聶曉寧,李閏婷,陳龍欣,李玉華,聶文營,張麗萌,王林青
(鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實驗室,河南 鄭州 450044)
卵巢是雌性動物體內(nèi)最重要的生殖器官,可產(chǎn)生卵母細胞和分泌生殖激素,直接影響動物的產(chǎn)羔性能[1]。目前的研究結(jié)果顯示,在綿羊繁殖調(diào)控機制研究中有眾多的因子和蛋白在發(fā)揮調(diào)控作用,但大多數(shù)并沒有深入研究。前期研究結(jié)果分析FHL2蛋白在調(diào)控綿羊繁殖性能方面有可能發(fā)揮著重要的作用,深入研究其生物學(xué)功能及作用機制也至關(guān)重要。
FHL2屬于含有4個半LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白家族重要成員之一[2],由279個氨基酸殘基組成,有7個外顯子和6個內(nèi)含子,僅有4個外顯子編碼FHL2蛋白,可以與不同的結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等相互作用發(fā)揮功能[3]。有研究顯示,F(xiàn)HL2能夠與多種蛋白(FOXO1、β-catenin)等互作,直接或間接地調(diào)控細胞增殖、凋亡和周期的相關(guān)蛋白因子等的表達水平,從而影響細胞的凋亡、周期。因此,深入研究FHL2蛋白在綿羊卵巢中的生物學(xué)功能尤為重要。本研究對綿羊FHL2基因序列進行克隆并表達,制備重組FHL2蛋白,通過免疫BALB/c小鼠,制備抗FHL2基因的多克隆抗體,以期為研究FHL2蛋白的生物學(xué)功能及在繁殖調(diào)控中的作用機制提供良好的基礎(chǔ)材料。
pET28a-sumo載體和pEGFP-C1-FHL2質(zhì)粒均鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實驗室保存;4~6周齡雌性BALB/c小鼠由河南省實驗動物中心所提供。
Pfu酶、質(zhì)粒小提試劑盒,均購自全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ,購自NEB公司; HRP標記的His單克隆抗體,HRP標記的羊抗鼠IgG,購自武漢三鷹; IPTG、咪唑,購自生工生物工程股份有限公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司。
利用TRIzol法提取綿羊卵巢組織的RNA,用Pfu酶進行PCR擴增FHL2基因,克隆至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞并送測序。
將雙酶切后的產(chǎn)物連接至pET28a- sumo線性化載體,37℃ 連接30 min,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落用T7-PF /T7-Term進行PCR菌落鑒定并測序。挑取E.coliBL21(DE3)/pET28a-sumo-FHL2單個菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中,37℃ 260 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,加入0.5 M IPTG,30℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h誘導(dǎo)表達蛋白;10 000 r/min離心收集誘導(dǎo)表達后的細菌沉淀,分別收集上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測。
將種子液按照1:100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃、260 r/min培養(yǎng)至OD600=0.5時,加入0.5 M IPTG,30℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h誘導(dǎo)表達蛋白;10 000 r/min離心收集誘導(dǎo)表達后的細菌沉淀,用20 mL PBS 重新懸浮細菌沉淀,充分重懸;-80℃反復(fù)凍融3次后,超聲破碎,4℃,12 000 r/min 離心20 min。將離心后的上清液進行Ni-NTA親和層析純化,收集洗脫產(chǎn)物濃縮后測定濃度。取5μg 純化的蛋白進行SDS-PAGE和Western-blot鑒定結(jié)果。
取4~6周齡雌性BALB/c小鼠3只,將純化的FHL2重組蛋白按100 μg/次的量免疫小鼠。首次免疫,將弗氏完全佐劑與FHL2蛋白等體積混勻后多點皮下注射小鼠背部。二免和三免用FHL2重組蛋白和弗氏不完全佐劑混勻乳化,每次間隔2周進行,三免后10 d尾部采血測定抗體效價。
轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-FHL2質(zhì)粒至HEK 293F細胞,24 h收集細胞后提取蛋白,100℃煮樣10 min進行 SDS-PAGE,轉(zhuǎn)至NC膜上,以多克隆抗體(1:2 000)和HRP 標記的山羊抗鼠IgG分別為一抗和二抗進行Western-blot檢測。將純化的FHL2蛋白包被96孔板,包被封閉后加入不同濃度的FHL2多克隆抗體,二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG,顯色后ELISA分析結(jié)果。
以提取的綿羊卵巢組織反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,通過RT-PCR成功擴增獲得綿羊FHL2基因,大小約864 bp(見圖1),與預(yù)期結(jié)果大小一致。
M-Trans2K?Plus DNA Marker;1-FHL2基因擴增產(chǎn)物
挑取4個單菌落進行PCR菌落鑒定并送測序,測序結(jié)果經(jīng)MegAlign軟件比對分析,序列正確未發(fā)生堿基突變,氨基酸同源性100%。表明成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET28a-sumo-FHL2。
SDS-PAGE結(jié)果表明,重組蛋白FHL2大小約48 ku(見圖2A)。通過Ni-NTA蛋白純化系統(tǒng)純化蛋白,將FHL2蛋白轉(zhuǎn)至NC膜后,結(jié)果顯示在48 ku處出現(xiàn)明顯蛋白條帶(見圖2B)。
A:M-PageRuler Prestained Protein Ladder;1-誘導(dǎo)后pET28a-sumo-FHL2超聲破碎上清(+DTT);2-未誘導(dǎo)pET28a-sumo-FHL2表達的全菌體蛋白(+DTT);3-誘導(dǎo)后pET28a-sumo-FHL2超聲破碎上清(-DTT);4-未誘導(dǎo)pET28a-sumo-FHL2表達的全菌體蛋白(-DTT);B:M-PageRuler Prestained Protein Ladder;1-重組蛋白FHL2
轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1-FHL2,24 h后收取細胞裂解液進行Western-blot。結(jié)果顯示可檢測到大小約48 ku的特異性目的條帶,表明制備的抗體可與FHL2蛋白反應(yīng),具有良好的特異性。將血清抗體進行梯度抗體稀釋,檢測結(jié)果表明血清抗體進行1:6 400倍稀釋后仍可與FHL2蛋白進行特異性結(jié)合。
FHL2是FHL家族蛋白中研究最多的,因所具有的特殊結(jié)構(gòu)和特性,通過與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等相互作用發(fā)揮多種生物學(xué)功能。Zhang等在綿羊卵巢顆粒細胞中利用siRNA抑制FHL2的表達,結(jié)果顯示能夠抑制細胞凋亡,促進細胞生長。在小鼠卵泡顆粒細胞中,F(xiàn)HL2通過結(jié)合不同轉(zhuǎn)錄因子,直接調(diào)控INHA 和P450scc的表達。因此,推測FHL2在哺乳動物的卵泡發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用,且目前無專門特異性針對綿羊的FHL2抗體。因此,需要通過人工制備FHL2多克隆抗體來解決這一問題。
本研究選擇pET系列載體主要優(yōu)點包括以下幾個:具有構(gòu)建效率高、蛋白表達量高、僅有6個His組氨酸,標簽小、易于分離純化等諸多優(yōu)勢。在本試驗中所選擇的pET28a載體上帶有sumo序列,它可促進易形成包涵體蛋白的可溶性表達[4]。試驗中選擇E.coilBL21(DE3)表達系統(tǒng),該菌株敲除了蛋白酶,并溶源了噬菌體DE3,具備遺傳背景清晰、目的基因表達水平高等特點,也因此成為重組蛋白克隆表達的首選表達系統(tǒng)。本試驗以綿羊卵巢組織為材料,通過PCR擴增、酶切PCR產(chǎn)物及載體等方法,成功構(gòu)建出pET28a-sumo-FHL2重組原核表達載體,加入0.5M IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后SDS-PAGE檢測顯示重組FHL2蛋白能夠可溶性表達。以重組蛋白FHL2免疫BALB/c小鼠,制備抗FHL2多克隆抗體。試驗中又通過轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-FHL2質(zhì)粒,采用Western-blot方法對FHL2特異性進行鑒定,證明制備的多抗血清與重組蛋白FHL2有特異性反應(yīng)。因此,本研究成功構(gòu)建重組蛋白pET28a-sumo-FHL2并制備了具有良好特異性的FHL2多克隆抗體,為后續(xù)用于研究FHL2蛋白生物學(xué)功能和綿羊繁殖調(diào)控機制提供了良好的檢測材料。