陶成斌 ,王 劍 ,毛寶宏 ,劉希云 ,魏 穎 ,劉 青 △
(1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730030,2,*甘肅省婦幼保健院,甘肅 蘭州 730050)
盆腔器官脫垂 (Pelvic Organ Prolapse,POP)是盆底支持結(jié)構(gòu)缺陷、損傷及功能障礙造成的疾患,表現(xiàn)為盆腔器官位置下降及由此而引起的相應(yīng)器官的功能改變,多因盆底支持組織薄弱引起[1]。既往研究證實(shí)陰道分娩、產(chǎn)次、高體質(zhì)指數(shù)、高齡及慢性腹壓增高等與POP發(fā)病相關(guān)[2-3],但臨床中可見(jiàn)無(wú)慢性腹壓增加的、年輕、未生育者患POP,而部分多產(chǎn)婦并未發(fā)病,提示POP發(fā)生可能與遺傳因素相關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)選取 UBQLN1 (rs3814507、rs7866234)、GOLM1(rs2225237、rs3750390、rs3750389、rs2297002)中SNP位點(diǎn)為待測(cè)位點(diǎn),將241名POP患者及268名健康人群外周血DNA中待測(cè)位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行研究,旨在探討單核苷酸基因多態(tài)性與盆腔臟器脫垂的相關(guān)性。
本研究以241名女性POP患者為實(shí)驗(yàn)組,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)甘肅省轄區(qū)內(nèi)年齡≥20歲且在本地居住≥5年的女性;(2)符合國(guó)際尿控協(xié)會(huì)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)及POP-Q分期標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并婦科惡性腫瘤者;(2)中風(fēng)致壓力性尿失禁者;(3)既往有骨盆骨折史或相關(guān)損傷者。選取同期性別、年齡、產(chǎn)次、絕經(jīng)狀態(tài)相匹配的健康體檢人群268名為對(duì)照。兩組體型、分娩史、分娩方式、胎兒最大體重等資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。留取外周血標(biāo)本,對(duì)全血DNA進(jìn)行提取,應(yīng)用Sequenom技術(shù)對(duì)盆底功能障礙性疾病相關(guān)易感基因:UBQLN1、GOLM1進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè),分析與POP發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)的等位基因、基因型分布頻率。本研究共納入509份樣本進(jìn)行SNP位點(diǎn)檢測(cè)。
抽取兩組靜脈血5mL置EDTA抗凝管中,充分混勻以防凝血,并與流行病學(xué)資料使用統(tǒng)一編號(hào),-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。提取基因組DNA,采用Sequenom技術(shù)進(jìn)行位點(diǎn)檢測(cè),通過(guò)引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)基因位點(diǎn)檢測(cè)。共選擇2個(gè)基因,6個(gè)SNP位點(diǎn)。rs3814507反應(yīng)失敗及數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確未納入數(shù)據(jù)分析,因此最終納入5個(gè)SNP位點(diǎn)行數(shù)據(jù)分析,見(jiàn)表2。
表1 兩組人口學(xué)特征比較
表2 SNP篩選結(jié)果
最小等位基因頻率 (Minor Allele Frequency,MAF)是指兩等位基因中,頻率較低的等位基因頻率。若MAF<0.05,容易因?yàn)檫z傳漂變等原因造成選取實(shí)驗(yàn)群體與真實(shí)的大范圍群體相比出現(xiàn)偏移,此外突變頻率較低的位點(diǎn)在病例-對(duì)照組間往往差異較小,難以得出有效結(jié)論。本研究中選取SNP位點(diǎn)均大于0.05,即本研究選取的SNP位點(diǎn)有意義。詳見(jiàn)表3。
表3 SNP位點(diǎn)的MAF值
分別統(tǒng)計(jì)所有樣本,病例組,對(duì)照組是否符合哈溫平衡定律,如果不符合哈溫平衡 (結(jié)果中P值<0.05),說(shuō)明選取的樣本不是隨機(jī)群體,需要進(jìn)一步核實(shí)是否是家系來(lái)源樣本,還是選取的樣本來(lái)源有問(wèn)題(即不能代表真實(shí)的大范圍群體)。本研究包括的SNP位點(diǎn)僅rs2297002在病例組人群中分布不符合哈溫平衡,其余所有位點(diǎn)在總體人群、病例組及對(duì)照組中分布均符合哈溫平衡,即可以代表真實(shí)的大范圍群體。詳見(jiàn)表格4。
表4 SNP位點(diǎn)的哈溫平衡檢測(cè)
采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí)以(±s)表示,予以 t檢驗(yàn),組間基因型、等位基因頻率等計(jì)數(shù)資料予以χ2檢驗(yàn),將不同基因型在病例組及對(duì)照組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者納入單因素Logistic回歸分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
