陶成斌 ,王 劍 ，毛寶宏 ，劉希云 ，魏 穎 ，劉 青 △

（1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030，2，*甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

盆腔器官脫垂 （Pelvic Organ Prolapse，POP）是盆底支持結(jié)構(gòu)缺陷、損傷及功能障礙造成的疾患，表現(xiàn)為盆腔器官位置下降及由此而引起的相應(yīng)器官的功能改變，多因盆底支持組織薄弱引起[1]。既往研究證實(shí)陰道分娩、產(chǎn)次、高體質(zhì)指數(shù)、高齡及慢性腹壓增高等與POP發(fā)病相關(guān)[2-3]，但臨床中可見(jiàn)無(wú)慢性腹壓增加的、年輕、未生育者患POP，而部分多產(chǎn)婦并未發(fā)病，提示POP發(fā)生可能與遺傳因素相關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)選取 UBQLN1 （rs3814507、rs7866234）、GOLM1（rs2225237、rs3750390、rs3750389、rs2297002）中SNP位點(diǎn)為待測(cè)位點(diǎn)，將241名POP患者及268名健康人群外周血DNA中待測(cè)位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行研究，旨在探討單核苷酸基因多態(tài)性與盆腔臟器脫垂的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究以241名女性POP患者為實(shí)驗(yàn)組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）甘肅省轄區(qū)內(nèi)年齡≥20歲且在本地居住≥5年的女性；（2）符合國(guó)際尿控協(xié)會(huì)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)及POP-Q分期標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并婦科惡性腫瘤者；（2）中風(fēng)致壓力性尿失禁者；（3）既往有骨盆骨折史或相關(guān)損傷者。選取同期性別、年齡、產(chǎn)次、絕經(jīng)狀態(tài)相匹配的健康體檢人群268名為對(duì)照。兩組體型、分娩史、分娩方式、胎兒最大體重等資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。留取外周血標(biāo)本，對(duì)全血DNA進(jìn)行提取，應(yīng)用Sequenom技術(shù)對(duì)盆底功能障礙性疾病相關(guān)易感基因：UBQLN1、GOLM1進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，分析與POP發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)的等位基因、基因型分布頻率。本研究共納入509份樣本進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法

抽取兩組靜脈血5mL置EDTA抗凝管中，充分混勻以防凝血，并與流行病學(xué)資料使用統(tǒng)一編號(hào)，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。提取基因組DNA，采用Sequenom技術(shù)進(jìn)行位點(diǎn)檢測(cè)，通過(guò)引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因位點(diǎn)檢測(cè)。共選擇2個(gè)基因，6個(gè)SNP位點(diǎn)。rs3814507反應(yīng)失敗及數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確未納入數(shù)據(jù)分析，因此最終納入5個(gè)SNP位點(diǎn)行數(shù)據(jù)分析，見(jiàn)表2。

表1 兩組人口學(xué)特征比較

表2 SNP篩選結(jié)果

1.3 最小等位基因頻率

最小等位基因頻率 （Minor Allele Frequency，MAF）是指兩等位基因中，頻率較低的等位基因頻率。若MAF＜0.05，容易因?yàn)檫z傳漂變等原因造成選取實(shí)驗(yàn)群體與真實(shí)的大范圍群體相比出現(xiàn)偏移，此外突變頻率較低的位點(diǎn)在病例-對(duì)照組間往往差異較小，難以得出有效結(jié)論。本研究中選取SNP位點(diǎn)均大于0.05，即本研究選取的SNP位點(diǎn)有意義。詳見(jiàn)表3。

表3 SNP位點(diǎn)的MAF值

1.4 哈溫平衡檢測(cè)

分別統(tǒng)計(jì)所有樣本，病例組，對(duì)照組是否符合哈溫平衡定律，如果不符合哈溫平衡 （結(jié)果中P值＜0.05），說(shuō)明選取的樣本不是隨機(jī)群體，需要進(jìn)一步核實(shí)是否是家系來(lái)源樣本，還是選取的樣本來(lái)源有問(wèn)題（即不能代表真實(shí)的大范圍群體）。本研究包括的SNP位點(diǎn)僅rs2297002在病例組人群中分布不符合哈溫平衡，其余所有位點(diǎn)在總體人群、病例組及對(duì)照組中分布均符合哈溫平衡，即可以代表真實(shí)的大范圍群體。詳見(jiàn)表格4。

表4 SNP位點(diǎn)的哈溫平衡檢測(cè)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí)以（±s）表示，予以 t檢驗(yàn)，組間基因型、等位基因頻率等計(jì)數(shù)資料予以χ2檢驗(yàn)，將不同基因型在病例組及對(duì)照組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者納入單因素Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 等位基因頻率

