胡波， 徐穎， 丁輝， 方學(xué)奇， 王天寶

（1.河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)部，河南鄭州 450000；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院藥劑科，河南鄭州 450007；3.河南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南鄭州 450000；4.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，河南鄭州 450007；5.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝臟中心，河南衛(wèi)輝 453100）

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）指由非酒精因素導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積的慢性肝病，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)形式[1]。NAFLD 與胰島素抵抗[2]、糖尿病[3]、肥胖[4]、遺傳易感性[5]密切相關(guān)，可從單純性脂肪肝發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化，甚至是肝癌[6]。隨著肥胖人群的增多，伴隨的代謝綜合征使這部分肥胖人群患上NAFLD 的風(fēng)險(xiǎn)大大提高[7]。因此，防治NAFLD 具有重要的意義。葛根，為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi或甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，味甘、辛，性平，入脾、胃經(jīng)，可解肌退熱，透疹，生津，止瀉。葛根素（puerarin）是從葛根中提取的單體，分子式為C21H20O9，分子量為416，具有舒張血管[8]、抗氧化[9]、抗癌[10]、抗炎[11]、減輕胰島素抵抗[12]等廣泛藥理活性，可用于防治NAFLD。有研究[13]顯示，核因子（NF）κB 抑制劑α（IκBα）/NF-κB p65 途徑在胰島素抵抗的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。本研究旨在探討葛根素通過IκBα/NF-κB p65 途徑對(duì)NAFLD 大鼠肝功能和脂代謝作用的影響，以期為其在NAFLD 的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物60 只SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，6 ～8 周齡，體質(zhì)量（200 ± 20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SCXK（京）2018-0002。將大鼠飼養(yǎng)于室溫25 ℃左右、濕度50%的環(huán)境中，提供12 h 的正常光照條件，并提供清潔飲水。

1.2藥物葛根素（由中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào):110752-201816）；多烯磷脂酰膽堿膠囊（成都天臺(tái)山制藥有限公司，批號(hào):160220）。

1.3試劑與儀器蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（上海碧云天公司）；改良油紅O 染色液（北京索萊寶公司）；Caspase-3、Caspase-9、IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、GAPDH 等抗體（美國Abcam 公司）；增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（南京諾唯贊生物公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、一氧化氮合酶（iNOS）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（南京建成生物研究所）。垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印儀、ChemiDoc MP 凝膠成像儀、酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；全自動(dòng)生化分析儀（南京基蛋生物公司）。

1.4分組、造模與給藥將60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，葛根素低、中、高劑量組，多烯磷脂酰膽堿組，每組10 只。正常對(duì)照組用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，其他4 組每天用高脂飼料（標(biāo)準(zhǔn)飼料的基礎(chǔ)上加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%豬油、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉）喂養(yǎng)構(gòu)建NAFLD 模型，另外，多烯磷脂酰膽堿組給予多烯磷脂酰膽堿50 mg·kg-1·d-1灌胃[14]，葛根素低、中、高劑量組分別給予葛根素10、50、100 mg·kg-1·d-1灌胃[15-16]，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等容量9.0 g/L氯化鈉溶液灌胃，均連續(xù)灌胃12周。通過NAFLD模型大鼠肝功能異常及病理變化的結(jié)果可判斷造模成功與否。

1.5觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 HE 染色觀察大鼠肝臟組織病理變化 處死大鼠后，打開腹腔取出肝臟，將肝臟剪切成組織塊并經(jīng)40 g/L 多聚甲醛溶液固定48 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后制作石蠟切片。按照HE 染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.5.2 油紅O染色觀察大鼠肝臟脂肪堆積情況 制作5 μm 厚肝臟冰凍切片，并使用體積分?jǐn)?shù)為10%福爾馬林溶液固定10 min，清洗后置于體積分?jǐn)?shù)60%異丙醇內(nèi)浸洗30 s，使用油紅O 染液染色10 min。60%異丙醇分化處理5 min，清洗后經(jīng)蘇木素復(fù)染1 min，自來水漂洗10 min，吸干水分后使用甘油明膠封片，顯微鏡下觀察。鏡下可見肝細(xì)胞內(nèi)脂肪滴呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.5.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 經(jīng)腹主動(dòng)脈收集各組大鼠血液，以3 000 r/min離心15 min分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）水平。

