于勇，朱欣娜，張學(xué)禮

（中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

通過合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠，能夠?qū)⑻穷惖瓤稍偕纳镔Y源轉(zhuǎn)化為多種大宗化學(xué)品，實(shí)現(xiàn)大宗化學(xué)品的綠色清潔生產(chǎn)，可以擺脫對(duì)石油資源的依賴，解決石化制造過程中的高耗能和高污染問題，對(duì)促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要［1］。本文對(duì)微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建技術(shù)、代謝調(diào)控機(jī)制及大宗化學(xué)品生物制造的典型案例進(jìn)行了綜述，并對(duì)細(xì)胞工廠的未來進(jìn)行了展望。

1 微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建技術(shù)

1.1 基因組編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)是細(xì)胞工廠代謝途徑構(gòu)建及優(yōu)化的重要技術(shù)。通常的基因編輯技術(shù)有：Red同源重組技術(shù)［2-3］、鋅指核酸酶技術(shù)（zinc-finger nuculeases，ZEN）［4］、轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）［5］等。這些基因編輯技術(shù)在合成生物學(xué)的發(fā)展中具有“里程碑”式的意義，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高及宿主局限性等缺陷，無法滿足高效構(gòu)建細(xì)胞工廠的需求。

CRⅠSPR/Cas （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRⅠSPR-associated proteins）基因編輯技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、基因編輯效率高、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，近年來得到了深入的開發(fā)，并廣泛應(yīng)用于生物及醫(yī)藥領(lǐng)域。在大宗化學(xué)品代謝途徑構(gòu)建和改造中，CRⅠSPR/Cas 基因編輯技術(shù)顯示了廣泛的適用范圍，成功地應(yīng)用于大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、丙酮丁酸梭菌、鏈球菌、芽孢桿菌等原核微生物及釀酒酵母、曲霉等真核微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建［6-7］。

首先，CRⅠSPR/Cas 技術(shù)可成功地應(yīng)用于基因表達(dá)強(qiáng)度的調(diào)控。Heo 等［8］將該技術(shù)用于丁醇代謝途徑的改造，通過高效編輯大腸桿菌檸檬酸合成酶基因（gltA）的啟動(dòng)子區(qū)域降低該基因的表達(dá)強(qiáng)度，將檸檬酸合成酶的活性調(diào)整為出發(fā)菌的55%，將丁醇的產(chǎn)量提高了1.3倍。

其次，CRⅠSPR/Cas 技術(shù)還可用于基因整合。Bassalo 等［9］使用該技術(shù)將alsS、ilvC、ilcD、kivD和adhA等5 個(gè)與異丁醇合成相關(guān)的基因構(gòu)成的長(zhǎng)達(dá)10 kb 的基因簇一步整合進(jìn)大腸桿菌基因簇，并獲得了異丁醇產(chǎn)量達(dá)2.2g/L的菌株。向丙酮丁醇羧菌中引入異丙醇的合成途徑，得到了產(chǎn)量達(dá)4.45g/L的異丙醇生產(chǎn)菌［10］。

再次，CRⅠSPR/Cas 技術(shù)還可用于基因敲除。Cho 等［11］使用該技術(shù)敲除了谷氨酸棒桿菌中γ-氨基丁酸合成途徑的競(jìng)爭(zhēng)途徑，將γ-氨基丁酸的產(chǎn)量提高到27.5 g/L。

近年來，科學(xué)家們開發(fā)出更為簡(jiǎn)便的CRⅠSPR/Cas 單堿基編輯技術(shù)，不需要同源臂，可在染色體上直接對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。其基本原理為利用CRⅠSPR/Cas 系統(tǒng)確定突變位點(diǎn)，通過脫氨酶催化脫氨使單堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換。如：通過偶聯(lián)胞嘧啶脫氨酶實(shí)現(xiàn)C到T的轉(zhuǎn)換；通過偶聯(lián)腺苷脫氨酶實(shí)現(xiàn)A 到 G 的轉(zhuǎn)換。David R. Liu 團(tuán)隊(duì)將 CRⅠSPR/Cas9和逆轉(zhuǎn)錄酶融合表達(dá)，開發(fā)了“Prime Editing”系統(tǒng)，突破了CRⅠSPR/Cas 堿基突變類型，能進(jìn)行C到 T、T 到 C、A 到 G、G 到 A 四種堿基置換［12］，拓展了基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍。

1.2 多基因同時(shí)調(diào)控技術(shù)

