李 錚，李 崇，沈水寶，司紅彬

(廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530003)

大腸桿菌是常見的條件致病菌，也是畜禽腸道微生物的重要組成部分，由于養(yǎng)殖業(yè)的關系，大腸桿菌可以長期與抗菌藥物接觸使得其比其他細菌更容易產生耐藥性。這其中大腸桿菌最常攜帶的就是產超廣譜β-內酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases,ESBLs)耐藥基因[1]。超廣譜β-內酰胺酶有很多種不同的類型，其中最主要的類型有：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型。其中，CTX-M型是最新發(fā)現(xiàn)的也是傳播最廣的β-內酰胺類藥物耐藥基因類型，從1989年該耐藥基因被首次發(fā)現(xiàn)，到2017年，已發(fā)現(xiàn)了超過190余種CTX-M的亞型在全球范圍傳播[2]。于是，治療攜帶CTX-M耐藥基因的致病性大腸桿菌成為養(yǎng)殖業(yè)的難題之一。

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)菊科，蒲公英屬多年生草本植物，中藥蒲公英是由蒲公英屬植物的全草經炮制后制成的清熱解毒類中藥，呈干草狀。其味苦，性寒，無毒，入肝經、胃經，具有良好的抑菌抗炎、利膽保肝、降血糖、降血脂[3]、抗氧化、抗腫瘤[4]等作用。研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英成分復雜，但其中有效的抑菌活性成分大致包括以下幾種：黃酮類、多糖類、酚酸類植物甾醇類、倍半萜內酯類[5]等。目前關于蒲公英抑菌效果的研究有很多[5-7]，但是很少有關于蒲公英聯(lián)合抗菌藥物抑菌的報道。本試驗旨在研究蒲公英水提液聯(lián)合多種抗菌藥物對CTX-M型的產ESBLs大腸桿菌的體外抑菌效果，為中藥蒲公英的研究和大腸桿菌疾病的治療提供更多的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥蒲公英干草，購自廣西太華藥業(yè)有限公司；受試菌株由廣西大學動物科學技術學院中獸醫(yī)實驗室分離保存；林可霉素、氟苯尼考、左旋氧氟沙星、痢菌凈、加替沙星、阿奇霉素和鏈霉素等11種抗菌藥均在有效期內，并根據需要配置成不同濃度的溶液；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯等，均購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 蒲公英水提液的制備和抗菌藥物的配置 稱取干燥蒲公英中藥100 g至燒杯中，加10倍的蒸餾水浸泡過夜。然后煮沸1 h，紗布過濾，逐次加入8倍、6倍的蒸餾水重復上述步驟，3次濾液合并、抽濾、濃縮至100 mL，此時蒲公英的濃度約為1 g/mL。根據藥典用不同溶劑將阿莫西林、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、林可霉素、阿奇霉素、利福平、土霉素和鏈霉素配置成濃度為6 400 μg/mL的溶液；氟苯尼考配置成濃度為5 120 μg/mL的溶液；痢菌凈和加替沙星配置成濃度為3 200 μg/mL的溶液。

1.3 大腸桿菌的分離及基因型鑒定 將30%甘油保存的菌株接種到 LB試管肉湯中震蕩培養(yǎng)過夜，然后劃線接種到伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng)16～18 h。參考孫燕杰等[1]設計的16S rDNA和CTX-M引物(見表1)進行疑似大腸桿菌菌株的PCR及瓊脂糖凝膠電泳。PCR反應體系：Mix 12.5 μL；去離子水8.5 μL；上、下游引物各1 μL；菌液模板2 μL。PCR擴增條件：94 ℃，5 min；94 ℃,30 s；退火溫度見表1，30 s；72 ℃， 1 min；循環(huán)30次；72 ℃，10 min。16S rDNA送至武漢金凱瑞生物有限公司測序。

表1 16S rDNA與CTX-M引物序列與退火溫度Table 1 16S rDNA and CTX-M primer sequences and annealing temperature

1.4 菌懸液制備 從麥康凱培養(yǎng)基上挑取單個菌落于LB試管肉湯中，放入搖床37 ℃、220 r/min培養(yǎng)5 h，用LB肉湯培養(yǎng)基將菌懸液稀釋至0.5麥氏比濁度。

1.5 蒲公英和抗菌藥物對含CTX-M大腸桿菌最小抑菌濃度的測定 采用微量肉湯稀釋法測定中藥蒲公英和11種抗菌藥對該大腸桿菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)，過程及結果判斷嚴格按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標準(2017版)的方法進行。

1.6 蒲公英和抗菌藥聯(lián)合誘導細菌傳代 將蒲公英水提液加入到LB肉湯中稀釋為亞抑菌濃度，即1/2 MIC，加入適量菌懸液使細菌濃度達到106CFU/mL。將上述混合物加入到96孔板中，再加入抗菌藥。使抗菌藥的最終濃度為2倍MIC，蒲公英水提液的終濃度為1/2 MIC，此即為第1代，按同樣的方法(不加菌懸液)配置第2、3代，其中細菌從前1代接種,記錄各代的MIC。

