李 萍，李藝杰，薛 玲，宋春紅

（1. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，青島 266001；2. 北京唯新唯實(shí)教育科技有限公司，北京102200；3. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，教育部中醫(yī)藥經(jīng)典理論研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 濟(jì)南250355)

芍藥苷（paeoniflorin）是中藥白芍和赤芍的主要有效單體成分。近年來(lái)，芍藥苷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注，其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能與多個(gè)受體和離子通道有關(guān)[1]。本課題組前期研究[2]發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可能通過(guò)調(diào)控L型電壓依賴型鈣通道（L-type voltage-dependent calcium channel，LTCC）顯著改善經(jīng)前煩躁障礙癥（premenstrual dysphoric disorder，PMDD）肝氣郁結(jié)大鼠的抑郁情緒，但具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步探明。為解析芍藥苷與LTCC的關(guān)系，本研究利用LTCC激動(dòng)劑Bayk8644為工具藥[3]，采用行為學(xué)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)芍藥苷對(duì)LTCC開(kāi)放后大鼠行為學(xué)以及LTCC下游鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ，CaMKⅡ）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factors，BDNF）表達(dá)的影響，以期揭示芍藥苷的藥理作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量（130±10）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2016-0006]。晝夜顛倒適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)室溫度（21±1）℃，相對(duì)濕度55%±5%，大鼠自由進(jìn)食飲水[SYXK（魯）2017-0022]。實(shí)驗(yàn)操作在暗淡的紅燈（＜25 lux）下進(jìn)行，對(duì)動(dòng)物的操作遵遁我國(guó)相關(guān)法規(guī)。本研究通過(guò)山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（SDUTCM20190727001）

1.2 藥物與試劑

Bayk8644（L型鈣通道激動(dòng)劑）（B112-5MG）和二甲基亞砜（DMSO）（D2650-5X5ML）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；芍藥苷（GR-133-161209）購(gòu)自南京廣潤(rùn)生物制品有限公司；尼莫地平（Nimodipine）（N7634-1G）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；PVDF膜（Ipvh00010）和ECL發(fā)光液（P90720）均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；CaMKⅡ抗體（Ab134041）、pho-CaMKⅡ抗體（Ab171095）和BDNF抗體（Ab108319）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin（TA-09）、羊抗兔二抗（ZB-2301）和羊抗小鼠二抗（ZB-2305）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白Marker（26616）、Cocktail（78441-1）、RIPA（R0010）、BCA 試劑盒（PC0020）和SDS-PAGE試劑盒（P1200-1/P1200-2）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為分析系統(tǒng)為美國(guó)Panlab公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為視頻采集分析系統(tǒng)、大鼠高架十字迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱為上海欣軟信息科技有限公司產(chǎn)品；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Synergy H1）為美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（BOXChemiXR5）為英國(guó)Syngene公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組與給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，每隔1 d適應(yīng)含糖飲水（含0.8%蔗糖）1h。適應(yīng)飼養(yǎng)結(jié)束后，灌胃給藥操作開(kāi)始前，單籠飼養(yǎng)，禁食禁水24 h，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)。根據(jù)糖水與曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基線數(shù)據(jù)將大鼠平行分為6組，每組8只，分別為正常組、Bayk8644（0.2 mg·kg-1·d-1）組、芍藥苷高劑量（200mg·kg-1·d-1）組、芍藥苷中劑量（100mg·kg-1·d-1）組和芍藥苷低劑量（50 mg·kg-1·d-1）組，以及陽(yáng)性對(duì)照藥物尼莫地平（1mg·kg-1·d-1）組。各組大鼠給藥量為10 mL·kg-1·d-1，尼莫地平組、正常組和Bayk8644組每日相同時(shí)間給予相同劑量蒸餾水，連續(xù)給藥1周。尼莫地平組腹腔注射尼莫地平。10min后除正常組，其余各組均腹腔注射Bayk8644。10 min后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test）以及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束即用斷頭器斷頭處死大鼠，冰上分離出海馬體，－80℃冰箱備用。

