高永偉，李志中，王建國(guó)，叢曉楠，宋艷萍，張秀玲

(1.威海市環(huán)翠區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 威海 264200；2.山東新希望六和集團(tuán)有限公司，山東 青島 266000；3.威海市環(huán)翠區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東 威海 264200)

0 引言

環(huán)翠區(qū)某規(guī)模蛋雞場(chǎng)，其中一棟雞舍自開產(chǎn)以后出現(xiàn)產(chǎn)蛋率上升緩慢，產(chǎn)蛋率低，160日齡產(chǎn)蛋率僅為73%，蛋品質(zhì)量差，陸續(xù)出現(xiàn)白殼蛋、軟殼蛋，雞群體重不達(dá)標(biāo)，平均低于標(biāo)準(zhǔn)5%～10%，同時(shí)伴有呼吸道異常癥狀；雞只剖解見(jiàn)肝臟淤血，肝臟邊緣有出血點(diǎn)，腺胃有出血，肌胃下有潰瘍，脾臟變小，盲腸扁桃體有出血等情況。

由于臨床診斷不足以對(duì)該雞群進(jìn)行確診，特對(duì)發(fā)病雞群進(jìn)行2次采樣，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)分析，確診該雞群為免疫抑制病與支原體混合感染，現(xiàn)將檢測(cè)診斷報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別取160日齡及175日齡患病蛋雞肛門拭子10份、咽喉拭子10份、病變部位組織5份、血清30份。

1.2 主要試劑

ALV-J抗體、REV抗體、CAV抗體、MG抗體、MS抗體、IB抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京愛(ài)德仕公司；病毒核酸提取試劑盒Easy Pure Viral DNA/RNA Kit購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。H9/ND/RE-11/RE-12檢測(cè)抗原購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

ALV-J引物，MDV引物，CAV引物，REV引物，M引物，MS引物，MG引物，IB引物，F(xiàn)ADV引物及REO檢測(cè)引物為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及保存。

1.3 儀器設(shè)備

PCR儀，德國(guó)Biometra公司;酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰公司；凝膠成像儀，購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PCR病原檢測(cè)

2.1.1 樣品處理

病料：將采集的10份的病料按1:4加入滅菌的PBS或生理鹽水，置研磨器(滅菌)中充分研磨后，按每管1mL分裝到1.5 mL滅菌的離心管中，反復(fù)凍融3次，10 000 r/m離心5 min，取上清液200 μL用于核酸提取。

棉拭子：將采集的20份咽喉拭子及20份肛門拭子進(jìn)行5合1處理，加入滅菌的PBS或生理鹽水于震蕩儀中震蕩20 min后，10 000 r/m離心5 min，取上清液200 μL用于核酸提取。

2.1.2 病毒RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增

分別取處理后的病料及拭子上清、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各200 μL，按照金瑞鴻捷病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行核酸的提取。

使用一步法RT-PCR試劑盒，按照如下20 μL體系配制進(jìn)行PCR擴(kuò)增：20 μmol/L上下游引物(M/ND/IB)各0.4 μL，2×One-Step Reaction Mix 10 μL，Enzyme Mix 0.4 μL，滅菌的蒸餾水3.03 μL，RNA模板5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 25 min；94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min。

2.1.3 病毒DNA的提取及PCR擴(kuò)增

分別取病料及拭子上清、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各200 μL，按照金瑞鴻捷病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行核酸的提取，按照25 μL體系配制進(jìn)行PCR擴(kuò)增：20 μmol/L上下游引物(MG/MS/FADV/ALV-J/REV/CAV)各1μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，滅菌的蒸餾水8.5 μL，DNA模板2μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

2.1.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果觀察與判定

取PCR產(chǎn)物5 μl，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)束后用紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。

2.2 ELISA檢測(cè)

將2個(gè)日齡共計(jì)60份血清，用樣品稀釋液進(jìn)行1：500稀釋，參考愛(ài)德仕ALV-J抗體、IB抗體、MG抗體、MS抗體、REV抗體及CAV抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，依次進(jìn)行加樣、孵化、加酶標(biāo)抗體、孵化、顯色及終止等一系列操作。最后將板放入酶標(biāo)儀，在IDEXX軟件中，查找個(gè)相應(yīng)抗體的程序(650 nm)，測(cè)量吸光值A(chǔ)(OD650值)。根據(jù)OD值參考說(shuō)明書來(lái)判定結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)陽(yáng)性率。