1.7 蒲公英和抗菌藥聯(lián)合微量棋盤稀釋法 將蒲公英和抗菌藥分別做豎向和橫向的倍比稀釋，然后合并，再加入同體積的106CFU/mL菌懸液。藥物的互相作用效應通過計算其最小部分抑菌濃度指數(shù)(Fractional inhibitory concentration indices,FICI)來進行判斷，判斷標準：當FICI≤0.5，為協(xié)同效應；當0.52，為拮抗效應。

2 結果

2.1 菌株形態(tài)特征 在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上該菌株的形態(tài)為：玫紅色圓形光滑菌落(見中插彩版圖1A)。在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上該菌的形態(tài)：株菌落中心為紫黑色，混合部分有綠色金屬光澤的圓形光滑菌落(見中插彩版圖1B)。菌株可認定為疑似大腸桿菌菌株。

圖1 細菌在麥康凱培養(yǎng)基(A)和伊紅美藍培養(yǎng)基(B)上的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of bacteria on McConkey medium (A) and Eosin methylene blue medium (B)

2.2 菌株及基因型鑒定 PCR電泳結果顯示，16S rDNA和CTX-M基因的片段長度與預期相同(見圖2)，可確定該細菌含有CTX-M基因，同時，將16S rRNA測序結果于NCBI上進行比對分析，最后確定該細菌為含有CTX-M基因的大腸桿菌。

圖2 大腸桿菌16S rRNA(A)及CTX-M(B)結果Fig.2 Results of Escherichia coli 16S rRNA (A) and CTX-M (B)M:DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1：空白對照； 2：受試大腸桿菌M:DL-2 000 DNA marker; 1:Blank control; 2:Tested E. coli

2.3 蒲公英及抗菌藥物對大腸桿菌的MIC、傳代及聯(lián)合作用效果 由表2可知，蒲公英對該大腸桿菌的MIC值為250 mg/mL。該大腸桿菌對所選的阿莫西林、左旋氧氟沙星、林可霉素、利福平、土霉素等的MIC均≥1 600 μg/mL；對環(huán)丙沙星、痢菌凈、加替沙星和阿奇霉素的MIC均≥200 μg/mL；但是對鏈霉素的MIC較小，為50 μg/mL。蒲公英和抗菌藥聯(lián)合誘導該大腸桿菌傳代發(fā)現(xiàn)，痢菌凈隨著傳代其MIC逐漸降低；阿莫西林、左旋氧氟沙星、氟苯尼考、阿奇霉素和利福平等隨著傳代其MIC只出現(xiàn)一次降低，且降低幅度不一；環(huán)丙沙星、加替沙星、土霉素和鏈霉素等隨著傳代其MIC出現(xiàn)升高現(xiàn)象。蒲公英和抗菌藥聯(lián)合棋盤發(fā)現(xiàn)，與傳代結果相似，痢菌凈、氟苯尼考、阿奇霉素和利福平等與蒲公英聯(lián)用對該大腸桿菌呈相加作用；阿莫西林、左旋氧氟沙星、加替沙星、林可霉素和土霉素等與蒲公英聯(lián)用對該大腸桿菌呈無關作用；環(huán)丙沙星和鏈霉素與蒲公英聯(lián)用對該大腸桿菌呈拮抗作用。

表2 抗菌藥的最小抑菌濃度及聯(lián)合蒲公英的傳代、棋盤結果Table 2 The minimum inhibitory concentration of antibacterial drugs and the results of the passage and checkerboard of the combination dandelion

3 討論

由于抗菌藥的大量使用和耐藥質粒的快速傳播使得大腸桿菌的耐藥性也越來越嚴重，劉正明等[8]對內蒙古地區(qū)羊源大腸桿菌的耐藥性研究和馮敏燕等[9]對山東省雞源大腸桿菌耐藥趨勢的研究，共同說明了大腸桿菌的耐藥性的嚴重不僅僅體現(xiàn)在耐藥的種類上，同樣也體現(xiàn)在抗菌藥的濃度上。

中藥在我國已經有上千年的使用歷史，卻沒有發(fā)現(xiàn)存在細菌耐藥的現(xiàn)象，有著巨大的研究潛力，而清熱解毒藥的抑菌效果研究很早以前就已經開始了，從1995年華娟等[10]用超聲提取法研究了50多種不同中藥對7種細菌的抑制效果；到2016年榮茜等[11]利用乙醇回流、超聲波等提取方法研究了25種中藥單獨和聯(lián)合使用抑制豬幽門螺旋桿菌的效果。這些研究都充分說明了中藥即使從西醫(yī)的角度研究，同樣具有可觀的效果。

蒲公英作為一種清熱解毒藥在本試驗中的MIC值為0.25 g/mL，在生產中直接應用有限，但根據本實驗室研究思路，可考慮與抗菌藥物聯(lián)用達到增強抗菌藥物抑菌作用的效果，結果也顯示蒲公英在濃度為0.125 g/mL時與痢菌凈(濃度為6.25 μg/mL)、磺胺間甲氧嘧啶(濃度為25 μg/mL)、氟苯尼考(濃度為50 μg/mL)和利福平(濃度為800 μg/mL)聯(lián)用對大腸桿菌的抑制效果呈相加作用，同時，這4種抗菌藥聯(lián)用蒲公英水提液傳代可降低抗菌藥MIC，說明4種西藥聯(lián)用蒲公英水提液可有效增加抗菌藥的藥效或降低大腸桿菌的耐藥。