袁飛燕，于洋，李春

（北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院生化工程系，合成生物系統(tǒng)研究所，北京 100081）

酶的高催化性能促進(jìn)其在化學(xué)品合成和材料催化劑中的應(yīng)用。部分天然酶存在成本昂貴、產(chǎn)率低、穩(wěn)定性差等不足。在參與氧化還原反應(yīng)的酶中，多數(shù)酶在反應(yīng)中需要輔酶或輔基［1］，這更加大了天然酶的使用成本。人工酶是以酶的催化原理為基礎(chǔ)，模擬酶的生物催化功能，用化學(xué)法和生物法合成的具有特定催化功能的生物大分子。人工酶可以彌補(bǔ)天然酶的不足。人工酶已被用作控制化學(xué)反應(yīng)的高效催化劑［2］，同時(shí)有助于天然酶機(jī)理的深入研究［3］。此外，天然酶對(duì)底物具有高度專一性而使底物種類受限，影響在工業(yè)上的應(yīng)用，而人工酶可擴(kuò)大反應(yīng)底物范圍［4］。

在對(duì)天然酶的研究和改造中，研究者發(fā)展出了定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)等方法。例如在定向進(jìn)化中常用到的易錯(cuò)聚合酶鏈反應(yīng)（epPCR）和DNA-shuffling。通過在酶的結(jié)合口袋內(nèi)分區(qū)飽和誘變也成為一種有效的方法，稱為組合活性中心飽和測(cè)試（CAST）。而迭代飽和突變（ⅠSM）更適合進(jìn)一步的遺傳優(yōu)化［5］。通過改變氨基酸序列對(duì)酶進(jìn)行改造，得到具有特定功能的酶，成為眾多研究者青睞的方法。研究者為了創(chuàng)造新的、具有與天然酶催化能力相當(dāng)，甚至優(yōu)于天然酶催化能力的人工催化劑，常常對(duì)酶的底物識(shí)別位點(diǎn)、活性位點(diǎn)催化基團(tuán)以及疏水微環(huán)境進(jìn)行設(shè)計(jì)［6-7］。Arnold等［8-19］從具有單加氧活性的P450 酶出發(fā)，通過定向進(jìn)化改變氨基酸序列，使P450酶可以催化C—H活化和C—C、C—N、C—S、C—Si 鍵形成，提高其催化效率或產(chǎn)生新的底物特異性，實(shí)現(xiàn)了天然酶不能催化，甚至化學(xué)方法難以進(jìn)行的反應(yīng)。但是蛋白質(zhì)是由20 種天然氨基酸殘基（此外還有硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸）以及有限種類的天然輔因子組成，這大大限制了蛋白質(zhì)可實(shí)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)、反應(yīng)性、功能空間。而非天然結(jié)構(gòu)組件（包括非天然氨基酸及非天然輔因子）的引入，可以將一些特殊化學(xué)基團(tuán)（如疊氮基、炔基、聯(lián)吡啶等）摻入蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)，或引入具有熒光等特殊光譜學(xué)性質(zhì)、模擬翻譯后修飾等的氨基酸，這都可以為拓展人工酶的性質(zhì)提供新的科學(xué)視角。因此，引入非天然結(jié)構(gòu)組件構(gòu)建人工酶，已成為新的人工酶的設(shè)計(jì)策略。本文作者將以參與氧化還原反應(yīng)的人工金屬酶為例，探討基于非天然結(jié)構(gòu)組件的人工酶的設(shè)計(jì)方法。展望引入非天然結(jié)構(gòu)組件結(jié)合計(jì)算設(shè)計(jì)或代謝工程構(gòu)建人工酶的新方法，這有助于實(shí)現(xiàn)媲美天然酶效率的人工酶的設(shè)計(jì)與應(yīng)用。