2.3 HI檢測(cè)

將2個(gè)日齡共計(jì)60份血清，參考中國(guó)獸藥典第三版附錄方法，依次進(jìn)行各項(xiàng)抗原HA測(cè)定、4單位配制及H9、ND、RE-11、RE-12的HI抗體檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)抗體平均值及離散度。

3 檢測(cè)結(jié)果

3.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

PCR電泳結(jié)果顯示，肛門拭子的REV與MG出現(xiàn)目的條帶，大小分別為340 bp和500 bp，其他樣品的目的條帶均未出現(xiàn)，如圖1所示。

3.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

對(duì)160日齡及175日齡采集的60份血清進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)，各個(gè)項(xiàng)目均呈現(xiàn)不同程度的陽(yáng)性，具體結(jié)果，如表1所示。

表1 ELISA檢測(cè)結(jié)果

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果

3.3 HI檢測(cè)結(jié)果

對(duì)160日齡及175日齡采集的60份血清進(jìn)行HI抗體檢測(cè)，各個(gè)項(xiàng)目均為陽(yáng)性，且變異系數(shù)均低于8%，具體結(jié)果，如表2所示。

表2 HI檢測(cè)結(jié)果

4 診斷結(jié)果

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)，并結(jié)合臨床癥狀及剖解變化，可以診斷為本批雞群存在CAV、ALV-J及REV 3種免疫抑制病與MG、MS混合感染，且感染時(shí)間段不同，前期感染CAV和MS，而當(dāng)前處于感染期的疫病為ALV-J、REV與MG。

5 討論

CAV、REV、ALV-J是危害養(yǎng)雞業(yè)最常見(jiàn)的免疫抑制性病毒。它們先后或共同感染時(shí)使雞對(duì)疫病的易感性提高，或相互作用，使各自的致病力增強(qiáng)。3種免疫抑制病既可以垂直傳播也可水平傳播，對(duì)混合感染雞群分析發(fā)現(xiàn)，雞群均普遍存在生長(zhǎng)阻滯、生產(chǎn)性能下降、多種病原感染、總的發(fā)病率和死淘率增加等現(xiàn)象，這可能是機(jī)體免疫抑制所造成的后果[1，2]。MS、MG為生產(chǎn)中常見(jiàn)的支原體病，MS在臨床表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、胸囊腫，同時(shí)也會(huì)引起雞群的呼吸道異常癥狀，而MG基本表現(xiàn)為氣囊炎及呼吸道癥狀。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，二者發(fā)病表現(xiàn)尤為嚴(yán)重，且難以治愈[3，4]。

通過(guò)本病例的檢測(cè)診斷發(fā)現(xiàn)，它既能夠體現(xiàn)出是否存在多種疫病的感染，也能體現(xiàn)出疫病感染的狀態(tài)。本雞群由于發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)，且嚴(yán)重影響了生產(chǎn)，通過(guò)臨床癥狀不能完全找到病因，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來(lái)進(jìn)行診斷。經(jīng)過(guò)病原學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，一是該產(chǎn)蛋雞群較早感染了CAV與MS，整體雞群抗體的陽(yáng)性率為100%；二是雞群正處于REV、ALV-J及MG等疫病感染期內(nèi)，且感染率呈上升趨勢(shì)。而雞群的傳支、流感及新城疫抗體具有良好的水平，并未發(fā)現(xiàn)因雞群感染免疫抑制病后對(duì)雞群的影響[5]。

從該雞群的后期防控來(lái)看，可以通過(guò)使用提高機(jī)體抵抗力的中藥來(lái)降低免疫抑制病對(duì)雞群的危害，同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、進(jìn)行帶雞消毒，減少環(huán)境中的病毒細(xì)菌載量，降低機(jī)體呼吸系統(tǒng)中病原的載量，最終降低在活躍期的MG及REV等對(duì)生產(chǎn)的影響[6]。

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)已經(jīng)對(duì)動(dòng)物疫病診斷發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也起到了預(yù)警作用，進(jìn)一步建立并完善動(dòng)物疫病防控體系，將為畜禽生產(chǎn)帶來(lái)更大價(jià)值。