通常情況下，高效的產(chǎn)物合成途徑不僅受限于某個(gè)單一的限速步驟，而是依賴多個(gè)酶的協(xié)同平衡［13］。雖然通過質(zhì)粒過表達(dá)的方式可以實(shí)現(xiàn)單一基因的過表達(dá)，但同時(shí)也會(huì)造成細(xì)胞代謝高負(fù)荷，對(duì)生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)物合成均不利。近些年來，科學(xué)家們開發(fā)了多基因同時(shí)調(diào)控技術(shù)，合理調(diào)控代謝途徑表達(dá)的平衡。

Keasling 團(tuán)隊(duì)［14］開發(fā)了一種多基因同時(shí)調(diào)控技術(shù)， 稱為可調(diào)控基因區(qū)域文庫（tunable intergenic regions， TⅠGRs）技術(shù)。這一技術(shù)被成功用于大腸桿菌中外源甲羥戊酸（mevalonate）途徑的多基因協(xié)調(diào)表達(dá)，將甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了7 倍。Warner 等［15］開發(fā)了一種基因組可追蹤多元重組工程技術(shù)（trackable mutiplex recombinerring，TRMR），能同時(shí)對(duì)上千個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析和修飾。Ⅰsaacs 等［16］構(gòu) 建 了 多 元 自 動(dòng) 基 因 組 工 程 技 術(shù)（multiplex automated genome engineering， MAGE），能同時(shí)瞄準(zhǔn)并改造單個(gè)細(xì)胞基因組上的多個(gè)靶點(diǎn)，從而在一個(gè)細(xì)胞群體中形成基因組多樣性。利用自動(dòng)化的MAGE 技術(shù)，對(duì)番茄紅素生產(chǎn)途徑上的24 個(gè)基因同時(shí)改造，一天可以產(chǎn)生數(shù)十億不同基因型的突變株，經(jīng)過3天的進(jìn)化，從中挑選到番茄紅素生產(chǎn)能力提高了5倍的菌株。

本文作者團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種CRⅠSPR/Cas9輔助的染色體多基因同時(shí)編輯技術(shù)，基于未發(fā)生重組的菌株染色體被活性Cas9 切割導(dǎo)致死亡的特征，顯著提高了篩選效率，能在染色體上同時(shí)對(duì)三個(gè)基因進(jìn)行快速的文庫調(diào)控，三個(gè)基因同時(shí)編輯的效率達(dá)到了70%，操作周期為4 天。采用該技術(shù)，快速獲得了木糖代謝速率提高了3 倍的多基因編輯菌株［17］，極大地縮短了途徑優(yōu)化周期。該技術(shù)解決了傳統(tǒng)Red同源重組系統(tǒng)只能對(duì)單個(gè)基因進(jìn)行文庫調(diào)控的缺點(diǎn)，為代謝途徑多基因同時(shí)調(diào)控提供了新思路。

1.3 蛋白骨架技術(shù)

在細(xì)胞工廠的代謝途徑中，參與反應(yīng)的酶與底物之間的距離及合成途徑上相鄰的酶所處的空間位置是影響代謝途徑效率的一個(gè)重要因素。通過人工合成蛋白質(zhì)骨架的技術(shù)，使酶按照特定的空間位置錨定在骨架上，可以使相關(guān)的酶聚集在特定的區(qū)域，增加了酶與底物的結(jié)合概率，進(jìn)而提高產(chǎn)物合成速率［18］。另外，蛋白質(zhì)骨架也可以調(diào)節(jié)酶的催化效率，獲得最優(yōu)的催化效率組合，最終提高產(chǎn)物合成效率［19］。利用蛋白骨架技術(shù)，Keasling 團(tuán)隊(duì)將甲羥戊酸合成途徑的三個(gè)酶組裝到蛋白質(zhì)骨架上，將甲羥戊酸產(chǎn)量提高了77 倍［19］。近來，香港中文大學(xué)和武漢大學(xué)團(tuán)隊(duì)，利用RⅠAD和RⅠDD 短肽，將途徑中的多個(gè)酶按不同數(shù)量進(jìn)行連接和組裝，構(gòu)建出多酶復(fù)合體，能快速提高萜類化合物合成途徑的效率，并在釀酒酵母產(chǎn)番茄紅素細(xì)胞工廠中得到驗(yàn)證［20］。

1.4 基因動(dòng)態(tài)調(diào)控技術(shù)