1 非天然氨基酸的引入策略

利用非天然氨基酸（UAAs）擴(kuò)展遺傳密碼大大增加了蛋白質(zhì)可供改造的化學(xué)空間。基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)［20］是利用無義密碼子實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)中非天然氨基酸的定點(diǎn)引入的方法。這種方法的關(guān)鍵是保持正交性。具體而言，UAA 的密碼子不應(yīng)編碼共同的氨基酸；新的tRNA/氨酰tRNA 合成酶（aaRS）都不與任何內(nèi)源性tRNA 合成酶對(duì)發(fā)生反應(yīng)；新的合成酶只應(yīng)識(shí)別UAA，保證不識(shí)別20 種天然氨基酸［21］。正交 aaRS 將 UAA 裝載到 tRNA上，該tRNA 在核糖體中識(shí)別mRNA 上相應(yīng)的無義密碼子，從而導(dǎo)致UAA 摻入目標(biāo)蛋白中。將具有疊氮、炔基等活性基團(tuán)的UAA 摻入蛋白質(zhì)中，可以利用Cu（Ⅰ）催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)偶聯(lián)小分子催化劑［圖1（a）］［22-23］。這一技術(shù)可以在蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)引入具有特殊功能或化學(xué)性質(zhì)的非天然氨基酸，為拓展蛋白質(zhì)的性質(zhì)或者創(chuàng)造全新的蛋白質(zhì)提供了強(qiáng)有力的工具。

金屬是酶催化中的重要輔因子，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［24］。金屬酶可以催化氧化還原、水解等多種反應(yīng)，參與了生物圈重要的物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。但是，在天然氨基酸中，僅有7種的側(cè)鏈可以與金屬離子配位，而金屬離子結(jié)合位點(diǎn)需要精確定位多個(gè)氨基酸配體，這使得設(shè)計(jì)全新的金屬結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建人工酶成為巨大的挑戰(zhàn)。小分子配位化學(xué)研究中有很多常用的多齒配體，在一個(gè)分子內(nèi)通過不同的官能團(tuán)與金屬離子形成配位作用，對(duì)金屬離子有很高的親和力。我們可以在蛋白質(zhì)中方便地通過引入含多齒配體側(cè)鏈的非天然氨基酸構(gòu)建高親和力的金屬位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)人工酶的設(shè)計(jì)［圖 1（b）］［25］。例如 Liu 等［26］在綠色熒光蛋白中引入8-羥基喹啉丙氨酸（HqAla），可以得到對(duì)銅的親和力為fmol/L 級(jí)別的金屬結(jié)合位點(diǎn)，這一親和力已經(jīng)高于很多天然的金屬酶。

非天然氨基酸可以用于人工金屬酶的構(gòu)建。大多數(shù)的過渡金屬催化的反應(yīng)不能由天然金屬酶介導(dǎo)，而引入非天然氨基酸則允許過渡金屬的位點(diǎn)特異性配位，從而形成新的人工金屬酶。LmrR是一個(gè)細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，其二聚體間含有一個(gè)大的疏水孔，它雜泛的結(jié)合口袋為平面分子結(jié)合提供了一個(gè)合適的環(huán)境。Drienovská 等將LmrR的基因中M89 位突變?yōu)閷?duì)應(yīng)琥珀終止密碼子的TAG，用于非天然氨基酸引入。M89 位于疏水口袋的遠(yuǎn)端，從而避免了金屬配合物形成活性差的2：1 配體的風(fēng)險(xiǎn)。通過將非天然氨基酸（2，2'-聯(lián)吡啶-5基）丙氨酸（BpyAla）引入LmrR，提供一個(gè)穩(wěn)定的金屬結(jié)合位點(diǎn)，使得Cu（Ⅱ）能被結(jié)合到BpyAla 上。他們通過遺傳方法快速優(yōu)化構(gòu)建人工金屬酶LmrR_LM_M89X_F93W（其中X 為非天然氨基酸BpyAla），可催化不對(duì)稱Friedel-Crafts 烷基化反應(yīng)。在該人工酶催化的不對(duì)稱乙烯基Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)中，產(chǎn)物的ee值高達(dá)83%［27-28］。