1.5.4 ELISA 法檢測(cè)大鼠外周血中TNF-α、IL-6、iNOS 水平 具體操作步驟按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)大鼠肝組織中Caspase-3、Caspase-9 的表達(dá)及IkBα、NF-κB p65磷酸化情況 充分勻漿大鼠肝組織，并充分裂解，提取總蛋白。蛋白變性后，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，以50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉2 h，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗脫后分別孵育Caspase-3、Caspase-9、

IκBα、 p- IκBα、 NF- κB p65、 p- NF- κB p65、GAPDH 等一抗，孵育二抗，加入BCL 進(jìn)行曝光，用ImageJ軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較分析采用Bonferroni 法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1葛根素減輕NAFLD大鼠肝臟損傷表1 結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中ALT、AST含量顯著增高（P ＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，葛根素中、高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組ALT、AST 含量顯著降低（P ＜0.05）；與多烯磷脂酰膽堿組比較，葛根素高劑量組大鼠血清中ALT、AST含量無明顯差異（P ＞0.05）。圖1結(jié)果顯示:正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核居中，胞質(zhì)豐富，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型對(duì)照組大鼠肝臟中存在大量脂肪空泡，伴有肝細(xì)胞核固縮和炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞索排列紊亂；多烯磷脂酰膽堿組肝臟中無明顯脂肪空泡和脂肪變性表現(xiàn)，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，肝細(xì)胞索排列整齊，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤；經(jīng)葛根素治療后，各葛根素劑量組肝臟細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)，且隨葛根素劑量的增加大鼠肝臟病理學(xué)改變較模型對(duì)照組逐漸減輕。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST含量比較Table 1 Comparison of the serum contents of ALT and AST of rats in various groups（±s，U·L-1）

表1 各組大鼠血清中ALT、AST含量比較Table 1 Comparison of the serum contents of ALT and AST of rats in various groups（±s，U·L-1）

①P ＜0.05，與正常對(duì)照組比較；②P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較；③P ＜0.05，與多烯磷脂酰膽堿組比較

AST 45.34±9.39 87.02±14.45①59.58±12.14②82.19±18.54 63.36±10.42②③47.07±9.27②組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組多烯磷脂酰膽堿組葛根素低劑量組葛根素中劑量組葛根素高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 ALT 24.87±15.36 147.23±25.12①68.64±16.93②143.02±21.67 94.19±18.54②③59.21±15.49②

2.2葛根素緩解NAFLD大鼠肝臟炎癥反應(yīng)表2結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中TNF-α、iNOS 和IL-6 含量顯著增高（P ＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，葛根素中、高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組TNF-α、iNOS 和IL-6 含量顯著降低（P ＜0.05）；與多烯磷脂酰膽堿組比較，葛根素高劑量組大鼠血清中TNF-α、iNOS 和IL-6 含量無明顯差異（P ＞0.05）。

圖1 各組大鼠肝組織病理變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the morphological features of liver tissue of rats in various groups（by HE staining，×200）

2.3葛根素緩解NAFLD大鼠肝細(xì)胞凋亡圖2、表3結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織中Caspase-3 和Caspase-9 表達(dá)水平顯著上調(diào)（P ＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，葛根素中、高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組Caspase-3 和Caspase-9表達(dá)水平顯著下調(diào)（P ＜0.05）；與多烯磷脂酰膽堿組比較，葛根素高劑量組大鼠組織中Caspase-3 和Caspase-9 表達(dá)水平無明顯差異（P ＞0.05）。

表2 各組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、iNOS、IL-6含量比較Table 2 Comparison of the serum contents of inflammatory factor TNF-α，iNOS，IL-6 of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

表2 各組大鼠血清中炎癥因子TNF-α、iNOS、IL-6含量比較Table 2 Comparison of the serum contents of inflammatory factor TNF-α，iNOS，IL-6 of rats in various groups （±s，pg·mL-1）

①P ＜0.05，與正常對(duì)照組比較；②P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較；③P ＜0.05，與多烯磷脂酰膽堿組比較