細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜而精密的動(dòng)態(tài)過程，傳統(tǒng)的誘導(dǎo)型或固定強(qiáng)度啟動(dòng)子雖然可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，但外源代謝途徑往往會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成干擾，如有毒中間產(chǎn)物積累。另外，基因表達(dá)太弱又難以得到產(chǎn)物。因此，基因動(dòng)態(tài)調(diào)控技術(shù)受到越來越多的關(guān)注?；騽?dòng)態(tài)調(diào)控技術(shù)的基本思路是：設(shè)計(jì)人工基因回路，使細(xì)胞能夠感應(yīng)外部環(huán)境條件的變化，在適當(dāng)時(shí)間開啟或關(guān)閉基因表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)代謝通路的動(dòng)態(tài)調(diào)控。已經(jīng)建立的基因動(dòng)態(tài)調(diào)控技術(shù)有：環(huán)境信號(hào)誘導(dǎo)的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)（如碳源調(diào)控系統(tǒng)、光調(diào)控系統(tǒng)和溫度調(diào)控系統(tǒng)等）和內(nèi)源信號(hào)誘導(dǎo)的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)（如群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)和壓力感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)）［21］?；騽?dòng)態(tài)調(diào)控技術(shù)為細(xì)胞根據(jù)外部環(huán)境按需調(diào)控目的基因表達(dá)強(qiáng)度提供了技術(shù)方法。

1.5 高通量篩選技術(shù)

細(xì)胞工廠的快速構(gòu)建離不開高通量篩選技術(shù)的助力。高通量篩選實(shí)驗(yàn)的成功，依賴于恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、良好的分析方法和質(zhì)量控制方法，通過獲取可靠的測(cè)量值并選擇合適的閾值，從而“命中”目標(biāo)樣品［22］。微孔板是常用的高通量篩選試驗(yàn)器具，孔板內(nèi)發(fā)生的生物、化學(xué)和物理變化事件可以由多功能酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、液相色譜儀和質(zhì)譜儀等檢測(cè)儀器連續(xù)自動(dòng)化讀取。高通量篩選技術(shù)已用于基因調(diào)控元件強(qiáng)度分析［23］、酶元件的新活性檢測(cè)［24］、基因線路的活性檢測(cè)［25］、天然產(chǎn)物的活性篩選［26］等。可以預(yù)見，高通量篩選技術(shù)將在元件工程、線路工程、基因組工程、基因編輯和微生物組工程等合成生物學(xué)研究的多個(gè)層面拓寬研究思路。

2 微生物高效合成化學(xué)品的代謝調(diào)控機(jī)制

要獲得一個(gè)高效的細(xì)胞工廠，就需要從物質(zhì)代謝、能量代謝和細(xì)胞生理代謝三方面深入解析微生物高效合成化學(xué)品的代謝調(diào)控機(jī)制。物質(zhì)代謝方面，需要研究元件與合成途徑的適配機(jī)制，解除限速步驟，避免有毒中間代謝物積累，使碳代謝流最大程度地流向目標(biāo)化學(xué)品。能量代謝方面，需解析能量對(duì)合成代謝的調(diào)控機(jī)制，使細(xì)胞代謝底物時(shí)產(chǎn)生足夠的還原力和ATP 去滿足化學(xué)品合成需求。細(xì)胞生理代謝方面，需闡明細(xì)胞耐滲透脅迫機(jī)制，提高化學(xué)品的產(chǎn)量。下面以作者團(tuán)隊(duì)在丁二酸細(xì)胞工廠上的研究為例，從物質(zhì)代謝、能量代謝和細(xì)胞生理代謝三方面做具體的闡述（圖1）。

2.1 物質(zhì)代謝調(diào)控

圖1 微生物高效合成化學(xué)品的代謝調(diào)控機(jī)制Fig.1 Mechanisms of metabolic regulation for efficient production of chemicals

微生物化學(xué)品的合成途徑由多步生化反應(yīng)組成，參與反應(yīng)的酶元件與合成途徑的適配性，影響著產(chǎn)物合成的效率。蛋白酶催化活性太低，成為整條途徑的限速步驟；蛋白酶催化活性太高，而下游蛋白催化活性又較低，又會(huì)造成中間代謝物的積累。某些中間代謝物甚至對(duì)細(xì)胞會(huì)有較大的毒性，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。作者團(tuán)隊(duì)通過研究丁二酸合成途徑中各個(gè)酶的活性與丁二酸生產(chǎn)速率之間的相互關(guān)系，從合成途徑的19 步生化反應(yīng)中系統(tǒng)解析出4 個(gè)限速酶：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［27］、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶［28］、丁二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［29］和轉(zhuǎn)醛酶［30］（圖2）。優(yōu)化這4 個(gè)酶元件與途徑的適配性，構(gòu)建出了丁二酸高效合成途徑。