圖 1 利用 UAAs構(gòu)建人工酶的設(shè)計(jì)策略［22-23，25，29］Fig.1 Design strategies for constructing artificial enzymes using UAAs［22-23，25，29］

除了通過引入金屬離子外，非天然氨基酸中的獨(dú)特官能團(tuán)還可以在活性中心直接參與反應(yīng)。Drienovská等［29］通過引入對(duì)疊氮苯丙氨酸（pAzF）還原的策略將非天然氨基酸引入至LmrR 結(jié)合口袋附近的四個(gè)不同的位置（Ⅴ15、N19、M89 和F93）作為酶活性中心，構(gòu)建了新的人工酶［圖1（c）］［29］。他們首先在LmrR 中引入 pAzF，再用三羧基乙基膦（TCEP）將其還原成對(duì)氨基苯丙氨酸（pAF）。這解決了直接引入pAF導(dǎo)致的低表達(dá)率及酪氨酸和苯丙氨酸的錯(cuò)誤摻入的問題。構(gòu)建的人工酶中LmrR_Ⅴ15pAF 具有獨(dú)特的苯胺側(cè)鏈，增加了酶的反應(yīng)活性，可以作為形成腙的良好催化劑（產(chǎn)率為 72% ± 3%）。UAA 引入的 pAF 作為活性反應(yīng)中心，在苯胺的存在下形成亞胺離子中間體，加速了腙（X＝NH）和肟（X＝O）的形成［圖1（c）］［29］。在此基礎(chǔ)上，最近Mayer等［30］將以非天然氨基酸為催化殘基的人工酶LmrR_Ⅴ15pAF 作為定向進(jìn)化的起點(diǎn)，通過識(shí)別蛋白質(zhì)支架中的有益突變，增強(qiáng)非天然側(cè)鏈的固有催化活性，使酶的kcat增 加 至 452 s-1， 相 比 LmrR_Ⅴ15pAF 提 高 了 近100倍，促進(jìn)了腙的高效合成。

2 非天然輔因子的引入策略

天然酶常使用卟啉、鈷胺素等金屬配合物作為輔因子參與催化反應(yīng)。天然酶使用的金屬局限在鐵、銅、鋅、鈷等少數(shù)種類，配體的類型也很單一。隨著金屬有機(jī)催化的發(fā)展，很多過渡金屬，尤其是貴金屬被認(rèn)為具有很好的催化活性。將這類金屬配合物作為輔因子與蛋白質(zhì)結(jié)合，可以構(gòu)建人工酶，催化新的反應(yīng)。

鏈霉親和素（SAⅤ）已被廣泛用作制造人工金屬酶的支架。Whitesides 等［31］在親和素中引入了一種生物素化的有機(jī)金屬催化劑，以提供一種混合催化劑，該催化劑結(jié)合了酶和有機(jī)金屬催化劑的特征。生物素化的有機(jī)金屬輔因子對(duì)鏈霉親和素的非共價(jià)親和力提供了良好的穩(wěn)定性，將少量的生物素化有機(jī)金屬催化劑與SAⅤ突變體結(jié)合起來，可以產(chǎn)生顯著的多樣性，從而優(yōu)化人工金屬酶的催化性能［圖 2（a）］［32-33］。Jeschek 等［34］證明了鏈霉親和素生物素技術(shù)在體內(nèi)的適用性的同時(shí)，用此策略創(chuàng)造人工金屬酶催化天然酶中不存在的一種反應(yīng)機(jī)制——烯烴復(fù)分解反應(yīng)。此方法得到的人工金屬酶還可以通過針對(duì)不同底物的定向進(jìn)化繼續(xù)改進(jìn)人工酶的活性。

