聶曉寧，李閏婷，陳龍欣，李玉華，聶文營，張麗萌，王林青

(鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實驗室，河南 鄭州 450044)

0 引言

卵巢是雌性動物體內(nèi)最重要的生殖器官，可產(chǎn)生卵母細(xì)胞和分泌生殖激素，直接影響動物的產(chǎn)羔性能[1]。目前的研究結(jié)果顯示，在綿羊繁殖調(diào)控機(jī)制研究中有眾多的因子和蛋白在發(fā)揮調(diào)控作用，但大多數(shù)并沒有深入研究。前期研究結(jié)果分析FHL2蛋白在調(diào)控綿羊繁殖性能方面有可能發(fā)揮著重要的作用，深入研究其生物學(xué)功能及作用機(jī)制也至關(guān)重要。

FHL2屬于含有4個半LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白家族重要成員之一[2]，由279個氨基酸殘基組成，有7個外顯子和6個內(nèi)含子，僅有4個外顯子編碼FHL2蛋白，可以與不同的結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等相互作用發(fā)揮功能[3]。有研究顯示，F(xiàn)HL2能夠與多種蛋白(FOXO1、β-catenin)等互作，直接或間接地調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和周期的相關(guān)蛋白因子等的表達(dá)水平，從而影響細(xì)胞的凋亡、周期。因此，深入研究FHL2蛋白在綿羊卵巢中的生物學(xué)功能尤為重要。本研究對綿羊FHL2基因序列進(jìn)行克隆并表達(dá)，制備重組FHL2蛋白，通過免疫BALB/c小鼠，制備抗FHL2基因的多克隆抗體，以期為研究FHL2蛋白的生物學(xué)功能及在繁殖調(diào)控中的作用機(jī)制提供良好的基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料和菌株

pET28a-sumo載體和pEGFP-C1-FHL2質(zhì)粒均鄭州師范學(xué)院分子生物學(xué)實驗室保存；4～6周齡雌性BALB/c小鼠由河南省實驗動物中心所提供。

1.2 主要試劑

Pfu酶、質(zhì)粒小提試劑盒，均購自全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ，購自NEB公司； HRP標(biāo)記的His單克隆抗體，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，購自武漢三鷹； IPTG、咪唑，購自生工生物工程股份有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司。

1.3 引物設(shè)計和合成

1.4 綿羊FHL2基因的克隆

利用TRIzol法提取綿羊卵巢組織的RNA，用Pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增FHL2基因，克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞并送測序。

1.5 重組載體pET28a-sumo-FHL2的構(gòu)建及表達(dá)

將雙酶切后的產(chǎn)物連接至pET28a- sumo線性化載體，37℃ 連接30 min，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落用T7-PF /T7-Term進(jìn)行PCR菌落鑒定并測序。挑取E.coliBL21(DE3)/pET28a-sumo-FHL2單個菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 260 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，加入0.5 M IPTG，30℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；10 000 r/min離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌沉淀，分別收集上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.6 FHL2目的蛋白的純化

將種子液按照1：100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、260 r/min培養(yǎng)至OD600=0.5時，加入0.5 M IPTG，30℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；10 000 r/min離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌沉淀，用20 mL PBS 重新懸浮細(xì)菌沉淀，充分重懸；-80℃反復(fù)凍融3次后，超聲破碎，4℃，12 000 r/min 離心20 min。將離心后的上清液進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化，收集洗脫產(chǎn)物濃縮后測定濃度。取5μg 純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot鑒定結(jié)果。

1.7 動物免疫和多克隆抗體的制備

取4～6周齡雌性BALB/c小鼠3只，將純化的FHL2重組蛋白按100 μg/次的量免疫小鼠。首次免疫，將弗氏完全佐劑與FHL2蛋白等體積混勻后多點(diǎn)皮下注射小鼠背部。二免和三免用FHL2重組蛋白和弗氏不完全佐劑混勻乳化，每次間隔2周進(jìn)行，三免后10 d尾部采血測定抗體效價。

1.8 多克隆抗體的Western blot分析及效價檢測

轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-FHL2質(zhì)粒至HEK 293F細(xì)胞，24 h收集細(xì)胞后提取蛋白，100℃煮樣10 min進(jìn)行 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至NC膜上，以多克隆抗體(1：2 000)和HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG分別為一抗和二抗進(jìn)行Western-blot檢測。將純化的FHL2蛋白包被96孔板，包被封閉后加入不同濃度的FHL2多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，顯色后ELISA分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 FHL2基因的克隆