圖2 丁二酸合成的4個(gè)限速步驟Fig.2 Four rate-limiting steps for synthesis of succinate

2.2 能量代謝調(diào)控

還原力和ATP 是能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因素。細(xì)胞在代謝葡萄糖等底物時(shí)產(chǎn)生還原力，在合成化學(xué)品時(shí)需要還原力。還原力供給量若小于需求量，會(huì)影響化學(xué)品的轉(zhuǎn)化率和合成途徑效率。另外，細(xì)胞需產(chǎn)生足夠的ATP 供細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。

本文作者團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)研究了丁二酸厭氧合成的能量代謝調(diào)控機(jī)制。葡萄糖厭氧生產(chǎn)丁二酸的理論轉(zhuǎn)化率為1.71 mol/mol。通過糖酵解途徑，大腸桿菌每代謝1 mol 葡萄糖產(chǎn)生2 mol NADH，而合成1.71 mol 丁二酸需要3.42 mol NADH，這導(dǎo)致NADH 供給量與需求量之間的不平衡。為解決這個(gè)問題，作者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種新的還原力供給模式，用C5磷酸戊糖途徑替代C6糖酵解途徑，并結(jié)合轉(zhuǎn)氫酶，將1 mol 葡萄糖代謝產(chǎn)生的NADH 從2 mol 提高到3.67 mol（圖3），滿足了丁二酸最大轉(zhuǎn)化率的還原力要求。在實(shí)際生產(chǎn)中，將丁二酸的糖酸轉(zhuǎn)化率從1.12 mol/mol 提高到1.61 mol/mol（從理論最大值的65%提高到94%）［31］。

甘油是一種高還原力碳源，用于丁二酸生產(chǎn)有較大優(yōu)勢(shì)：1 mol 甘油與1 mol CO2理論上可合成1 mol 丁二酸。但在厭氧條件下，從甘油到丁二酸的合成途徑不能產(chǎn)生出足夠的ATP，導(dǎo)致丁二酸產(chǎn)量和生產(chǎn)速率相當(dāng)?shù)?。作者團(tuán)隊(duì)使用來自克雷伯氏菌的ATP 依賴型二羥基丙酮激酶（DhaK）替代了大腸桿菌原有的PEP 依賴型二羥基丙酮激酶（DhaKLM），在大腸桿菌中構(gòu)建出一條新的甘油厭氧代謝途徑。和原有途徑相比，新途徑能產(chǎn)生質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)為細(xì)胞生長(zhǎng)和丁二酸外排提供額外能量。丁二酸產(chǎn)量、比生產(chǎn)速率和胞內(nèi)ATP含量分別增加了282%、63%和338%［32］。利用質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)提高ATP供給也為途徑中能量代謝調(diào)控提供了思路（圖4）。

圖3 調(diào)控葡萄糖能量代謝模式解決丁二酸合成中的還原力問題Fig.3 Regulation of glucose energy metabolism to solve reducing equivalent problem for synthesis of succinate

圖4 調(diào)控甘油能量代謝模式解決丁二酸合成中的能量問題Fig.4 Regulation of glycerol energy metabolism to solve energy problem for synthesis of succinate

2.3 細(xì)胞生理代謝調(diào)控

優(yōu)越的細(xì)胞生理性能是獲得高效細(xì)胞工廠的關(guān)鍵因素之一。耐滲透脅迫是細(xì)胞生理性能的重要方面。對(duì)于分泌到胞外的大宗化學(xué)品，產(chǎn)量越高，滲透脅迫越大，細(xì)胞需具備耐滲透脅迫能力才能獲得高產(chǎn)量。作者團(tuán)隊(duì)在丁二酸細(xì)胞工廠中發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌細(xì)胞耐滲透脅迫的一種新機(jī)制。高滲透脅迫在厭氧條件下造成胞內(nèi)Cu（Ⅰ）的積累，對(duì)Fe-S 簇生物合成機(jī)器和含F(xiàn)e-S 簇的重要代謝酶具有很大的破壞性，導(dǎo)致細(xì)胞在生理和代謝層次的全局紊亂。cusCFBA基因簇的激活能提升細(xì)胞外排Cu（Ⅰ）的能力，使細(xì)胞具備更強(qiáng)的耐滲透脅迫能力。外源添加Cu（Ⅰ）螯合劑含硫氨基酸（甲硫氨酸或半胱氨酸）也能提高大腸桿菌細(xì)胞的耐滲透脅迫能力［33］（圖5）。該研究是首次發(fā)現(xiàn)含硫氨基酸可作為厭氧條件下的滲透保護(hù)物質(zhì)，為提升細(xì)胞耐滲透能力提供了一種新思路。

