褚婉婷， 張淑香， 褚星霞

（1.固原市人民醫(yī)院呼吸科，寧夏固原 756000；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，寧夏銀川 750004）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種緩慢進展的呼吸系統(tǒng)疾病，伴有慢性肺部炎癥和不可逆的氣流受限[1]。探討COPD 的發(fā)生機制和治療方法具有重要的意義。有研究[2-3]報道，Nrf2的下調(diào)與COPD 患者肺部氧化應(yīng)激的增強和發(fā)病機理有關(guān)。核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）是堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子Cap’n’Coall 家族的成員，在上皮和肺泡巨噬細胞中表達[4-5]。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化劑基因表達與細胞存活之間的重要鏈接，其上調(diào)和激活可增強抗氧化劑基因的表達，并保護細胞免受氧化損傷[6]。從葡萄籽和松樹皮中提取的寡聚原花色素（oligomeric proanthocyanidins，OPC）可減輕哮喘氣道炎癥反應(yīng)，增強COPD 患者的抗氧化能力并改善脂譜[7-9]。因此，本研究擬觀察OPC 通過激活Nrf2對香煙煙霧和脂多糖（LPS）聯(lián)合誘導(dǎo)的COPD 模型大鼠氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用，以期為OPC臨床治療COPD提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物30 只雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（200 ±20）g，購自上海SIPPR/BK 實驗動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號:SCXK 2008-0016。將動物飼養(yǎng)在溫度為（25±20）℃，濕度為（50±2）%，光照12 h/黑暗12 h 的環(huán)境中。暴露前后，所有動物均可自由飲水和進食。所有動物實驗均按照美國國立衛(wèi)生研究院關(guān)于實驗動物的護理和使用的準(zhǔn)則進行。

1.2藥物、試劑與儀器OPC（純度＞99.80%）購自天津一方科技有限公司，批號:XR170314；地塞米松（DXM）購自上海信誼藥廠有限公司，批號:18032。非過濾嘴香煙（每支香煙含有1.3 mg尼古丁、13 mg 焦油碳和14 mg 一氧化碳）（湖南中研實業(yè)有限公司）；LPS 凍干粉（美國Sigma 公司）；其他所有化學(xué)品和試劑均為分析級；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；兔抗8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）抗體（英國Abcam Technology 公司）；細胞質(zhì)和核提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗醌氧化還原酶（NQO1）抗體、兔抗血紅素氧合酶1（HO1）抗體、兔抗Nrf2 抗體、兔抗GAPDH 抗體（美國Santa Cruz Biotechnology 公司）。WT40 檢測器（上海威泰科技有限公司）；AniRes2005 動物肺功能系統(tǒng)（北京貝蘭博科技有限公司）；CX31 顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3分組、動物建模與給藥將大鼠隨機分為5組，即正常組、模型組、OPC 低劑量組、OPC 高劑量組、DXM 組，每組6 只。除正常組外，其他各組大鼠均建立COPD 模型[10]。方法:將大鼠置于與真空泵相連的240-L 有機玻璃室中，把6 支香煙的煙氣抽入室中，每天保持60 min，持續(xù)4 周。用WT40 檢測器測量室內(nèi)一氧化碳濃度，使保持在1 000 ～1 200 ppm 之間。第1、14天，氯胺酮/二甲苯胺麻醉大鼠，經(jīng)鼻滴注LPS（2 mg/kg），然后使大鼠保持直立位置15 s，以促進LPS 在肺部的分布。依據(jù)癥狀、肺功能和肺組織病理等確定模型成功與否[11]。參照研究[12]報道，OPC 低、高劑量組大鼠從第1 ～28 天分別給予OPC 20.0、80.0 mg·kg-1·d-1連續(xù)灌胃。DXM 組大鼠從第8 天開始灌胃DXM 0.2 mg·kg-1·d-1，持續(xù)3 周。正常組采用新鮮空氣和生理鹽水代替。

