅色(A：×10；B：×20)

注：A：CK3單克隆抗體染色呈紅色熒光；B：P63單克隆抗體染色呈綠色熒光；C：DAPI顯示細(xì)胞核呈藍(lán)色

角膜的生物力學(xué)性能是角膜組織工程的關(guān)鍵因素。用APCM構(gòu)建的兔前角膜置換術(shù)具有抗縫線阻力等生物力學(xué)性能。在1個月的板層角膜移植期內(nèi)，所有植入的角膜均無主要并發(fā)癥，如基質(zhì)水腫、新生血管形成或炎癥等，植入角膜內(nèi)無排斥反應(yīng)或角膜擴張的癥狀。雖然在板層角膜移植早期，由于手術(shù)操作和緊固縫線造成角膜上皮缺損，但3周后正常角膜上皮迅速覆蓋移植表面。因此，今后應(yīng)采用一種改良的手術(shù)方法來改善這種情況。術(shù)后1個月，雖然角膜是透明的，但其表面似乎不規(guī)則，角膜有輕微的陰影，如果在臨床上使用，可能會降低患者的視力。在天然角膜基質(zhì)中，分布著靜止的基質(zhì)細(xì)胞，負(fù)責(zé)膠原纖維的調(diào)節(jié)和基質(zhì)透明性的維持。它們也被命名為角化細(xì)胞[29]。然而，隨著微環(huán)境的改變，如角膜損傷，會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，從而使光線離散，產(chǎn)生角膜混濁，改變基質(zhì)中的膠原成分[30]。為了保證上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在APCM中生長良好，采用血清進(jìn)行培養(yǎng)，血清中含有復(fù)雜的生長因子，可將角化細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞[31]。這可能是移植角膜中不規(guī)則的角膜表面或薄霧形成的原因。因此，要完善培養(yǎng)體系，解決這一問題，如使用無血清培養(yǎng)系統(tǒng)。盡管需要改進(jìn)培養(yǎng)系統(tǒng)和手術(shù)技術(shù)以獲得最佳的視覺效果，但本研究中的結(jié)構(gòu)是透明的，同時顯示出良好的生物相容性、生物安全性和再生特性，使它們能夠作為人類角膜移植的有價值的替代物。雖然臨床上的研究還有待于進(jìn)一步確定角膜替代物的全部潛能，以減輕供體角膜組織的缺乏，但我們的研究結(jié)果表明，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞不受損害時，所構(gòu)建的角膜替代物可能是LK或DLK等手術(shù)中替代人角膜組織的一種可能的選擇。