3 大宗化學(xué)品生物制造的具體案例

利用上述的技術(shù)路線和策略，國(guó)內(nèi)外研究人員構(gòu)建出了一系列的微生物細(xì)胞工廠，實(shí)現(xiàn)了多種大宗化學(xué)品的生物制造。本文將對(duì)氨基酸、有機(jī)酸和有機(jī)醇三類大宗化學(xué)品細(xì)胞工廠進(jìn)行闡述。

3.1 氨基酸

L-丙氨酸不僅是一種重要的氨基酸，還是重要的平臺(tái)化學(xué)品。用于生產(chǎn)新型環(huán)保無磷螯合劑甲基甘氨酸二乙酸（MGDA）、維生素B6和氨基丙醇等，全球市場(chǎng)容量約5 萬噸/年。作者團(tuán)隊(duì)通過合成途徑的設(shè)計(jì)與構(gòu)建，代謝進(jìn)化及細(xì)胞性能優(yōu)化，構(gòu)建出了能夠?qū)⑵咸烟歉咝мD(zhuǎn)化為L(zhǎng)-丙氨酸的細(xì)胞工廠［34］，在250 m3發(fā)酵罐中，發(fā)酵40 h，產(chǎn)量達(dá)155 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%。目前利用該技術(shù)在安徽華恒生物科技股份有限公司建成年產(chǎn)2.6 萬噸L-丙氨酸的生產(chǎn)線，在國(guó)際上首先實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法L-丙氨酸的產(chǎn)業(yè)化，生產(chǎn)成本比傳統(tǒng)技術(shù)降低50%以上。L-丙氨酸生產(chǎn)成本的降低，促進(jìn)了下游產(chǎn)品MGDA 的應(yīng)用。目前MGDA 全球需求量約16 萬噸，預(yù)計(jì)未來3～5 年全球MGDA 市場(chǎng)將以約22%的年復(fù)合增長(zhǎng)率保持增長(zhǎng)趨勢(shì)，進(jìn)而將帶動(dòng)L-丙氨酸需求的不斷增加。MGDA 的推廣應(yīng)用對(duì)保護(hù)水體生態(tài)環(huán)境意義重大［1］。該案例是國(guó)際上首個(gè)成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的厭氧發(fā)酵氨基酸品種，大幅減少資源和能源消耗，有效降低產(chǎn)品成本，并實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過程二氧化碳零放排。除L-丙氨酸以外，作者團(tuán)隊(duì)與華恒生物公司以相同的思路開發(fā)出L-纈氨酸厭氧發(fā)酵技術(shù)，推動(dòng)我國(guó)氨基酸產(chǎn)品在厭氧發(fā)酵領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。

圖5 大腸桿菌細(xì)胞耐滲透脅迫的新機(jī)制Fig.5 New osmotolerance mechanism of Escherichia coli

L-甲硫氨酸是人體必需氨基酸，在食品、醫(yī)藥及飼料添加劑方面有廣泛應(yīng)用。工業(yè)上主要通過化學(xué)法合成DL-甲硫氨酸，存在環(huán)境污染、分離困難等問題。韓國(guó)希杰集團(tuán)擁有成熟的生物法制備L-甲硫氨酸技術(shù)，其與阿克瑪共同投資4.5 億美元在馬來西亞建設(shè)世界首個(gè)生物L(fēng)-甲硫氨酸工廠，產(chǎn)能達(dá)8 萬噸［35］，其生產(chǎn)的L-甲硫氨酸比化學(xué)法合成的DL-甲硫氨酸的生物利用率提高了20%～40%［36］。浙江工業(yè)大學(xué)采用系統(tǒng)分析的策略［37］，上調(diào)或抑制了中央代謝和氨基酸合成途徑中的80個(gè)基因，探究了它們對(duì)積累L-甲硫氨酸的影響，并以此優(yōu)化了L-甲硫氨酸的代謝途徑，最優(yōu)菌株補(bǔ)料分批發(fā)酵48 h 產(chǎn)16.86 g/L 的L-甲硫氨酸。該研究探究了L-甲硫氨酸的生產(chǎn)瓶頸，對(duì)L-甲硫氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)有很大的指導(dǎo)意義。