1.4.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間都在8∶30 am ～12∶00 am進(jìn)行。利用SuperMaze動(dòng)物行為視頻跟蹤系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間為6 min，攝像采樣速度為15幀/s。檢測(cè)指標(biāo)為運(yùn)動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)路程、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間和直立次數(shù)。

1.4.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 將大鼠放置于高架十字迷宮中心交叉點(diǎn)處，頭部朝向開(kāi)放臂，利用SuperMaze軟件記錄大鼠5 min自由活動(dòng)狀態(tài)的運(yùn)動(dòng)軌跡。分析大鼠運(yùn)動(dòng)總路程、平均速度、進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間（time in open arm，OT）、進(jìn)入封閉臂時(shí)間（time in close arm， CT）、進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)（open arm entry，OE）和進(jìn)入封閉臂次數(shù)（close arm entry，CE）。計(jì)算進(jìn)入開(kāi)放臂時(shí)間百分比[OE%= OE/（OE+CE）×100%]和進(jìn)入次數(shù)百分比[OT%= OT/（OT+CT）×100%]。

1.4.4 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 腦組織稱重后按照1∶7的比例加入RIPA裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）并研磨。4℃16110×g離心10 min后取上清液，加入5×上樣緩沖液，100℃水浴變性5～10 min，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，分裝后－20 ℃保存。每泳道上樣40 μg總蛋白，將PAGE膠濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，剪下相應(yīng)蛋白條帶，TBST洗膜后加入相應(yīng)一抗（pho-CaMKⅡ1∶1 000，BDNF 1∶5 000），4 ℃振蕩孵育過(guò)夜。TBST洗膜后加入二抗（1∶10 000）室溫振搖1h。TBST洗膜（3次，10 min/次），TBS洗膜10 min。取出并吸去PVDF膜的TBS ，滴加ECL發(fā)光液成像。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

使用GraphPad Prism 6 軟件（GraphPad Software, Inc.，San Diego，California，USA）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

與正常組大鼠相比，Bayk8644組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總路程、中央?yún)^(qū)總路程和中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯縮短，直立次數(shù)顯著減少（P＜0.01或P＜0.05）；芍藥苷組與正常組大鼠無(wú)明顯差異。與Bayk8644組相比，芍藥苷高劑量組曠場(chǎng)總路程、中央?yún)^(qū)總路程、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間和直立次數(shù)各指標(biāo)明顯升高（P＜0.01或P＜0.05），芍藥苷中劑量組曠場(chǎng)總路程、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間和直立次數(shù)各指標(biāo)明顯升高（P＜0.05），芍藥苷低劑量組中央?yún)^(qū)停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）。尼莫地平組與Bayk8644組相比，各指標(biāo)有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。曠場(chǎng)軌跡圖見(jiàn)圖2。

2.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

高架十字迷宮結(jié)果顯示（圖3），注射Bayk8644后大鼠OE%、OT%、活動(dòng)總路程和平均速度各指標(biāo)與正常組相比明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與Bayk8644組相比，芍藥苷高劑量組的OE%、OT%、活動(dòng)總路程和平均速度各指標(biāo)明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），芍藥苷中劑量組的OT%明顯升高（P＜0.05）；芍藥苷各組各指標(biāo)與正常組無(wú)明顯差異。尼莫地平組各指標(biāo)與Bayk8644組相比有升高趨勢(shì)。

2.3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

圖 1 大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 1 The results of open field test of rats

圖 2 大鼠曠場(chǎng)軌跡圖Figure 2 Trajectories of open field test of rats

圖 3 大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 3 The results of elevated plus maze test of rats