本研究共納入5個(gè)SNP位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)rs2297002、rs3750389、rs7866234位點(diǎn)的等位基因頻率在病例組及對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），余SNP位點(diǎn)等位基因頻率組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞0.05）。 見(jiàn)表 5。

表5 等位基因頻率及比較

2.2 基因型統(tǒng)計(jì)

本研究共納入5個(gè)SNP位點(diǎn),rs2297002 SNP位點(diǎn)基因型分布頻率存在差異（P＜0.05），詳見(jiàn)表6。

表6 基因型頻率及比較

2.3 單因素logistic回歸分析

rs2297002不同基因型在病例組及對(duì)照組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。將上述基因型帶入Logistic單因素回歸模型分析SNP位點(diǎn)與POP的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性，以野生型為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)rs2297002位點(diǎn)TC型個(gè)體與TT型相比，可使POP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加至1.876倍。詳見(jiàn)表7、表8。

表7 顯性模型分析

表8 rs2297002基因型單因素Logistic回歸分析

3 討論

目前POP的明確病因尚不明確，其發(fā)生可能因膠原蛋白、彈性蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)等原本保持的動(dòng)態(tài)平衡被破壞所致[6]。目前國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)研究都提示盆腔器官脫垂的發(fā)生、發(fā)展與遺傳因素也有一定的關(guān)系。Altman,D.等[7]提出約40%的POP或SUI的發(fā)生與遺傳因素相關(guān)。Allen-Brady,K.[8]等首次提出POP的發(fā)生可能與9號(hào)染色體長(zhǎng)臂21區(qū)有關(guān)，既往研究表明多個(gè)位于該區(qū)的基因與肌肉蛋白功能相關(guān)或在肌肉組織中高表達(dá)，包括TLE4、TLE1、UBQLN1、MAK10、GOLM1 及 ADRB3 基因。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）目前被廣泛用于疾病相關(guān)基因定位及診斷、群體遺傳學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)及應(yīng)用等相關(guān)研究中[9]，是指基因組水平上因單個(gè)核苷酸變異致DNA序列多態(tài)性，各SNP位點(diǎn)通常有兩個(gè)等位基因，在一定程度上表現(xiàn)出了每個(gè)個(gè)體之間存在著遺傳差異，檢測(cè)時(shí)無(wú)需分析片段長(zhǎng)度，可通過(guò)簡(jiǎn)單的＋/-分析進(jìn)行基因型分型[10]。SNP位點(diǎn)在目前已經(jīng)知道的多態(tài)性中占有相當(dāng)大的比重，所占比例在90%以上。每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就可存在1個(gè)SNPs位點(diǎn)。SNPs中所包含的各種等位基因，其等位基因頻率均需大于1%。大部分SNPs對(duì)基因功能不存在影響，但當(dāng)其位于編碼區(qū)則可能影響基因功能。

本次研究以人群為基礎(chǔ)，針對(duì)POP人群開(kāi)展基因位點(diǎn)多態(tài)性與POP的關(guān)聯(lián)分析，對(duì)照亦來(lái)自于同期人群，也是UBQLN1、GOLM1基因被較早的在POP領(lǐng)域研究。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了rs297002、rs3750389及rs7866234位點(diǎn)等5個(gè)位點(diǎn)SNPs與盆腔臟器脫垂的關(guān)系。研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rs2225237、rs3750389、rs3750390、rs7866234 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與盆腔臟器脫垂無(wú)明顯相關(guān)性；rs297002位點(diǎn)，等位基因C是盆腔臟器脫垂的危險(xiǎn)等位基因，CC基因型是盆腔臟器脫垂的危險(xiǎn)基因型；提示GOLM1基因的rs297002位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)漢族人群的盆腔臟器脫垂相關(guān)。rs297002位點(diǎn)位于GOLM1基因，但其生物學(xué)意義尚不完全明確。關(guān)于GOLM1基因SNP變異能否顯著影響POP的發(fā)生尚無(wú)定論，由于本次實(shí)驗(yàn)樣本量較小，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚需大樣本的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，而GOLM1、基因單核苷酸多態(tài)性與盆腔臟器脫垂發(fā)病相關(guān)的具體作用機(jī)制，仍需在今后的研究中做進(jìn)一步探究。

綜上所述，GOLM1-rs297002C/T基因多態(tài)性與POP遺傳易感性有相關(guān)性，TC型個(gè)體與TT型相比，可使POP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加至1.876倍。