以血紅素作為輔因子的蛋白參與氧氣運(yùn)輸或氧激活反應(yīng)，是金屬酶研究的焦點(diǎn)之一［35-37］。其中，肌紅蛋白和血紅蛋白結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于獲取，被公認(rèn)為分子工程研究的優(yōu)良起點(diǎn)［38］。在20 世紀(jì)上半葉就有研究者通過將蛋白脫輔基、重組在血紅蛋白中引入非天然卟啉［39］。研究人員分別在肌紅蛋白中引入非天然卟啉，構(gòu)建了不同的人工酶［40-43］。其中，Lu課題組用非天然血紅素和非天然金屬離子替代天然的血紅素及金屬離子，以調(diào)節(jié)底物親和力、電子轉(zhuǎn)移速率和酶的活性。例如將非生物輔因子錳-雙席夫堿復(fù)合物摻入肌紅蛋白中，賦予其生物學(xué)功能，并證明了金屬因子的錨定可以調(diào)節(jié)酶的對(duì)映選擇性。此外，他們還探討了蛋白質(zhì)主鏈的相互作用；證明了疏水性和H鍵網(wǎng)絡(luò)的重要性；以及還原電勢(shì)是軸向配體疏水性主要決定因素［43-45］。

圖2 非天然輔因子不同的引入策略［32-33，48，69］Fig.2 Different introduction strategies for non-natural cofactors［32-33，48，69］

Hartwig 課題組將金屬有機(jī)催化的研究經(jīng)驗(yàn)結(jié)合到人工金屬酶的構(gòu)建，在蛋白質(zhì)中加入了完整的貴金屬復(fù)合物，從而產(chǎn)生了人造金屬蛋白。他們將有機(jī)金屬配合物的反應(yīng)多樣性與酶的選擇性相結(jié)合，構(gòu)建出具有類似天然酶活性的人工酶［46］。Key 等［47］將肌紅蛋白中鐵卟啉（Fe-porphyrin ⅠX）替換為含有 Fe（Cl），Co（Cl），Cu，Mn（Cl），Rh，Ⅰr（Cl），Ⅰr（Me），Ru（CO）和Ag的卟啉結(jié)構(gòu)。其中含有 Ⅰr（Me）-porphyrin ⅠX 的重組蛋白［圖2（b）］［48］顯示出對(duì)卡賓轉(zhuǎn)移反應(yīng)具有一定的催化能力。

含 Ⅰr（Me）-porphyrin ⅠX 的重組肌紅蛋白較天然酶的催化速率還相差甚遠(yuǎn)，所以Dydio 等［46］選擇了熱穩(wěn)定性更好的P450酶CYP119，將鐵卟啉替換 為 Ⅰr（Me） -PⅠX。 所 得 到 的 人 工 金 屬 酶 Ⅰr（Me）-porphyrin ⅠX CYP119 經(jīng)過定向進(jìn)化，反應(yīng)速率和選擇性大大提高，Ⅰr（Me）-porphyrin ⅠX CYP119 的突變體催化卡賓插入C—H 鍵，其ee 值高達(dá)98%。最終得到的人工酶催化卡賓插入C—H鍵的TOF 達(dá)到2550 h-1，總轉(zhuǎn)化數(shù)35 000，達(dá)到了與天然P450酶催化單加氧反應(yīng)相似的水平。Dydio等［49］證明了 Ⅰr（Me）-CYP119 酶催化 C—H 胺化反應(yīng)具有較高的化學(xué)選擇性，可用于插入硝基苯還原為磺胺。Ⅰr（Me）P450 催化的插入反應(yīng)容納了小分子催化劑不能容納的一系列官能團(tuán)，其底物范圍比含鐵卟啉的酶更廣［50］。以上Hartwig課題組提出的人工金屬蛋白的制備方法，為多種卟啉-蛋白質(zhì)支架和非天然金屬輔因子合成人工酶催化的廣泛的非生物轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