以提取的綿羊卵巢組織反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，通過RT-PCR成功擴(kuò)增獲得綿羊FHL2基因，大小約864 bp(見圖1)，與預(yù)期結(jié)果大小一致。

M-Trans2K?Plus DNA Marker；1-FHL2基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

挑取4個單菌落進(jìn)行PCR菌落鑒定并送測序，測序結(jié)果經(jīng)MegAlign軟件比對分析，序列正確未發(fā)生堿基突變，氨基酸同源性100%。表明成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-sumo-FHL2。

2.3 FHL2蛋白的表達(dá)鑒定

SDS-PAGE結(jié)果表明，重組蛋白FHL2大小約48 ku(見圖2A)。通過Ni-NTA蛋白純化系統(tǒng)純化蛋白，將FHL2蛋白轉(zhuǎn)至NC膜后，結(jié)果顯示在48 ku處出現(xiàn)明顯蛋白條帶(見圖2B)。

A：M-PageRuler Prestained Protein Ladder；1-誘導(dǎo)后pET28a-sumo-FHL2超聲破碎上清(+DTT)；2-未誘導(dǎo)pET28a-sumo-FHL2表達(dá)的全菌體蛋白(+DTT)；3-誘導(dǎo)后pET28a-sumo-FHL2超聲破碎上清(-DTT)；4-未誘導(dǎo)pET28a-sumo-FHL2表達(dá)的全菌體蛋白(-DTT)；B：M-PageRuler Prestained Protein Ladder；1-重組蛋白FHL2

2.4 多克隆抗體免疫原性和抗體效價檢測

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C1-FHL2，24 h后收取細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western-blot。結(jié)果顯示可檢測到大小約48 ku的特異性目的條帶，表明制備的抗體可與FHL2蛋白反應(yīng)，具有良好的特異性。將血清抗體進(jìn)行梯度抗體稀釋，檢測結(jié)果表明血清抗體進(jìn)行1：6 400倍稀釋后仍可與FHL2蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合。

3 討論

FHL2是FHL家族蛋白中研究最多的，因所具有的特殊結(jié)構(gòu)和特性，通過與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等相互作用發(fā)揮多種生物學(xué)功能。Zhang等在綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中利用siRNA抑制FHL2的表達(dá)，結(jié)果顯示能夠抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長。在小鼠卵泡顆粒細(xì)胞中，F(xiàn)HL2通過結(jié)合不同轉(zhuǎn)錄因子，直接調(diào)控INHA 和P450scc的表達(dá)。因此，推測FHL2在哺乳動物的卵泡發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，且目前無專門特異性針對綿羊的FHL2抗體。因此，需要通過人工制備FHL2多克隆抗體來解決這一問題。

本研究選擇pET系列載體主要優(yōu)點(diǎn)包括以下幾個：具有構(gòu)建效率高、蛋白表達(dá)量高、僅有6個His組氨酸，標(biāo)簽小、易于分離純化等諸多優(yōu)勢。在本試驗中所選擇的pET28a載體上帶有sumo序列，它可促進(jìn)易形成包涵體蛋白的可溶性表達(dá)[4]。試驗中選擇E.coilBL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)，該菌株敲除了蛋白酶，并溶源了噬菌體DE3，具備遺傳背景清晰、目的基因表達(dá)水平高等特點(diǎn)，也因此成為重組蛋白克隆表達(dá)的首選表達(dá)系統(tǒng)。本試驗以綿羊卵巢組織為材料，通過PCR擴(kuò)增、酶切PCR產(chǎn)物及載體等方法，成功構(gòu)建出pET28a-sumo-FHL2重組原核表達(dá)載體，加入0.5M IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后SDS-PAGE檢測顯示重組FHL2蛋白能夠可溶性表達(dá)。以重組蛋白FHL2免疫BALB/c小鼠，制備抗FHL2多克隆抗體。試驗中又通過轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-FHL2質(zhì)粒，采用Western-blot方法對FHL2特異性進(jìn)行鑒定，證明制備的多抗血清與重組蛋白FHL2有特異性反應(yīng)。因此，本研究成功構(gòu)建重組蛋白pET28a-sumo-FHL2并制備了具有良好特異性的FHL2多克隆抗體，為后續(xù)用于研究FHL2蛋白生物學(xué)功能和綿羊繁殖調(diào)控機(jī)制提供了良好的檢測材料。