本研究共納入5個(gè)SNP位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)rs2297002、rs3750389、rs7866234位點(diǎn)的等位基因頻率在病例組及對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),余SNP位點(diǎn)等位基因頻率組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05)。 見(jiàn)表 5。
表5 等位基因頻率及比較
本研究共納入5個(gè)SNP位點(diǎn),rs2297002 SNP位點(diǎn)基因型分布頻率存在差異(P<0.05),詳見(jiàn)表6。
表6 基因型頻率及比較
rs2297002不同基因型在病例組及對(duì)照組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將上述基因型帶入Logistic單因素回歸模型分析SNP位點(diǎn)與POP的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性,以野生型為對(duì)照,發(fā)現(xiàn)rs2297002位點(diǎn)TC型個(gè)體與TT型相比,可使POP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加至1.876倍。詳見(jiàn)表7、表8。
表7 顯性模型分析
表8 rs2297002基因型單因素Logistic回歸分析
目前POP的明確病因尚不明確,其發(fā)生可能因膠原蛋白、彈性蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)等原本保持的動(dòng)態(tài)平衡被破壞所致[6]。目前國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)研究都提示盆腔器官脫垂的發(fā)生、發(fā)展與遺傳因素也有一定的關(guān)系。Altman,D.等[7]提出約40%的POP或SUI的發(fā)生與遺傳因素相關(guān)。Allen-Brady,K.[8]等首次提出POP的發(fā)生可能與9號(hào)染色體長(zhǎng)臂21區(qū)有關(guān),既往研究表明多個(gè)位于該區(qū)的基因與肌肉蛋白功能相關(guān)或在肌肉組織中高表達(dá),包括TLE4、TLE1、UBQLN1、MAK10、GOLM1 及 ADRB3 基因。
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)目前被廣泛用于疾病相關(guān)基因定位及診斷、群體遺傳學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)及應(yīng)用等相關(guān)研究中[9],是指基因組水平上因單個(gè)核苷酸變異致DNA序列多態(tài)性,各SNP位點(diǎn)通常有兩個(gè)等位基因,在一定程度上表現(xiàn)出了每個(gè)個(gè)體之間存在著遺傳差異,檢測(cè)時(shí)無(wú)需分析片段長(zhǎng)度,可通過(guò)簡(jiǎn)單的+/-分析進(jìn)行基因型分型[10]。SNP位點(diǎn)在目前已經(jīng)知道的多態(tài)性中占有相當(dāng)大的比重,所占比例在90%以上。每500~1000個(gè)堿基對(duì)中就可存在1個(gè)SNPs位點(diǎn)。SNPs中所包含的各種等位基因,其等位基因頻率均需大于1%。大部分SNPs對(duì)基因功能不存在影響,但當(dāng)其位于編碼區(qū)則可能影響基因功能。
本次研究以人群為基礎(chǔ),針對(duì)POP人群開(kāi)展基因位點(diǎn)多態(tài)性與POP的關(guān)聯(lián)分析,對(duì)照亦來(lái)自于同期人群,也是UBQLN1、GOLM1基因被較早的在POP領(lǐng)域研究。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了rs297002、rs3750389及rs7866234位點(diǎn)等5個(gè)位點(diǎn)SNPs與盆腔臟器脫垂的關(guān)系。研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,rs2225237、rs3750389、rs3750390、rs7866234 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與盆腔臟器脫垂無(wú)明顯相關(guān)性;rs297002位點(diǎn),等位基因C是盆腔臟器脫垂的危險(xiǎn)等位基因,CC基因型是盆腔臟器脫垂的危險(xiǎn)基因型;提示GOLM1基因的rs297002位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)漢族人群的盆腔臟器脫垂相關(guān)。rs297002位點(diǎn)位于GOLM1基因,但其生物學(xué)意義尚不完全明確。關(guān)于GOLM1基因SNP變異能否顯著影響POP的發(fā)生尚無(wú)定論,由于本次實(shí)驗(yàn)樣本量較小,故實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚需大樣本的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),而GOLM1、基因單核苷酸多態(tài)性與盆腔臟器脫垂發(fā)病相關(guān)的具體作用機(jī)制,仍需在今后的研究中做進(jìn)一步探究。
綜上所述,GOLM1-rs297002C/T基因多態(tài)性與POP遺傳易感性有相關(guān)性,TC型個(gè)體與TT型相比,可使POP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加至1.876倍。