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        基于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷蛋雞免疫抑制病與支原體混合感染

        2021-01-21 08:46:30高永偉李志中王建國叢曉楠宋艷萍張秀玲
        畜禽業(yè) 2021年1期
        關(guān)鍵詞:免疫抑制核酸雞群

        高永偉,李志中,王建國,叢曉楠,宋艷萍,張秀玲

        (1.威海市環(huán)翠區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,山東 威海 264200;2.山東新希望六和集團(tuán)有限公司,山東 青島 266000;3.威海市環(huán)翠區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展中心,山東 威海 264200)

        0 引言

        環(huán)翠區(qū)某規(guī)模蛋雞場(chǎng),其中一棟雞舍自開產(chǎn)以后出現(xiàn)產(chǎn)蛋率上升緩慢,產(chǎn)蛋率低,160日齡產(chǎn)蛋率僅為73%,蛋品質(zhì)量差,陸續(xù)出現(xiàn)白殼蛋、軟殼蛋,雞群體重不達(dá)標(biāo),平均低于標(biāo)準(zhǔn)5%~10%,同時(shí)伴有呼吸道異常癥狀;雞只剖解見肝臟淤血,肝臟邊緣有出血點(diǎn),腺胃有出血,肌胃下有潰瘍,脾臟變小,盲腸扁桃體有出血等情況。

        由于臨床診斷不足以對(duì)該雞群進(jìn)行確診,特對(duì)發(fā)病雞群進(jìn)行2次采樣,通過實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)分析,確診該雞群為免疫抑制病與支原體混合感染,現(xiàn)將檢測(cè)診斷報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 樣品采集

        分別取160日齡及175日齡患病蛋雞肛門拭子10份、咽喉拭子10份、病變部位組織5份、血清30份。

        1.2 主要試劑

        ALV-J抗體、REV抗體、CAV抗體、MG抗體、MS抗體、IB抗體ELISA檢測(cè)試劑盒,購自北京愛德仕公司;病毒核酸提取試劑盒Easy Pure Viral DNA/RNA Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。H9/ND/RE-11/RE-12檢測(cè)抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

        ALV-J引物,MDV引物,CAV引物,REV引物,M引物,MS引物,MG引物,IB引物,F(xiàn)ADV引物及REO檢測(cè)引物為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及保存。

        1.3 儀器設(shè)備

        PCR儀,德國Biometra公司;酶標(biāo)儀,美國伯騰公司;凝膠成像儀,購自美國伯樂公司。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 PCR病原檢測(cè)

        2.1.1 樣品處理

        病料:將采集的10份的病料按1:4加入滅菌的PBS或生理鹽水,置研磨器(滅菌)中充分研磨后,按每管1mL分裝到1.5 mL滅菌的離心管中,反復(fù)凍融3次,10 000 r/m離心5 min,取上清液200 μL用于核酸提取。

        棉拭子:將采集的20份咽喉拭子及20份肛門拭子進(jìn)行5合1處理,加入滅菌的PBS或生理鹽水于震蕩儀中震蕩20 min后,10 000 r/m離心5 min,取上清液200 μL用于核酸提取。

        2.1.2 病毒RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增

        分別取處理后的病料及拭子上清、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各200 μL,按照金瑞鴻捷病毒核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行核酸的提取。

        使用一步法RT-PCR試劑盒,按照如下20 μL體系配制進(jìn)行PCR擴(kuò)增:20 μmol/L上下游引物(M/ND/IB)各0.4 μL,2×One-Step Reaction Mix 10 μL,Enzyme Mix 0.4 μL,滅菌的蒸餾水3.03 μL,RNA模板5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 25 min;94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 35 s,共進(jìn)行32個(gè)循環(huán);最后72℃延伸8 min。

        2.1.3 病毒DNA的提取及PCR擴(kuò)增

        分別取病料及拭子上清、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照各200 μL,按照金瑞鴻捷病毒核酸提取試劑盒說明書進(jìn)行核酸的提取,按照25 μL體系配制進(jìn)行PCR擴(kuò)增:20 μmol/L上下游引物(MG/MS/FADV/ALV-J/REV/CAV)各1μL,2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL,滅菌的蒸餾水8.5 μL,DNA模板2μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;94℃ 45 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。

        2.1.4 PCR擴(kuò)增結(jié)果觀察與判定

        取PCR產(chǎn)物5 μl,進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)束后用紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。