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組多烯磷脂酰膽堿組葛根素低劑量組葛根素中劑量組葛根素高劑量組IL-6 15.03±0.35 96.35±15.43①41.12±7.35②89.53±14.26 57.19±10.28②③34.56±11.24②鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 TNF-α 25.27±1.38 164.65±25.23①57.66±6.98②158.73±26.67 95.19±14.52②③48.32±9.47②iNOS 42.08±8.39 218.12±34.45①83.01±15.14②207.48±28.54 121.83±17.42②③75.26±12.27②

圖2 各組大鼠肝組織中凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的Western Blot電泳條帶Figure 2 Western blotting strips of apoptosis protein Caspase-3，Caspase-9 in rat liver tissue of various groups

表3 各組大鼠肝組織中凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9相對(duì)表達(dá)量比較Table 3 Comparison of the relative expression contents of apoptosis protein Caspase-3，Caspase-9 in rat liver tissue of various groups （±s）

表3 各組大鼠肝組織中凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9相對(duì)表達(dá)量比較Table 3 Comparison of the relative expression contents of apoptosis protein Caspase-3，Caspase-9 in rat liver tissue of various groups （±s）

①P ＜0.05，與正常對(duì)照組比較；②P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較；③P ＜0.05，與多烯磷脂酰膽堿組比較

Caspase-9相對(duì)表達(dá)量0.02±0.01 0.24±0.04①0.04±0.01②0.21±0.02 0.09±0.06②③0.03±0.02②組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組多烯磷脂酰膽堿組葛根素低劑量組葛根素中劑量組葛根素高劑量組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 Caspase-3相對(duì)表達(dá)量0.00±0.02 0.37±0.06①0.05±0.01②0.32±0.01 0.11±0.05②③0.04±0.02②

2.4葛根素緩解NAFLD大鼠肝臟脂肪沉積圖3結(jié)果顯示:正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)清晰，胞質(zhì)透明，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，無明顯紅色脂滴；模型對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)中沉積大量脂肪；多烯磷脂酰膽堿組肝細(xì)胞形態(tài)較為清晰，鏡下僅見少紅色脂滴沉積；經(jīng)葛根素干預(yù)后，隨葛根素劑量增加，肝細(xì)胞中脂肪沉積逐漸減少，且在葛根素高劑量組中僅可見少量脂滴。

圖3 各組大鼠肝臟脂肪沉積情況比較（油紅O染色，×200）Figure 3 Comparison of hepatic fat deposition in various groups（by oil red O staining，×200）

2.5葛根素降低NAFLD大鼠血脂水平表4 結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中TC、TG和LDL含量顯著增加，而HDL含量顯著降低（P ＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，葛根素中、高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組血清中TC、TG 和LDL 含量顯著降低，而HDL 含量顯著增加（P ＜0.05）；與多烯磷脂酰膽堿組比較，葛根素高劑量組大鼠血清中TC、TG、LDL 和HDL 含量均無明顯差異（P ＞0.05）。

2.6葛根素抑制IκBα/NF-κB p65信號(hào)通路活性圖4、表5 結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織的p-IκBα/IκBα 比值和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值顯著上調(diào)（P ＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，葛根素中、高劑量組和多烯磷脂酰膽堿組p-IκBα/IκBα 比值和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值顯著下調(diào)（P ＜0.05）；與多烯磷脂酰膽堿組比較，葛根素高劑量組p-IκBα/IκBα 比值和p-NFκB p65/NF-κB p65 比 值 表 達(dá) 無 明 顯 差 異（P ＞0.05）。

表4 各組大鼠血脂水平比較Table 4 Comparison of the rat blood lipids levels of various groups（±s，mmol·L-1）

表4 各組大鼠血脂水平比較Table 4 Comparison of the rat blood lipids levels of various groups（±s，mmol·L-1）

①P ＜0.05，與正常對(duì)照組比較；②P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較；③P ＜0.05，與多烯磷脂酰膽堿組比較

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組多烯磷脂酰膽堿組葛根素低劑量組葛根素中劑量組葛根素高劑量組LDL 0.17±0.03 0.73±0.06①0.28±0.05②0.69±0.09 0.36±0.05②③0.21±0.03②鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 TC 1.23±0.34 4.64±0.54①1.72±0.35②4.48±0.62 2.35±0.34②③1.46±0.41②TG 0.42±0.09 1.79±0.25①0.68±0.14②1.66±0.34 1.01±0.12②③0.55±0.17②HDL 1.34±0.36 0.42±0.23①1.16±0.23②0.46±0.16 1.02±0.18②③1.38±0.44②