3.2 有機(jī)酸

丁二酸是一種重要的平臺(tái)化合物，與其還原產(chǎn)物1，4-丁二醇聚合可生成重要的生物降解塑料聚丁二酸丁二醇酯（PBS），全球潛在市場(chǎng)達(dá)160億美元/年。目前其生產(chǎn)方式是以順酐為原料的石化路線。作者團(tuán)隊(duì)通過對(duì)丁二酸合成途徑進(jìn)行設(shè)計(jì)、調(diào)控和性能優(yōu)化，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中將糖酸轉(zhuǎn)化率提高至1.02 g/g。在山東蘭典生物科技股份有限公司成功應(yīng)用，已建成年產(chǎn)2 萬噸的生產(chǎn)線，在國(guó)內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的產(chǎn)業(yè)化，成本與傳統(tǒng)石化路線相比降低了20%。該技術(shù)對(duì)降低丁二酸成本，促進(jìn)PBS 可降解塑料產(chǎn)業(yè)實(shí)踐具有重要意義［1］。

D-乳酸（光學(xué)純度99.5%以上）是合成聚乳酸的關(guān)鍵原料。作者團(tuán)隊(duì)以大腸桿菌為底盤細(xì)胞，使D-乳酸成為厭氧條件下丙酮酸代謝的唯一途徑，并通過進(jìn)化代謝的方法構(gòu)建出高效生產(chǎn)高光學(xué)純度D-乳酸的大腸桿菌細(xì)胞工廠。該技術(shù)在山東壽光巨能金玉米得到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，D-乳酸光學(xué)純度超99.5%。建成了年產(chǎn)1 萬噸D-乳酸的生產(chǎn)線，在國(guó)內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法D-乳酸的產(chǎn)業(yè)化。該技術(shù)對(duì)降低高光純度D-乳酸成本，促進(jìn)聚乳酸可降解塑料產(chǎn)業(yè)推廣具有重要意義［1］。

丙二酸是高價(jià)值的化學(xué)品，主要用于醫(yī)藥、特種材料和香料，丙二酸及衍生化學(xué)品的市場(chǎng)規(guī)模超過10 億美元。石化法生產(chǎn)丙二酸需要氯乙酸和氰化鈉，成本高且污染環(huán)境。Lygos 公司開發(fā)了一種丙二酸的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，利用蛋白質(zhì)工程的方法，獲得了高活性丙二酰輔酶A水解酶，能將丙二酰輔酶A催化為丙二酸，優(yōu)化合成途徑后，最終獲得的高效的酵母細(xì)胞工廠，丙二酸產(chǎn)量可達(dá)100 g/L 以上。該技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了丙二酸的大規(guī)模發(fā)酵法生產(chǎn)［38］，對(duì)環(huán)境污染少，生產(chǎn)成本顯著低于石化法。

L-蘋果酸是一種重要的有機(jī)酸，可作為酸味劑，添加在食品中有防腐的作用。傳統(tǒng)的蘋果酸生產(chǎn)主要基于石油基化工路線，產(chǎn)品為DL-蘋果酸，應(yīng)用范圍有限。微生物發(fā)酵能生產(chǎn)高光學(xué)純度的L-蘋果酸，與DL-蘋果酸相比利用率更高。目前，絲狀真菌是合成蘋果酸的主要微生物，諾維信公司從米曲霉出發(fā)，強(qiáng)化了還原型TCA 途徑和蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸產(chǎn)量可達(dá)154 g/L，轉(zhuǎn)化率1.03 g/g［39］。然而，絲狀真菌發(fā)酵需要以葡萄糖或甘油為碳源導(dǎo)致原料成本高；需常溫（28～37 ℃），要進(jìn)行冷凝處理導(dǎo)致能源成本高。針對(duì)這些問題，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所從能夠耐高溫且能以纖維素為原料的嗜熱毀絲霉菌出發(fā)，構(gòu)建了可在45 ℃高溫條件下發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸的細(xì)胞工廠。在底物利用方面，不僅可以利用葡萄糖高效發(fā)酵合成L-蘋果酸，還可以直接利用纖維素和半纖維素，產(chǎn)量超過180 g/L。這種新的L-蘋果酸細(xì)胞工廠能高溫發(fā)酵，能利用多種底物，顯著降低了成本，具有廣闊的應(yīng)用前景。