        2.2 ELISA檢測(cè)

        將2個(gè)日齡共計(jì)60份血清,用樣品稀釋液進(jìn)行1:500稀釋,參考愛德仕ALV-J抗體、IB抗體、MG抗體、MS抗體、REV抗體及CAV抗體檢測(cè)試劑盒說明書,依次進(jìn)行加樣、孵化、加酶標(biāo)抗體、孵化、顯色及終止等一系列操作。最后將板放入酶標(biāo)儀,在IDEXX軟件中,查找個(gè)相應(yīng)抗體的程序(650 nm),測(cè)量吸光值A(chǔ)(OD650值)。根據(jù)OD值參考說明書來判定結(jié)果,并統(tǒng)計(jì)各項(xiàng)陽性率。

        2.3 HI檢測(cè)

        將2個(gè)日齡共計(jì)60份血清,參考中國獸藥典第三版附錄方法,依次進(jìn)行各項(xiàng)抗原HA測(cè)定、4單位配制及H9、ND、RE-11、RE-12的HI抗體檢測(cè),根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)抗體平均值及離散度。

        3 檢測(cè)結(jié)果

        3.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

        PCR電泳結(jié)果顯示,肛門拭子的REV與MG出現(xiàn)目的條帶,大小分別為340 bp和500 bp,其他樣品的目的條帶均未出現(xiàn),如圖1所示。

        3.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

        對(duì)160日齡及175日齡采集的60份血清進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè),各個(gè)項(xiàng)目均呈現(xiàn)不同程度的陽性,具體結(jié)果,如表1所示。

        表1 ELISA檢測(cè)結(jié)果

        圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果

        3.3 HI檢測(cè)結(jié)果

        對(duì)160日齡及175日齡采集的60份血清進(jìn)行HI抗體檢測(cè),各個(gè)項(xiàng)目均為陽性,且變異系數(shù)均低于8%,具體結(jié)果,如表2所示。

        表2 HI檢測(cè)結(jié)果

        4 診斷結(jié)果

        通過實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)及血清學(xué)檢測(cè),并結(jié)合臨床癥狀及剖解變化,可以診斷為本批雞群存在CAV、ALV-J及REV 3種免疫抑制病與MG、MS混合感染,且感染時(shí)間段不同,前期感染CAV和MS,而當(dāng)前處于感染期的疫病為ALV-J、REV與MG。

        5 討論

        CAV、REV、ALV-J是危害養(yǎng)雞業(yè)最常見的免疫抑制性病毒。它們先后或共同感染時(shí)使雞對(duì)疫病的易感性提高,或相互作用,使各自的致病力增強(qiáng)。3種免疫抑制病既可以垂直傳播也可水平傳播,對(duì)混合感染雞群分析發(fā)現(xiàn),雞群均普遍存在生長(zhǎng)阻滯、生產(chǎn)性能下降、多種病原感染、總的發(fā)病率和死淘率增加等現(xiàn)象,這可能是機(jī)體免疫抑制所造成的后果[1,2]。MS、MG為生產(chǎn)中常見的支原體病,MS在臨床表現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、胸囊腫,同時(shí)也會(huì)引起雞群的呼吸道異常癥狀,而MG基本表現(xiàn)為氣囊炎及呼吸道癥狀。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí),二者發(fā)病表現(xiàn)尤為嚴(yán)重,且難以治愈[3,4]。

        通過本病例的檢測(cè)診斷發(fā)現(xiàn),它既能夠體現(xiàn)出是否存在多種疫病的感染,也能體現(xiàn)出疫病感染的狀態(tài)。本雞群由于發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng),且嚴(yán)重影響了生產(chǎn),通過臨床癥狀不能完全找到病因,需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來進(jìn)行診斷。經(jīng)過病原學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),一是該產(chǎn)蛋雞群較早感染了CAV與MS,整體雞群抗體的陽性率為100%;二是雞群正處于REV、ALV-J及MG等疫病感染期內(nèi),且感染率呈上升趨勢(shì)。而雞群的傳支、流感及新城疫抗體具有良好的水平,并未發(fā)現(xiàn)因雞群感染免疫抑制病后對(duì)雞群的影響[5]。

        從該雞群的后期防控來看,可以通過使用提高機(jī)體抵抗力的中藥來降低免疫抑制病對(duì)雞群的危害,同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、進(jìn)行帶雞消毒,減少環(huán)境中的病毒細(xì)菌載量,降低機(jī)體呼吸系統(tǒng)中病原的載量,最終降低在活躍期的MG及REV等對(duì)生產(chǎn)的影響[6]。

        實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)已經(jīng)對(duì)動(dòng)物疫病診斷發(fā)揮了重要作用,同時(shí)也起到了預(yù)警作用,進(jìn)一步建立并完善動(dòng)物疫病防控體系,將為畜禽生產(chǎn)帶來更大價(jià)值。

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