圖4 各組大鼠肝組織中p-IκBα、IκBα、p-NF-κB p65、NF-κB p65的Western Blot電泳條帶Figure 4 Western blotting strips of p-IκBα，IκBα，p-NF-κB p65，NF-κB p65 in rat liver tissue of various groups

表5 各組大鼠肝組織IκBα、NF-κB p65磷酸化水平的比較Table 5 Comparison of the phosphorylated expression levels of IκBα，NF-κB p65 in rat liver tissue of various groups （±s）

表5 各組大鼠肝組織IκBα、NF-κB p65磷酸化水平的比較Table 5 Comparison of the phosphorylated expression levels of IκBα，NF-κB p65 in rat liver tissue of various groups （±s）

①P ＜0.05，與正常對(duì)照組比較；②P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較；③P ＜0.05，與多烯磷脂酰膽堿組比較

p-NF-κB p65/NF-κB p65比值0.03±0.01 0.58±0.07①0.04±0.01②0.54±0.06 0.14±0.04②③0.05±0.02②組別鼠數(shù)（只）正常對(duì)照組模型對(duì)照組多烯磷脂酰膽堿組葛根素低劑量組葛根素中劑量組葛根素高劑量組10 10 10 10 10 10 p-IκBα/IκBα比值0.02±0.01 0.72±0.04①0.08±0.03②0.68±0.06 0.22±0.05②③0.04±0.02②

3 討論

在非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）發(fā)生發(fā)展過程中除了單純的肝臟脂肪變性外，還可見到不同程度的肝臟功能損傷、炎癥反應(yīng)和纖維化。ALT 和AST是肝實(shí)質(zhì)受損的標(biāo)志物，當(dāng)肝臟受損時(shí)ALT和AST會(huì)被大量釋放進(jìn)入血液。本研究結(jié)果顯示，葛根素可下調(diào)NAFLD 大鼠血清中ALT、AST 水平，減輕肝功能損傷，修復(fù)肝臟組織結(jié)構(gòu)病理改變。

TNF-α 是參與炎癥的重要介質(zhì)，可激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)IL-6、iNOS 的大量表達(dá)，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)和組織損傷[17]。本研究結(jié)果顯示，葛根素可減少NAFLD 大鼠炎癥因子TNF-α、iNOS 和IL-6 的含量，減輕NAFLD 大鼠炎癥反應(yīng)。有研究表明，肝缺血再灌注后發(fā)生顯著的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，葛根素可下調(diào)NAFLD 大鼠肝臟中凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞凋亡，修復(fù)大鼠肝臟損傷。

脂肪合成的過程主要發(fā)生在肝臟，當(dāng)脂肪的合成能力超過脂肪的消耗時(shí)便可造成脂肪過多累積在肝臟，引發(fā)脂肪肝。NAFLD 的發(fā)生與患者血脂水平直接相關(guān)，且與肝脂肪病變程度呈正相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，葛根素可下調(diào)NAFLD 大鼠血清中TG、TC、LDL 含量，并上調(diào)HDL 水平，減少脂肪在大鼠肝臟中的沉積。

NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，通常與IκB形成復(fù)合體存在于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)被刺激因素激活后核轉(zhuǎn)移過程增強(qiáng)，參與調(diào)控炎癥因子TNF-α、IL 等的表達(dá)，最終導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，葛根素可下調(diào)NAFLD 大鼠肝組織中IκBα、NF-κB p65 磷酸化水平，表明葛根素可能通過抑制IκBα/NF-κB p65 信號(hào)通路活性，進(jìn)而減輕NAFLD大鼠肝臟中的炎癥反應(yīng)，改善肝臟損傷。

綜上所述，葛根素可能通過抑制IκBα/NF-κB p65 信號(hào)軸活性修復(fù)NAFLD 大鼠肝臟脂肪沉積所導(dǎo)致的肝損傷，同時(shí)還具有調(diào)節(jié)血脂的重要功效，對(duì)NAFLD 起到積極的治療作用。下一步我們將構(gòu)建人正常肝細(xì)胞株L-02 細(xì)胞脂肪變性模型，深入探究IκBα/NF-κB p65 信號(hào)軸在肝細(xì)胞脂肪變性中的作用。