1.4觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 肺功能評價 第29天，大鼠麻醉后氣管插管，使用AniRes2005 動物肺功能系統(tǒng)檢測肺功能。該軟件自動記錄的參數(shù)包括:第0.3 秒用力呼氣容積/用力肺活量（FEV0.3/ FVC）、最大呼氣中段流量（MMF）、呼氣峰值流量（PEF）速率和動態(tài)肺順應(yīng)性（Cydn）。

1.4.2 肺標(biāo)本采集 對大鼠進行肺功能評價后，從心臟針刺放血。在大鼠停止呼吸后，收集肺組織，用冰（4 ℃）生理鹽水灌洗，立即轉(zhuǎn)移到液氮中。

1.4.3 氧化應(yīng)激狀態(tài)評價 應(yīng)用相關(guān)試劑盒測定肺組織勻漿液中脂質(zhì)過氧化物標(biāo)記物MDA、GSH水平。

1.4.4 組織病理學(xué)評價 取大鼠右下肺組織用40 g/L 多聚甲醛固定24 h，在酒精中脫水12 h，包埋在石蠟中，切片，用蘇木素-伊紅染色，并固定在載玻片上。應(yīng)用顯微鏡進行觀察與拍攝，測定反映肺泡大小的指標(biāo)——平均線性截距（MLI）和反映肺泡密度的指標(biāo)——平均肺泡數(shù)（MAN）來評估肺氣腫的程度。針對每個指標(biāo)，均隨機選擇6個視野計算平均值。

1.4.5 免疫組織化學(xué)評價 將石蠟包埋肺組織切片，脫蠟和再水化后，在蒸汽壓力鍋中用檸檬酸緩沖液進行抗原修復(fù)2 min，切片迅速冷卻至室溫。用體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫（H2O2）封閉內(nèi)源性過氧化物酶。加入抗8-OHdG 抗體（1∶300 稀釋）后于4 ℃培養(yǎng)過夜。于室溫用二抗孵育20 min。使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液對切片進行顯影，并用蘇木素復(fù)染。應(yīng)用顯微鏡隨機選擇5 個視野進行觀察。

1.4.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）分析 用冰裂解 緩 沖 液[含 有50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），150 mmol/L NaCl，1%NP-40、0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS），1 mmol/L 蛋白酶抑制劑混合物和蛋白質(zhì)磷酸酶抑制劑]裂解細胞，于4 ℃勻漿15 s 4 ～5次，將細胞裂解物于4 ℃、以12 000× g 離心30 min 除去細胞碎片。用細胞質(zhì)和核提取試劑盒制備細胞質(zhì)和核裂解物，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。在8%～10%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）分離等量的蛋白質(zhì)（20 ～60 mg），并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。于室溫將膜在50 g/L 脫脂牛奶中封閉2 h。分別加入NQO1 抗體（1∶500 稀釋）、HO1 抗體（1∶1 000 稀釋）、Nrf2 抗體（1∶500 稀釋）和GAPDH 抗體（1∶2 000 稀釋）于4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫孵育2 h。用電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑對蛋白條帶進行可視化。最后使用Quantity One 軟件（美國Bio-Rad實驗室）對條帶密度進行定量。

1.5統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析進行組間比較，然后進行Tukey 事后檢驗或Games-Howell檢驗，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OPC改善COPD大鼠肺功能圖1 結(jié)果顯示:與正常組比較，模型組大鼠的FEV0.3/FVC、MMF、PEF、Cydn均顯著降低（P ＜0.05）。與模型組比較，OPC 高劑量組與DXM 組大鼠肺功能指標(biāo)FEV0.3/FVC、MMF、PEF、Cydn 均升高（P ＜0.05），且各治療組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

