洪 博 陳 剛 趙超陽 徐天嬌 孫輯凱 李文靜

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

甘草性平，味甘，歸十二經(jīng)，是一種補(bǔ)益中草藥，能清熱解毒，潤肺止咳，有調(diào)和諸藥性的效果[1-7]。甘草中的主要活性成分有芍藥苷、甘草苷、甘草酸等[8-13]。本研究選取已明確藥理作用、能代表甘草臨床作用的相關(guān)成分（芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸）作為研究和分析的對(duì)象[14-16]。有實(shí)驗(yàn)顯示，芍藥內(nèi)酯苷具有鎮(zhèn)靜、抗感染及護(hù)肝作用[17]；芍藥苷有降低血黏度、改善微循環(huán)、抗氧化等多種活性[18]；芹糖甘草苷具有止咳、平喘、化痰的作用[19]；甘草苷能抑制潰瘍的形成，并有抗氧化、抗人類免疫缺陷病毒等多種活性[20-24]；苯甲酰芍藥苷有抗氧化、抗肝纖維化及抗腫瘤作用[11]；甘草酸有抗感染、抗病毒和抗腫瘤等活性[12]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-1000 型高效液相色譜儀（山東魯南瑞虹化工儀器有限公司，含四元梯度泵、在線脫氣機(jī)）；Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（北京迪科馬科技有限公司）；AL204 型萬分之一電子天平（精密度為0.0001 g，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；BJ-150型高速多功能粉碎機(jī)（義馬市樂億佳商貿(mào)有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品芍藥內(nèi)酯苷（160516，純度＞98%）、芍藥苷（160524，純度＞98%）、芹糖甘草苷（160916，純度＞98%）、甘草苷（161201，純度＞98%）、苯甲酰芍藥苷（160517，純度＞98%）、甘草酸（160602，純度＞98%）均購自北京萊耀生物科技有限公司。甲醇、乙腈（色譜純，瑞典Oceanpak 公司），磷酸（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），乙醇（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司），水（杭州娃哈哈集團(tuán)）。甘草產(chǎn)地為甘肅（1： 180215；2：1 860402；3：180506）和內(nèi)蒙古（4： 181014；5： 181109；6：181119），藥材均經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室郭麗娜教授鑒定為豆科植物甘草的干燥根和根莖，符合《中國藥典》2015 年版一部及四部的相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相：0.05%磷酸-水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～22% B；10～32 min，22%～40% B；32～35 min，40%～45%B）；流速：1 mL/min；檢測波長：240 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25℃。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

于10 mL 量瓶中制備6 種待測對(duì)照品溶液，加入甲醇溶解、定容，濃度分別為：芍藥內(nèi)酯苷0.92 mg/mL、芍藥苷0.47 mg/mL、芹糖甘草苷0.99 mg/mL、甘草苷1.6 mg/mL、苯甲酰芍藥苷2.3 mg/mL、甘草酸0.44 mg/mL。

2.3 線性關(guān)系

按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定各對(duì)照品溶液的峰面積，見表1。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品進(jìn)樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制得到的6 個(gè)活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線均成良好的線性關(guān)系，見表2。

2.4 供試品溶液的制備

甘草藥材1.00 g 加入2 g 填料，用10 mL 70%乙醇萃取，濾液用0.22 μm 濾膜過濾，各種填料比較后選擇以中性硅藻土為填料。

圖1 對(duì)照品及甘草樣品的高效液相色譜圖

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)曲線中中間濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定并計(jì)算6 個(gè)待測藥效組分峰面積的RSD 值，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果分別為1.23%、0.95%、1.85%、1.21%、0.87%、1.08%，提示儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測定并計(jì)算6 個(gè)待測藥效組分峰面積的RSD 值，結(jié)果分別為0.75%、1.12%、0.99%、1.54%、0.81%、1.17%，提示24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

制備供試品溶液6 份，測定并計(jì)算6 個(gè)待測藥效組分峰面積的RSD 值，結(jié)果分別為1.45%、1.98%、1.56%、0.97%、1.57%、1.48%，提示本方法重復(fù)性好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取6 份已知含量的樣品，精密加入6 個(gè)待測化合物的對(duì)照品溶液，按照供試品溶液的制備進(jìn)行提取，進(jìn)樣分析，6 個(gè)藥效組分的平均回收率依次為98.44%、101.25%、96.78%、103.74%、97.85%、95.87%，RSD 值分別為1.98%、3.02%、2.85%、1.99%、2.47%、2.06%。

表1 各對(duì)照品的濃度C（mg/mL）及對(duì)應(yīng)的峰面積A

表2 各待測成分的曲線方程及線性關(guān)系

2.9 藥效組分含量測定

制備6 批來自不同產(chǎn)地甘草藥材供試品溶液，進(jìn)樣3 次，測定峰面積，計(jì)算含量。見表3。

表3 甘草藥材中6 種藥效組分含量的高效液相色譜分析（mg/g）

3 討論

本研究觀察了熱回流提取等傳統(tǒng)方法，最終確定使用固相萃取法進(jìn)行提取，比較了不同材料的提取率，確定中性硅藻土為吸附劑，以10 mL 70%乙醇為洗脫劑的提取效果最好。

本研究比較了以甲醇-水、乙腈-水及水相中加入醋酸、磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。當(dāng)以0.05%磷酸-水-乙腈系統(tǒng)為流動(dòng)相時(shí)，6 種成分的峰形對(duì)稱性明顯變好，分離度有所增加，且有較高的靈敏度和合適分析的檢測時(shí)間。色譜條件還考察了不同的流速，結(jié)果顯示，流動(dòng)相流速為1.0 mL/min 時(shí)，分離度達(dá)到要求且分離時(shí)間短。

本研究綜合考慮6 個(gè)待測成分的最大吸收波長，同時(shí)考慮到流動(dòng)相會(huì)對(duì)分析造成溶劑峰的影響，結(jié)合溶劑的截止波長，最終確定檢測波長為240 nm，可以避免一些雜質(zhì)峰的干擾，為科學(xué)全面評(píng)價(jià)甘草藥材質(zhì)量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。