高永偉，李志中，王建國，叢曉楠，宋艷萍，張秀玲

(1.威海市環(huán)翠區(qū)動物疫病預防控制中心，山東 威海 264200；2.山東新希望六和集團有限公司，山東 青島 266000；3.威海市環(huán)翠區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東 威海 264200)

0 引言

環(huán)翠區(qū)某規(guī)模蛋雞場，其中一棟雞舍自開產(chǎn)以后出現(xiàn)產(chǎn)蛋率上升緩慢，產(chǎn)蛋率低，160日齡產(chǎn)蛋率僅為73%，蛋品質量差，陸續(xù)出現(xiàn)白殼蛋、軟殼蛋，雞群體重不達標，平均低于標準5%～10%，同時伴有呼吸道異常癥狀；雞只剖解見肝臟淤血，肝臟邊緣有出血點，腺胃有出血，肌胃下有潰瘍，脾臟變小，盲腸扁桃體有出血等情況。

由于臨床診斷不足以對該雞群進行確診，特對發(fā)病雞群進行2次采樣，通過實驗室病原學及血清學檢測分析，確診該雞群為免疫抑制病與支原體混合感染，現(xiàn)將檢測診斷報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

分別取160日齡及175日齡患病蛋雞肛門拭子10份、咽喉拭子10份、病變部位組織5份、血清30份。

1.2 主要試劑

ALV-J抗體、REV抗體、CAV抗體、MG抗體、MS抗體、IB抗體ELISA檢測試劑盒，購自北京愛德仕公司；病毒核酸提取試劑盒Easy Pure Viral DNA/RNA Kit購自北京全式金生物技術有限公司。H9/ND/RE-11/RE-12檢測抗原購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司。

ALV-J引物，MDV引物，CAV引物，REV引物，M引物，MS引物，MG引物，IB引物，F(xiàn)ADV引物及REO檢測引物為本實驗室設計及保存。

1.3 儀器設備

PCR儀，德國Biometra公司;酶標儀，美國伯騰公司；凝膠成像儀，購自美國伯樂公司。

2 實驗方法

2.1 PCR病原檢測

2.1.1 樣品處理

病料：將采集的10份的病料按1:4加入滅菌的PBS或生理鹽水，置研磨器(滅菌)中充分研磨后，按每管1mL分裝到1.5 mL滅菌的離心管中，反復凍融3次，10 000 r/m離心5 min，取上清液200 μL用于核酸提取。

棉拭子：將采集的20份咽喉拭子及20份肛門拭子進行5合1處理，加入滅菌的PBS或生理鹽水于震蕩儀中震蕩20 min后，10 000 r/m離心5 min，取上清液200 μL用于核酸提取。

2.1.2 病毒RNA的提取及RT-PCR擴增

分別取處理后的病料及拭子上清、陽性對照和陰性對照各200 μL，按照金瑞鴻捷病毒核酸提取試劑盒說明書進行核酸的提取。

使用一步法RT-PCR試劑盒，按照如下20 μL體系配制進行PCR擴增：20 μmol/L上下游引物(M/ND/IB)各0.4 μL，2×One-Step Reaction Mix 10 μL，Enzyme Mix 0.4 μL，滅菌的蒸餾水3.03 μL，RNA模板5.5 μL。PCR擴增程序為：45℃ 25 min；94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s，共進行32個循環(huán)；最后72℃延伸8 min。

2.1.3 病毒DNA的提取及PCR擴增

分別取病料及拭子上清、陽性對照和陰性對照各200 μL，按照金瑞鴻捷病毒核酸提取試劑盒說明書進行核酸的提取，按照25 μL體系配制進行PCR擴增：20 μmol/L上下游引物(MG/MS/FADV/ALV-J/REV/CAV)各1μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，滅菌的蒸餾水8.5 μL，DNA模板2μL。PCR擴增程序為：95℃預變性5 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

2.1.4 PCR擴增結果觀察與判定

取PCR產(chǎn)物5 μl，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結束后用紫外凝膠成像儀觀察結果。

