丁小瑞 劉愛菊 張 瑋 張俊繪

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000

截止至2012 年調(diào)查顯示，中國的新生嬰兒出生缺陷為5.6%[1]，每年有約3.6 萬例新生兒染色體異常[2-3]?，F(xiàn)實生活中大多流產(chǎn)、死胎及出生缺陷的罪魁禍首就是染色體異常[4]。隨著超聲技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)前超聲檢查成為產(chǎn)前診斷必不可少的工具，我國把區(qū)別于結(jié)構(gòu)畸形的非正常聲像異常稱為超聲軟指標異常[5]，頸項透明層（NT）就是其中一項。NT 測量是妊娠早期篩查胎兒染色體異常的金標準[6]，NT 增厚與胎兒染色體異常呈正相關(guān)[7]。因此，NT 增厚作為產(chǎn)前診斷有創(chuàng)性篩查的指導(dǎo)依據(jù)。核型分析作為曾經(jīng)產(chǎn)前診斷的金標準，在檢測NT 增厚病例中，部分染色體核型正常但最終胎兒出現(xiàn)異常，研究發(fā)現(xiàn)，是基因組發(fā)生了細小的不均衡變異，最多見的是微缺失和微重復(fù)[8]，此類型是傳統(tǒng)染色體技術(shù)無法檢測的。熒光原位雜交技術(shù)（FISH）、熒光定量（PCR）、染色體微陣列分析（CMA）等新興技術(shù)的出現(xiàn)，使染色體研究領(lǐng)域有了更進一步的提升。CMA 是一項新的基因芯片技術(shù)[9-11]，覆蓋全基因組進行掃描，高分辨率能夠發(fā)現(xiàn)極小的基因拷貝數(shù)變異。因此，這種基因技術(shù)，被用來解決上述基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）即染色體片段的重復(fù)或缺失的疑難問題。本研究通過對NT 增厚病例行染色體核型分析及CMA檢測，對比兩者對異常染色體的檢出率，旨在探討CMA 在胎兒NT 增厚中的臨床價值，以及CNVs 在不同條件下檢出的差異性，以便更好地進行產(chǎn)前診斷及咨詢。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017 年12 月—2019 年12 月因超聲提示“胎兒NT 增厚”于內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心同時行核型分析及CMA 芯片檢測的185 例單胎妊娠孕婦。孕婦年齡18～40 歲，平均（30.28±4.42）歲。研究對象納入標準：①單胎；②參照英國胎兒醫(yī)學(xué)基金會（FMF）的測量標準，孕11～13+6周測量NT 值，NT≥3.0 mm；③孕婦知情并簽署知情同意書加入研究。

1.2 研究方法

1.2.1 超聲檢查及診斷標準 使用EPIQ 7 超聲波儀，檢查者嚴格按照英國FMF 的NT 質(zhì)控標準進行操作。檢查孕齡11～13+6周，每個對象重復(fù)測量3 次，取最大NT 值納入研究。目前，對于NT 截斷值存在爭議，國際上多采用NT 厚度超過第95百分位數(shù)為NT 增厚，但目前大部分研究者仍在使用NT≥3.0 mm 為NT 增厚；2.5 mm≤NT＜3.0 mm 為NT 臨界增厚[12]，此次實驗選取標準為NT≥3.0 mm。

1.2.2 標本采集 在腹部B 超引導(dǎo)下分別行絨毛穿刺（孕11～13+6周）或羊膜腔穿刺術(shù)（孕16～24 周）抽取絨毛少許或羊水30 mL 進行細胞培養(yǎng)行核型分析及CMA 芯片檢測。

1.2.3 實驗方法 CMA：采集絨毛或1 mL 羊水進行細胞沉淀，通過基因組DNA 提取試劑盒（Qiagen，德國），提取全血基因組DNA，通過美國Affymetrix 公司的Cytoscan 750K Array 芯片進行DNA 的分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 22.0 處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體結(jié)果異常的比較

染色體核型分析結(jié)果：總計185 例NT 增厚病例，染色體核型異常的39 例，染色體異常的發(fā)生率為21.08%，其中34 例為21 三體；3 例為18 三體；1 例：46，XN，del（18）（P11）；1 例：46，XN，t（15；17）（q15；q25）[4]/46，XN[122]。CMA 結(jié)果：共計185 例NT 增厚病例，染色體異常的59 例，染色體異常的發(fā)生率為31.89%，其中40 例為染色體數(shù)目異常（35 例為21 三體，3 例為18 三體，1 例為14UPD，1 例為47，XXX）；19 例為染色體結(jié)構(gòu)異常。見表1。

2.2 核型分析異常與CMA 結(jié)果比較

核型分析共檢出39 例染色體異常，包括21 三體34 例，18 三體3 例，嵌合體2 例：①46，XN，t（15；17）（q15；q25）[4]/46，XN[122] 1 例，CMA 檢測46，XN，后續(xù)檢測其父親染色體出現(xiàn)重合片段，證明染色體正常。②46XN[5]/47，XN+21，CMA 檢測結(jié)果為21 三體綜合征。1 例：46，XN，del （18）（P11），CMA 檢測結(jié)果18p11.32p11.2 缺失14.94 Mb，P。由此可以看出，CMA可以檢出核型分析中的非整倍染色體異常及對核型結(jié)果中未知額外標記染色體（sSMC）的內(nèi)容和來源得出更明確的信息，但CMA 無法識別平衡重排（易位/倒位/插入）。見表2。