改造天然輔因子得到的新的輔因子也可以為新的酶化學(xué)提供助力。Ji 等［51］合成了三種新的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）類似物。F作為一個(gè)強(qiáng)吸電子基團(tuán)在C5位置損害輔因子結(jié)合特性，因此用Cl、Br 或甲基取代F 合成三種新的NAD 類似物。就它們催化L-蘋果酸的氧化脫羧而言，每對(duì)NAD 類似物和雙突變體（ME L310R/Q401C）均與NAD 和天然大腸桿菌蘋果酸酶ME 具有良好的正交性，可以進(jìn)一步探索氧化還原酶與輔因子之間的分子相互作用，從而產(chǎn)生新的生物正交氧化還原體系。

除了簡(jiǎn)單的金屬離子、金屬配位化合物外，一些酶含有金屬團(tuán)簇，如固氮酶中的鐵鉬輔因子、光系統(tǒng)中的光合放氧中心等，催化了許多重要的反應(yīng)［52-57］。在蛋白質(zhì)骨架中引入這些團(tuán)簇是對(duì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的挑戰(zhàn)。Mirts 等［58-62］選擇分子量小且穩(wěn)定的細(xì)胞色素c 過氧化物酶（CcP）作為模型，其活性位點(diǎn)有一個(gè)足以容納［4Fe-4S］簇的空腔。通過體外重組在Apo-SiRCcP 中加入了一個(gè)鐵硫簇，設(shè)計(jì)了多核人工金屬酶用作催化劑。理性設(shè)計(jì)金屬和底物結(jié)合位點(diǎn)周圍的第二配位層，三個(gè)Cys突變（T180C，W191C，L232C）以協(xié)調(diào)［4Fe-4S］，穩(wěn)定性突變M230A 用于緩解空間碰撞，D235Ⅴ用以移除干擾CcP 中的Cys-Heme 協(xié)調(diào)附近的負(fù)電荷，H175C突變作為血紅素與［4Fe-4S］輔因子之間的橋聯(lián)Cys配體，使其形成了緊密的結(jié)構(gòu)，這一系列理性設(shè)計(jì)創(chuàng)造了接近天然酶SiR 活性的人工金屬酶，這些第二配位相互作用對(duì)于優(yōu)化設(shè)計(jì)策略以實(shí)現(xiàn)人工酶的多電子氧化還原的高活性具有重要意義。此種策略為設(shè)計(jì)多種人工金屬酶提供了機(jī)會(huì)，甚至超過小分子催化劑的化學(xué)反應(yīng)活性。

除了直接改造輔因子，對(duì)底物結(jié)合口袋的改造也可以實(shí)現(xiàn)人工酶的構(gòu)建，比如Watanabe 小組發(fā)展的誘餌分子（decoy molecule）策略。一種模式P450 酶，P450 BM3 通常以長(zhǎng)鏈脂肪酸為底物。Watanabe 等通過引入誘餌分子結(jié)合在活性口袋中構(gòu)建特定的底物結(jié)合位點(diǎn)，極大地增強(qiáng)了P450 酶對(duì)小分子非天然底物的催化雜泛性［63-64］，實(shí)現(xiàn)了丙烷、苯等非天然底物的羥化。研究人員將該策略用于小分子底物光脫羧酶［65］和烯烴水合酶［66］的構(gòu)建，顯示了這一策略在人工酶設(shè)計(jì)方面的潛力。Cong 等［67-68］報(bào)道了雙功能小分子（dual-functional small molecule，DFSM）策略，令誘餌分子的?；被峄鶊F(tuán)與酶的活性口袋結(jié)合，而咪唑基在H2O2的活化中發(fā)揮酸堿催化劑的作用，成功將P450 單加氧酶改造為過加氧酶（peroxygenase），擺脫了對(duì)NADPH輔酶的依賴。該研究拓展了P450酶在有機(jī)合成中的潛在用途，為人工P450 酶的設(shè)計(jì)提供了新的途徑。