戊二酸是一種重要的五碳平臺(tái)化合物，可用于合成聚酯和聚酰胺。北京化工大學(xué)設(shè)計(jì)了新的戊二酸合成途徑，利用大腸桿菌自身的賴氨酸降解途徑合成戊二酸，將降解途徑中伴生的L-谷氨酸和NAD（P）H 回補(bǔ)于賴氨酸合成途徑。輔因子被循環(huán)利用，形成強(qiáng)大的代謝驅(qū)動(dòng)力，使代謝流最大程度地流向戊二酸合成途徑。優(yōu)化天然轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，解決了中間產(chǎn)物尸胺和5-氨基戊酸的胞外積累問題。最終獲得的戊二酸細(xì)胞工廠，在補(bǔ)料發(fā)酵的條件下產(chǎn)量達(dá)54.5 g/L，轉(zhuǎn)化率0.54 mol/mol，這是目前報(bào)道的大腸桿菌產(chǎn)戊二酸的最高水平［40］。

己二酸是一種六碳二元羧酸，主要用于合成尼龍66、尼龍56 等尼龍纖維。己二酸的化工生產(chǎn)路線主要是硝酸氧化法（KA 油法），但環(huán)境污染嚴(yán)重。在生物合成方面，美國(guó)Ⅴerdezyne 公司、荷蘭DSM 公司和美國(guó)Genomatica 公司都在積極開展生物合成己二酸項(xiàng)目。江南大學(xué)將嗜熱裂胞菌Thermobifida fusca中的己二酸降解途徑反轉(zhuǎn)為己二酸合成途徑，己二酸的產(chǎn)量達(dá)到了0.36 g/L。進(jìn)一步確定了該途徑的關(guān)鍵限速酶為5-羧基-2-戊酰-CoA 還原酶，通過進(jìn)一步的代謝調(diào)控，最終獲得了己二酸細(xì)胞工廠，利用甘油發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)量達(dá)68 g/L［41］。

3.3 有機(jī)醇

1，3-丙二醇（PDO）是一種重要的化工材料，其與對(duì)苯二甲酸縮聚而成的對(duì)苯二甲酸丙二醇酯（PTT）是一種性能優(yōu)異的新型材料，不僅生物可降解，還具有滌綸的抗污性、腈綸的蓬松性和尼龍的彈性等特點(diǎn)。美國(guó)杜邦公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建了以葡萄糖為原料生產(chǎn)1，3-丙二醇的細(xì)胞工廠，將來自釀酒酵母的甘油合成途徑和來自克雷伯氏菌的1，3-丙二醇合成途徑導(dǎo)入大腸桿菌中，減少進(jìn)入TCA 循環(huán)的碳代謝流，促進(jìn)葡萄糖向甘油代謝，顯著提高了PDO 的轉(zhuǎn)化率，1，3-丙二醇產(chǎn)量達(dá)135 g/L， 生 產(chǎn) 速 率 達(dá)3.5 g（/L·h）， 轉(zhuǎn) 化 率 達(dá)1.21 mol/mol［42］。與傳統(tǒng)的石油化工路線相比，杜邦公司的1，3-丙二醇生產(chǎn)技術(shù)的能耗降低了40%，二氧化碳排放降低了40%。

1，4-丁二醇（1，4-BDO）主要用于制造聚酯和氨綸，每年的需求量達(dá)200萬噸。自然界中尚未發(fā)現(xiàn)1，4-丁二醇的合成途徑。Genomatica公司根據(jù)已知化合物官能團(tuán)的轉(zhuǎn)換，計(jì)算出10 000 種可能的1，4-BDO 合成途徑。并基于操作可行性篩選出兩種最優(yōu)的1，4-BDO 合成途徑，在此基礎(chǔ)上，在大腸桿菌中整合進(jìn)多種不同來源的基因進(jìn)而構(gòu)建出1，4-BDO 的合成途徑，1，4-BDO 產(chǎn)量初步達(dá)到18 g/L［43］。通過進(jìn)一步的調(diào)控，1，4-BDO 產(chǎn)量提升至200 g/L［44］。