如圖4所示，與正常組大鼠海馬體腦區(qū)的蛋白表達(dá)量相比，Bayk8644組CaMKⅡ、pho-CaMKⅡ蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01，P＜0.05），BDNF蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），而芍藥苷組與之無(wú)明顯差別。與Bayk8644組相比，芍藥苷高劑量組CaMKⅡ和pho-CaMKⅡ蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），BDNF蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），而芍藥苷中劑量組和低劑量組與Bayk8644組之間無(wú)明顯差異。尼莫地平組BDNF蛋白表達(dá)量與Bayk8644組相比有升高趨勢(shì)。

3 討論

抑郁和焦慮是典型的精神障礙性疾病，抑郁癥以情緒低落為主要表現(xiàn)，焦慮主要以精神和軀體的焦慮癥狀為主，表現(xiàn)為緊張、畏懼和回避的行為反應(yīng)。抑郁焦慮在臨床上常常與其他疾病伴行，加重疾病的發(fā)生，影響預(yù)后。隨著人們生活和工作節(jié)奏的加快，抑郁和焦慮發(fā)病率也逐年升高，保守估計(jì)我國(guó)發(fā)病率大約在7%[4]。該病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病因機(jī)制是國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)。全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí)，編碼LTCCα1C 亞基的CACNA1C基因是精神障礙的風(fēng)險(xiǎn)基因，CACNA1C基因SNP rs1006737通過(guò)影響基因表達(dá)和L型鈣電流密度介導(dǎo)抑郁、精神分裂癥等情感障礙性疾病的發(fā)生[5]。因此，本研究利用LTCC激動(dòng)劑Bayk8644延長(zhǎng)LTCC開(kāi)放，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，觀察其介導(dǎo)的抑郁焦慮行為，通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)芍藥苷的藥理作用靶點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bayk8644可以引發(fā)大鼠抑郁和焦慮行為，而芍藥苷可通過(guò)L型鈣通道改善大鼠的抑郁和焦慮行為。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bayk8644可降低大鼠上述曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，說(shuō)明Bayk8644可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生抑郁焦慮行為。提前給予芍藥苷7d后再注射Bayk8644，上述指標(biāo)與正常組大鼠相比無(wú)顯著差異，初步說(shuō)明芍藥苷可以拮抗Bayk8644引起的抑郁焦慮樣行為。本研究中高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， Bayk8644可降低大鼠的OE%和OT%，提示Bayk8644可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生焦慮行為，與曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；而芍藥苷干預(yù)組大鼠的OE%和OT%指標(biāo)與正常大鼠無(wú)顯著區(qū)別。結(jié)合曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者認(rèn)為芍藥苷可以改善Bayk8644誘導(dǎo)的大鼠抑郁焦慮樣行為。

Ca2+經(jīng)L型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞后與鈣調(diào)蛋白發(fā)生結(jié)合，并激活CaMK Ⅱ使其發(fā)生磷酸化[6-7]。為進(jìn)一步驗(yàn)證曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了CaMK Ⅱ的磷酸化水平及其下游BDNF的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，Bayk8644可以增加大鼠海馬腦內(nèi)CaMKⅡ蛋白磷酸化水平，降低BDNF的表達(dá)，而芍藥苷給藥組無(wú)顯著變化。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血清BDNF水平以及抑郁癥自殺患者大腦中BDNF的含量均明顯低于健康人[8-9]，經(jīng)藥物治療后血清BDNF含量顯著高于未被治療者[10]。抑郁癥大鼠模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與臨床試驗(yàn)結(jié)果一致[11-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型大鼠海馬體腦區(qū)中鈣離子濃度升高，CaMKⅡ的蛋白磷酸化水平和mRNA的表達(dá)量升高[13-14]，結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)芍藥苷可以通過(guò)拮抗L型鈣通道降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，并通過(guò)調(diào)節(jié)其下游CaMKⅡ/BDNF通路的活化發(fā)揮其藥理作用。本研究雖然發(fā)現(xiàn)尼莫地平有拮抗Bayk8644的作用，但是拮抗作用不顯著，可能與沒(méi)有設(shè)置尼莫地平高、中和低劑量組以及動(dòng)物數(shù)量有限有關(guān)，有待繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究。