3 非天然氨基酸與非天然輔因子的協(xié)同引入策略

非天然氨基酸和非天然輔因子的引入可以大大擴(kuò)展蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中可及的官能團(tuán)，拓展現(xiàn)有酶的功能。而同時(shí)引入非天然氨基酸和非天然輔因子，可以進(jìn)一步增加人們對(duì)蛋白質(zhì)的改造能力，得到定制化的人工酶。

相比通過非共價(jià)相互作用引入非天然輔因子，將非天然輔因子與骨架蛋白共價(jià)偶聯(lián)可以提高人工酶的魯棒性。通過基因密碼子擴(kuò)展引入含生物正交基團(tuán)的非天然氨基酸，可以實(shí)現(xiàn)非天然輔因子的定點(diǎn)特異共價(jià)錨定。利用環(huán)張力誘導(dǎo)的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)（SPAAC）將金屬催化劑引入蛋白質(zhì)，形成人工金屬酶，同時(shí)消除自然發(fā)生的錨定殘基帶來的選擇性、反應(yīng)性差等限制［圖2（c）］［69］。Yang等［69］通過pAzF將含銠配體引入咪唑甘油磷酸合酶的合成酶亞基（tHisF）中，實(shí)現(xiàn)了卡賓轉(zhuǎn)移和C—C、C—Si鍵成鍵。

化學(xué)家一直致力于設(shè)計(jì)催化劑，以模仿自然光合系統(tǒng)獲取可見光光子的能力，并利用光子吸收的能量來驅(qū)動(dòng)化學(xué)反應(yīng)。Liu等［70］設(shè)計(jì)了一種光催化CO2還原酶。他們?cè)邳S色熒光蛋白（sfYFP）中，使用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)用二苯甲酮-丙氨酸（BpA）替換發(fā)色團(tuán)殘基Tyr66，而Gly65-BpA66-Gly67可自催化轉(zhuǎn)化為高熒光的對(duì)羥基芐基-5-咪唑啉酮的發(fā)色團(tuán)，從而設(shè)計(jì)得到一種新的光敏蛋白（PSP），激發(fā)后轉(zhuǎn)換為能夠用于較遠(yuǎn)距離電子轉(zhuǎn)移的三重態(tài)，氧化弱犧牲還原劑產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)還原自由基，用于驅(qū)動(dòng)CO2還原催化劑的還原。為了將PSP轉(zhuǎn)化為光催化CO2還原酶，他們使用了三聯(lián)吡啶鎳配合物，成功進(jìn)行了有效的光化學(xué)還原反應(yīng)，催化CO2還原為CO（圖3）［70］。該策略代表了一種很有前景的光氧化還原酶設(shè)計(jì)的新方法，同時(shí)也為具有非天然光催化活性的人工酶提供了新的方向。

4 人工酶的高效制備策略

由于翻譯效率的降低，含UAA 的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率往往比野生型蛋白質(zhì)的產(chǎn)率低，但某些非天然氨基酸可以有較好的產(chǎn)率。Schultz 等［71］使用tRNACUA

圖3 PSP2T催化機(jī)理示意圖［70］Fig.3 Schematic diagram of the proposed catalytic mechanism of PSP2T［70］

Tyr/MjTyrRS 正交對(duì)將非天然氨基酸pAcF 分別引入T4溶菌酶的第68位和酮類固醇異構(gòu)酶的78位，在這兩種情況下都觀察到有效的蛋白質(zhì)表達(dá)，其產(chǎn)率相應(yīng)的約為野生型蛋白的50%。而對(duì)碘苯丙氨酸（pⅠPhe）、二氟代酪氨酸（F2Tyr）的摻入已經(jīng)在一系列蛋白質(zhì)展現(xiàn)出接近野生型的產(chǎn)量［72-74］。