2.3 核型分析正常CMA 檢測結(jié)果

對于核型分析正常病例CMA 檢測結(jié)果：微缺失/微重復(fù)檢出較染色體核型分析額外提高10.81%（20/185），致病性CNVs 的檢出率提高7.03%（13/185），CMA在微缺失/微重復(fù)方面要明顯優(yōu)于核型分析。見表3。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

單獨NT 異常與NT 異常聯(lián)合彩超其他結(jié)構(gòu)異常的病例，致病性CNVs 的檢出率分別是29.38%（47/160）和48.0%（12/25），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.564，P=0.006）。高齡孕婦與非高齡孕婦的病例中，致病性CNVs 的檢出率分別是45.16%（14/31）和41.56%（64/154），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.849，P=0.174）。

3 討論

目前，有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷主要針對高齡、超聲異常、血清學(xué)篩查高風(fēng)險等進行診斷[13]，傳統(tǒng)采用細胞培養(yǎng)和染色體核型分析。相對于傳統(tǒng)方法，CMA 技術(shù)分辨率更高，可檢出微缺失/微重復(fù)，然而CMA 可否替代傳統(tǒng)染色體核型分析作為主要產(chǎn)前診斷的方法，質(zhì)疑一直存在[14]。

表1 NT 增厚病例行染色體核型分析及CMA 結(jié)果

本次研究將傳統(tǒng)核型分析與CMA 技術(shù)聯(lián)合用于產(chǎn)前診斷，目的是探討CMA 技術(shù)臨床應(yīng)用價值。結(jié)果顯示：185 例NT 增厚病例，染色體核型分析中染色體異常39 例，CMA 中染色體異常的59 例，“NT 增厚”成為胎兒染色體異常的非特異標志物，NT 厚度與染色體異常和結(jié)構(gòu)異常的發(fā)生有直接關(guān)系[15-16]。CMA 較染色體核型分析多檢測出的微缺失/微重復(fù)病例為20 例，13 例為可能致病性或致病性（65%）。CMA 可以檢測到所有核型分析檢測的染色體異常，并且對微缺失/微重復(fù)的額外檢出率為10.81%，額外有效疾病診斷為7.03%，為減少出生缺陷提供了一種新型的檢測手段。2015 年一些學(xué)者對NT 增厚但核型正常的胎兒進行CNVs 分析，得出具有致病性CNVs 的微缺失/微重復(fù)檢出率達7.7%～8.3%[17-20]，本次實驗與此結(jié)果相符。在我國≥35 歲的孕婦歸為高齡孕婦，高齡是唐氏兒的重要因素之一。唐氏綜合征在我國的確診率僅有2.4/萬，而發(fā)達國家卻高達（8～15）/萬。本次實驗中高齡孕婦與非高齡孕婦比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），與2019 年Wu 等[21]研究年齡因素在NT 增厚病例中CMA異常檢出率無差異相一致。

本實驗核型分析共檢出嵌合體2 例：①46，XN，t（15；17）（q15；q25）[4]/46，XN[122] 1 例，CMA 檢測46，XN，后續(xù)檢測其父親染色體出現(xiàn)重合片段，證明染色體正常；雖說平衡重排一般不致病，但對未來妊娠會帶來后果[22]。②46XN[5]/47，XN+21，CMA 結(jié)果為21 三體綜合征。結(jié)構(gòu)異常1 例：46，XN，del（18）（P11），CMA結(jié)果18p11.32p11.2 缺失14.94 Mb，P。由此可以看出，CMA 可以檢出核型分析中的非整倍染色體異常及對核型結(jié)果中未知額外標記染色體（sSMC）的內(nèi)容和來源得出更明確的信息，但CMA 無法識別平衡重排（易位/倒位/插入）。7 例意義不明VOUS，35%的VOUS 檢出會給CMA 的咨詢解釋帶來挑戰(zhàn)，我們要不斷學(xué)習(xí)，提高認知水平，努力使自己的認知水平與日新月異的科技發(fā)展水平相適應(yīng)。隨著更多大規(guī)模前瞻性隊列研究和CMA 在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，CNV 數(shù)據(jù)庫將不斷完善，更多染色體病基因型-表型關(guān)系將不斷被闡明，CMA 在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域?qū)⒄宫F(xiàn)更大的應(yīng)用價值。

表2 39 例異常核型分析與CMA 檢測結(jié)果比較

綜上所述，CMA 技術(shù)可提高產(chǎn)前診斷的準確性，但CNV 臨床意義的不明確性使產(chǎn)前芯片的臨床咨詢更具挑戰(zhàn)性，隨著技術(shù)的不斷提高和數(shù)據(jù)的大量積累，CMA 技術(shù)將在產(chǎn)前診斷中發(fā)揮越來越重要的作用。

表3 20 例核型分析正常與CMA 檢測結(jié)果比較