2.2 ELISA檢測

將2個日齡共計60份血清，用樣品稀釋液進行1：500稀釋，參考愛德仕ALV-J抗體、IB抗體、MG抗體、MS抗體、REV抗體及CAV抗體檢測試劑盒說明書，依次進行加樣、孵化、加酶標抗體、孵化、顯色及終止等一系列操作。最后將板放入酶標儀，在IDEXX軟件中，查找個相應抗體的程序(650 nm)，測量吸光值A(OD650值)。根據(jù)OD值參考說明書來判定結果，并統(tǒng)計各項陽性率。

2.3 HI檢測

將2個日齡共計60份血清，參考中國獸藥典第三版附錄方法，依次進行各項抗原HA測定、4單位配制及H9、ND、RE-11、RE-12的HI抗體檢測，根據(jù)結果統(tǒng)計抗體平均值及離散度。

3 檢測結果

3.1 PCR檢測結果

PCR電泳結果顯示，肛門拭子的REV與MG出現(xiàn)目的條帶，大小分別為340 bp和500 bp，其他樣品的目的條帶均未出現(xiàn)，如圖1所示。

3.2 ELISA檢測結果

對160日齡及175日齡采集的60份血清進行ELISA抗體檢測，各個項目均呈現(xiàn)不同程度的陽性，具體結果，如表1所示。

表1 ELISA檢測結果

圖1 PCR檢測結果

3.3 HI檢測結果

對160日齡及175日齡采集的60份血清進行HI抗體檢測，各個項目均為陽性，且變異系數(shù)均低于8%，具體結果，如表2所示。

表2 HI檢測結果

4 診斷結果

通過實驗室病原學及血清學檢測，并結合臨床癥狀及剖解變化，可以診斷為本批雞群存在CAV、ALV-J及REV 3種免疫抑制病與MG、MS混合感染，且感染時間段不同，前期感染CAV和MS，而當前處于感染期的疫病為ALV-J、REV與MG。

5 討論

CAV、REV、ALV-J是危害養(yǎng)雞業(yè)最常見的免疫抑制性病毒。它們先后或共同感染時使雞對疫病的易感性提高，或相互作用，使各自的致病力增強。3種免疫抑制病既可以垂直傳播也可水平傳播，對混合感染雞群分析發(fā)現(xiàn)，雞群均普遍存在生長阻滯、生產(chǎn)性能下降、多種病原感染、總的發(fā)病率和死淘率增加等現(xiàn)象，這可能是機體免疫抑制所造成的后果[1，2]。MS、MG為生產(chǎn)中常見的支原體病，MS在臨床表現(xiàn)關節(jié)炎、胸囊腫，同時也會引起雞群的呼吸道異常癥狀，而MG基本表現(xiàn)為氣囊炎及呼吸道癥狀。當機體抵抗力下降時，二者發(fā)病表現(xiàn)尤為嚴重，且難以治愈[3，4]。

通過本病例的檢測診斷發(fā)現(xiàn)，它既能夠體現(xiàn)出是否存在多種疫病的感染，也能體現(xiàn)出疫病感染的狀態(tài)。本雞群由于發(fā)病時間較長，且嚴重影響了生產(chǎn)，通過臨床癥狀不能完全找到病因，需要結合實驗室檢測來進行診斷。經(jīng)過病原學及血清學檢測發(fā)現(xiàn)，一是該產(chǎn)蛋雞群較早感染了CAV與MS，整體雞群抗體的陽性率為100%；二是雞群正處于REV、ALV-J及MG等疫病感染期內(nèi)，且感染率呈上升趨勢。而雞群的傳支、流感及新城疫抗體具有良好的水平，并未發(fā)現(xiàn)因雞群感染免疫抑制病后對雞群的影響[5]。

從該雞群的后期防控來看，可以通過使用提高機體抵抗力的中藥來降低免疫抑制病對雞群的危害，同時加強飼養(yǎng)管理、進行帶雞消毒，減少環(huán)境中的病毒細菌載量，降低機體呼吸系統(tǒng)中病原的載量，最終降低在活躍期的MG及REV等對生產(chǎn)的影響[6]。

實驗室檢測已經(jīng)對動物疫病診斷發(fā)揮了重要作用，同時也起到了預警作用，進一步建立并完善動物疫病防控體系，將為畜禽生產(chǎn)帶來更大價值。