由于非天然氨基酸和非天然輔因子大部分時(shí)候需要通過化學(xué)合成，導(dǎo)致人工酶成本較高、難以直接在細(xì)胞中直接制備。通過酶工程與代謝工程相結(jié)合，可以在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建非天然氨基酸和非天然輔因子的合成通路，實(shí)現(xiàn)人工酶的體內(nèi)組裝并直接參與細(xì)胞中的代謝反應(yīng)。在大腸桿菌中加入生物合成途徑以及正交的tRNA 合成酶-tRNA對(duì)，產(chǎn)生新的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，可在體內(nèi)摻入非天然氨基酸，如 pAF［75］和吡咯氨基酸（Pyl）［76］。pAF 是氯霉素等天然產(chǎn)物合成的中間體。Mehl等［75］在大腸桿菌中引入Streptomyces venezuelae強(qiáng)化分支酸的合成。過量積累的分支酸被大腸桿菌內(nèi)源的酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化生成pAF。經(jīng)過代謝強(qiáng)化，內(nèi)源生產(chǎn)的pAF 可以被相應(yīng)的tRNA 合成酶識(shí)別，引入到蛋白質(zhì)中。

Marchand 等［77］確定并表征了一種生物合成途徑，用于生產(chǎn)含有鹵素、末端烯烴和末端炔烴的氨基酸，并采用了一種氨酰-tRNA合成酶（PraRS）取代Met殘基的方法，證明這些內(nèi)源產(chǎn)生的氨基酸可以翻譯成蛋白質(zhì)。這些非天然氨基酸的官能團(tuán)被引入肽和蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)為多種下游生物正交化學(xué)提供了機(jī)會(huì)。特別是末端炔基通過Cu（Ⅰ）催化疊氮-炔環(huán)加成“點(diǎn)擊”反應(yīng)（CuAAC）得以被廣泛應(yīng)用。類似地，非天然氨基酸氟硫酸鹽-酪氨酸（FSY）被成功引入蛋白質(zhì)中，利用基因編碼的化學(xué)轉(zhuǎn)化策略（GECCO），通過硫氟化交換（SUFEX）選擇性與近端氨基酸反應(yīng)，在活細(xì)胞蛋白質(zhì)中引入新的化學(xué)反應(yīng)賦予新的共價(jià)鍵能力［78-79］。

5 總結(jié)與展望

在人工酶設(shè)計(jì)的過程中，無論采取哪種策略都不可避免地存在耗時(shí)費(fèi)力的壁壘，特別是想將蛋白質(zhì)催化劑的效率提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。而理性設(shè)計(jì)人工酶，引入U(xiǎn)AAs等非天然結(jié)構(gòu)組件選擇正確的特定位點(diǎn)也是一個(gè)挑戰(zhàn)。很多通過數(shù)據(jù)庫檢索或者組學(xué)分析得到的蛋白質(zhì)往往沒有三維結(jié)構(gòu)，同源建模的方法可以基于氨基酸或者核酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。通過計(jì)算機(jī)輔助或者人工智能可以大大降低人工酶設(shè)計(jì)的工作量。量子力學(xué)/分子力學(xué)（QM/MM）模擬計(jì)算方法已被用來優(yōu)化人工酶設(shè)計(jì)及闡明其機(jī)制［80］。Rosseta 等軟件基于大數(shù)據(jù)中得到的能量函數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，尋找低能量構(gòu)像，這種設(shè)計(jì)方法也被應(yīng)用到含有非天然氨基酸的酶催化劑的設(shè)計(jì)中。同時(shí)，Mills等［81］將Rosetta設(shè)計(jì)方法用于設(shè)計(jì)金屬蛋白，利用Bpy-Ala 作為結(jié)合金屬離子的主要配體。他們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)，由Bpy-Ala、兩個(gè)蛋白質(zhì)金屬配體以及兩種金屬結(jié)合水分子組成的八面體配位幾何結(jié)構(gòu)。Bpy-Ala介導(dǎo)的金屬蛋白具有與Co2+、Zn2+、Fe2+和Ni2+等二價(jià)陽離子結(jié)合的能力。同時(shí)，Mills 團(tuán)隊(duì)對(duì)設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)進(jìn)行X 射線晶體分析，發(fā)現(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)與計(jì)算設(shè)計(jì)的模型非常接近，展示了Rosetta對(duì)于金屬蛋白設(shè)計(jì)的能力。Yang等［82］最近對(duì)18 個(gè)蛋白的從頭設(shè)計(jì)，更進(jìn)一步證明了Rosetta 可以更精確地設(shè)計(jì)蛋白模型。計(jì)算方法的改進(jìn)，為人工酶的計(jì)算設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化提供了良好的起點(diǎn)［83-84］。