異丁醇作為一種含有四個(gè)碳原子的高級(jí)醇，廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)和藥品等工業(yè)領(lǐng)域。由于異丁醇有高能量密度、較小的揮發(fā)和腐蝕性、較高的辛烷值等特點(diǎn)，是一種優(yōu)秀的燃油添加劑。利用氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）合成途徑的中間代謝物2-酮酸，在大腸中引入外源的2-酮酸脫羧酶（KDC）和醇脫氫酶（ADH），即可將不同碳鏈的酮酸中間物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的長(zhǎng)鏈醇。加州大學(xué)洛杉磯分校利用2-酮酸和Ehrilich 途徑構(gòu)建和優(yōu)化了異丁醇合成途徑。最終獲得的細(xì)胞工廠在微氧條件下，112 h異丁醇產(chǎn)量達(dá)到23g/L；進(jìn)一步采用原位汽提技術(shù)，減小異丁醇對(duì)細(xì)胞的毒性，72 h異丁醇的產(chǎn)量高達(dá)50g/L［45］。

4 總結(jié)與展望

細(xì)胞工廠現(xiàn)有的發(fā)展多是基于自然界中已有生物合成途徑的化學(xué)品。然而，絕大部分化學(xué)品是沒有天然生物合成途徑的，這給生物制造產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來了極大的挑戰(zhàn)。酶是細(xì)胞完成代謝催化的基本功能單元，是細(xì)胞工廠構(gòu)建的源泉。為了獲得所需要的功能基因，科學(xué)家們發(fā)展出了從蛋白質(zhì)非理性設(shè)計(jì)到半理性設(shè)計(jì)再到理性設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)改造技術(shù)，來獲得具有催化新功能的酶元件。蛋白質(zhì)非理性設(shè)計(jì)作為最早的蛋白質(zhì)進(jìn)化方法，其并不需要事先了解蛋白結(jié)構(gòu)信息和催化機(jī)制，通過位點(diǎn)飽和突變、易錯(cuò)PCR 及DNA shuffling 等技術(shù)建立文庫并篩選特定性狀提高的突變體，重復(fù)數(shù)輪積累有益突變最終獲得性能改進(jìn)或具有新功能的酶［46］。隨著對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的理解，并借助蛋白保守位點(diǎn)和晶體結(jié)構(gòu)分析，科學(xué)家們開發(fā)出半理性設(shè)計(jì)技術(shù)，通過預(yù)測(cè)一些蛋白的突變靶點(diǎn)，構(gòu)建具有針對(duì)性的突變體文庫，減少工作量。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于酶的立體/區(qū)域選擇性、穩(wěn)定性和催化活性的改造［47］，例如對(duì)P450-BM3 單加氧酶進(jìn)行改造，使其與醇脫氫酶或過氧化物酶偶聯(lián)用于手型二醇及衍生物的催化合成［48］。

蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)于2016 年被Science雜質(zhì)列入年度十大科學(xué)突破［49］，目標(biāo)是創(chuàng)造自然界不存在的并具有特定功能的酶。其中最有影響力的David Baker團(tuán)隊(duì)開發(fā)的Rosetta軟件是目前最強(qiáng)大的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)軟件，該軟件集蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)、酶活性中心設(shè)計(jì)、配體對(duì)接、生物大分子計(jì)算建模與分析于一身［50］。目前已有很多具有重要生物功能的新酶被設(shè)計(jì)出來，如以二氧化碳為碳源合成羥基丙酮的關(guān)鍵催化酶［51］、催化羥醛縮合反應(yīng)（retroaldol reaction）和狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（Diles-Alder reaction）的新酶［52-53］。中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所、中科院微生物所和山東大學(xué)團(tuán)隊(duì)合作，設(shè)計(jì)并創(chuàng)造了乙醇醛合酶， 繼而創(chuàng)造了一個(gè)合成乙酰輔酶A 的碳一（甲醛）代謝途徑［54］。中科院微生物所從新酶設(shè)計(jì)催化的角度實(shí)現(xiàn)了β-丙氨酸的生物合成。將來源于Bacillussp.YM55-1 的天冬氨酸酶用計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)，改變底物的偏好性，不以天冬氨酸為底物而以烯酸為底物，得到一系列位置選擇性與立體選擇性的人工β-氨基酸合成酶［55］，其中以丙烯酸為底物的β-氨基酸合成酶被用于β-丙氨酸的合成。該技術(shù)已與安徽華恒生物股份有限公司合作，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

隨著新酶設(shè)計(jì)能力的不斷提高，我們希望細(xì)胞工廠能像化學(xué)合成一樣，基本實(shí)現(xiàn)所有化學(xué)品的生物合成。同時(shí)，也希望通過合成生物學(xué)技術(shù)的輔助，讓越來越多化學(xué)品細(xì)胞工廠的生物制造成本不斷降低，與石化制造路線相比更有競(jìng)爭(zhēng)力。