2.2 OPC減輕COPD引起的肺氣腫圖2-A 結(jié)果顯示:正常組肺部無明顯病變，支氣管上皮組織和肺泡壁完好無損，偶見炎性細胞浸潤。模型組肺部出現(xiàn)明顯的病變，可見大量炎性細胞（特別是中性粒細胞）浸潤組織，許多漿細胞浸潤肺泡間隙，肺泡壁增厚，肺泡擴張，支氣管上皮組織脫落并缺失。與模型組比較，OPC 低、高劑量組肺組織病變程度明顯減輕，高劑量組輕于低劑量組。此外，采用MAN 和MLI 評估肺氣腫的嚴(yán)重程度。圖2-B、-C 結(jié)果顯示:與正常組比較，模型組大鼠MLI 顯著增加，MAN 顯著降低（均P ＜0.01）；與模型組比較，OPC 低、高劑量組與DXM組MLI 顯著降低，MAN 顯著增加（P ＜0.05 或P ＜0.01），且各治療組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

圖1 各組大鼠肺功能指標(biāo)FEV0.3/FVC（A）、MMF（B）、PEF（C）、Cydn（D）值比較Figure 1 Comparison of FEV0.3/FVC（A），MMF（B），PEF（C）and Cydn（D）values in various groups

圖2 各組大鼠肺氣腫指標(biāo)比較Figure 2 Comparison of rat emphysema lung indexes in various groups

圖3 各組大鼠肺組織中8-OHdG表達比較Figure 3 Comparison of the expression level of 8-OHdG in lung tissue of various groups

2.3 OPC減輕COPD大鼠的氧化應(yīng)激圖3 結(jié)果顯示:與正常組比較，模型組大鼠肺組織8-OHdG平均光密度顯著升高（P ＜0.01）。與模型組比較，OPC 低、高劑量組與DXM 組大鼠肺組織8-OHdG平均光密度顯著降低（P ＜0.05 或P ＜0.01），且各治療組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。圖4結(jié)果顯示:與正常組比較，模型組大鼠肺組織MDA 水平升高，GSH 水平降低（均P ＜0.01）；與模型組比較，OPC 低、高劑量組與DXM 組大鼠肺組織MDA 水平降低，GSH 水平升高（均P ＜0.01），且治療組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

2.4 OPC激活Nrf2及其下游蛋白HO1和NQO1表達并拮抗氧化應(yīng)激圖5 結(jié)果顯示: 與正常組比較，模型組大鼠肺組織Nrf2 的細胞質(zhì)、核和全細胞裂解物蛋白表達（分別為n-Nrf2、c-Nrf2 和t-Nrf2）、HO1 和NQO1 的表達水平顯著降低（P ＜0.01 或P ＜0.001）。與模型組比較，OPC 低、高劑量 組 與DXM 組n-Nrf2、c-Nrf2、t-Nrf2、HO1、NQO1 的表達水平顯著升高（P ＜0.05 或P ＜0.01 或P ＜0.001）。

圖4 各組肺組織勻漿中MDA（A）、GSH（B）水平比較Figure 4 Comparison of the levels of MDA and GSH in lung homogenate of various groups

圖5 各組大鼠肺組織Nrf2活化及其下游蛋白HO1、NQO1表達的比較Figure 5 Comparison of Nrf2 activation and its downstream protein HO1，NQO1 expression in lung tissue of various groups

3 討論

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的發(fā)病機制非常復(fù)雜，目前仍不完全清楚，但它與氧化應(yīng)激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡和炎癥反應(yīng)有關(guān)。LPS 和香煙煙霧已成為研究COPD 的首選刺激物[13]。吸煙是造成COPD 的最重要因素，主要表現(xiàn)為小氣道疾病和肺氣腫。香煙煙霧中含有大量的氧化劑和有毒物質(zhì)，可引起慢性炎癥，其被認(rèn)為是導(dǎo)致COPD 發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵機制。LPS是空氣污染物中革蘭氏陰性菌細胞壁的一個組成部分。細菌侵入生物體后，其細胞壁的LPS觸發(fā)單核細胞、巨噬細胞釋放炎性因子，在氣道和肺組織中誘發(fā)炎癥反應(yīng)。本研究采用吸入煙霧和氣管內(nèi)滴注LPS的方法建立大鼠COPD 模型，結(jié)果顯示模型組大鼠的FEV0.3/FVC、MMF、PEF、Cydn 水平較正常組均顯著降低，并可見肺組織受到嚴(yán)重損害，存在支氣管黏膜上皮細胞壞死和變性，肺泡間隙漿液性滲出，支氣管壁炎性細胞浸潤和肺氣腫，MLI較正常組增加，MAN 較正常組降低，與臨床觀察到的COPD癥狀相似，表明采用吸入煙霧和氣管內(nèi)滴注LPS的方法可成功建立COPD大鼠模型。