綜上所述，通過引入非天然氨基酸及非天然輔輔因子等多種策略能有效合成具有新功能和新結(jié)構(gòu)性質(zhì)的人工酶。有機(jī)金屬的合理引入也為人工酶的設(shè)計(jì)開發(fā)了更多的催化性能。非天然氨基酸代謝合成系統(tǒng)的創(chuàng)造，也可用于體內(nèi)直接合成非天然氨基酸，引入多肽藥物中具有新藥效的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步促進(jìn)生物醫(yī)藥、綠色化學(xué)等行業(yè)的發(fā)展。正交氨酰tRNA 合成酶可以在表達(dá)宿主體內(nèi)將非天然氨基酸特異性地引入蛋白的特定位點(diǎn)，生產(chǎn)修飾蛋白可以避免人工添加非天然氨基酸的煩瑣，也能降低生產(chǎn)成本。非天然結(jié)構(gòu)組件與蛋白質(zhì)的結(jié)合為新反應(yīng)的拓展提供了基礎(chǔ)。

目前為止，大部分人工酶只能在純化后進(jìn)行反應(yīng)。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，將具有非天然組件的人工酶與細(xì)胞代謝過程進(jìn)行整合，合成自然界不存在的分子也成為一種前沿課題。Reynolds等改造細(xì)胞色素P450，利用空間位阻使其識(shí)別小于血紅素的卟啉分子，又引入血紅素［85］轉(zhuǎn)運(yùn)通道ChuA，向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入非天然卟啉。他們構(gòu)建了正交酶/輔因子對(duì)，可能為增加輔因子多樣性和擴(kuò)大細(xì)胞蛋白質(zhì)化學(xué)功能提供一種通用策略，使輔因子選擇性地結(jié)合到正交蛋白支架，而不與內(nèi)源性元件發(fā)生干擾反應(yīng)。在一篇ChemRxiv 預(yù)印本論文中，Huang 等［86］通過與 ChuA 類似的 hug 作為卟啉轉(zhuǎn)運(yùn)體系，將銥卟啉轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞中。在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的CYP119 突變體可以結(jié)合銥卟啉，催化了以香芹酮為底物的卡賓轉(zhuǎn)移反應(yīng)，合成了一種非天然的萜類化合物。將人工酶與代謝工程結(jié)合，可能合成大量的“非天然”的天然產(chǎn)物，拓展現(xiàn)有的分子結(jié)構(gòu)空間。

非天然結(jié)構(gòu)組件的合理利用為快速進(jìn)化人工酶、建立具有全新功能的平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)?？v然應(yīng)用非天然結(jié)構(gòu)組件的引入策略得到了一些新的人工酶，但實(shí)際工作中，高效的人工酶設(shè)計(jì)往往需要定向進(jìn)化、計(jì)算模擬甚至代謝工程的結(jié)合，動(dòng)力學(xué)因素可能是催化活性的關(guān)鍵。這種多元化方法的結(jié)合有望推動(dòng)更多與天然酶催化效率相媲美的人工酶的發(fā)現(xiàn)。