Nrf2 是調(diào)控細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2及其下游目標(biāo)抗氧化劑基因的功能已被證明對于細胞抗氧化劑損傷具有非常重要的作用[14]。Nrf2信號通路被認(rèn)為在香煙煙霧引起的肺氣腫中起關(guān)鍵作用。暴露于香煙煙霧中的Nrf2 缺陷小鼠表現(xiàn)出較早發(fā)作和更嚴(yán)重的肺氣腫[15]。體內(nèi)和體外接觸香煙煙霧后，Nrf2 表達均增強，這意味著Nrf2有助于維持健康適應(yīng)性[16]。然而，COPD 患者肺實質(zhì)細胞和肺泡巨噬細胞中的Nrf2 均下調(diào)，這可能是COPD 患者體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡的原因[17]。本研究結(jié)果顯示，香煙煙霧和LPS 聯(lián)合誘導(dǎo)下調(diào)COPD 大鼠肺組織Nrf2 蛋白的表達、減少Nrf2 分子的核進入，同時下調(diào)Nrf2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的抗氧化酶HO1 和解毒酶NQO1 的表達，并增加氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA 損傷標(biāo)志物8-OHdG 和脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA 水平，以及降低大鼠肺組織的抗氧化應(yīng)激標(biāo)志物GSH 活性。這些數(shù)據(jù)與既往研究[13]一致，表明Nrf2下調(diào)在介導(dǎo)香煙煙霧和LPS誘導(dǎo)的肺細胞氧化應(yīng)激甚至肺氣腫的發(fā)生中具有驅(qū)動作用。

在本研究中，我們首先觀察了寡聚原花色素（OPC）對香煙煙霧和LPS 引起肺氣腫的潛在作用，結(jié)果表明，OPC 干預(yù)可有效改善COPD 大鼠的肺功能，明顯緩解肺氣腫癥狀，且高劑量OPC 療效與地塞米松相當(dāng)。本研究結(jié)果還表明，以低、高劑量OPC干預(yù)后均可上調(diào)COPD大鼠肺組織Nrf2蛋白的表達，增加Nrf2 的核進入，并增強抗氧化酶HO1和解毒酶NQO1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。同時，不同劑量的OPC 能夠下調(diào)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA 損傷標(biāo)志物8-OHdG 與脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA 水平，這與肺氣腫的緩解程度有關(guān)。因此，推測OPC 可能通過激活肺組織Nrf2，上調(diào)HO1、NQO1的表達，減輕香煙煙霧和LPS 誘導(dǎo)的COPD 氧化應(yīng)激。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織中不僅Nrf2的核移位下調(diào)，而且胞質(zhì)Nrf2 的表達也下調(diào)，這種現(xiàn)象可以解釋為香煙煙霧和LPS 所致COPD 大鼠肺細胞Nrf2 的不穩(wěn)定性，OPC 的作用可能是通過穩(wěn)定肺細胞Nrf2分子來維持機體在克服吸煙和LPS慢性暴露中的健康適應(yīng)。

綜上所述，OPC 治療可有效緩解大鼠COPD，其機制可能是通過激活Nrf2 緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕香煙煙霧和LPS 誘發(fā)的COPD 大鼠的肺氣腫癥狀。