胡 婷，鄒成梅，江吉周,2*

(1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，武漢 430205；2.湖北省地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測試中心自然資源部稀土稀有稀散礦產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430034)

苦丁茶，冬青科冬青屬植物，是一種常綠喬木，俗稱茶丁、富丁茶、皋盧茶，分布在西南地區(qū)及華南地區(qū)，在我國民間用于防病治病已經(jīng)具有悠久的歷史[1].苦丁茶多糖具有抑制特定脂肪細(xì)胞的增值和分化的功效[2-5]，黃酮類能通過調(diào)節(jié)基因片段抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散[6].苦丁茶多酚具有良好的抗氧化活性和保肝功能.潘研霞等[7]建立小鼠四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷模型，在添加劑量苦丁茶多酚成分后，小鼠的肝指數(shù)下降，小鼠血清中AST、ALT、TG、TC含量減少，病理學(xué)形態(tài)觀察證明苦丁茶多酚能緩解四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷.Wan等[8-9]研究表明，苦丁茶中的雙酚基奎酸能減輕小鼠結(jié)腸炎炎疾病活動(dòng)指數(shù)，促炎細(xì)胞因子，苦丁茶活性物質(zhì)是通過調(diào)節(jié)腸道微生物群來改善結(jié)腸炎病癥.苦丁茶主成分提取方法常見的有酶解法、微波輔提和超聲輔提法等.張海全[10]采用纖維素酶對(duì)苦丁茶熊果酸進(jìn)行酶解，對(duì)酶解中的溫度、pH等影響因素進(jìn)行考察，提取率較高.

高效液相色譜(HPLC)是分析復(fù)雜樣品中占據(jù)特殊地位，是檢測如中草藥等物質(zhì)的重要技術(shù)手段，HPLC能清晰分辨藥物中的各類活性物質(zhì)，通過對(duì)分離條件的優(yōu)化，能提高物質(zhì)的分離效果，在食品、藥品分析等領(lǐng)域使用廣泛，也在指紋圖譜的分析中常見其身影[11-13].中藥指紋圖譜能運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)獲得標(biāo)示某種藥材成分的色譜，從而較全面地反映植物內(nèi)在組分群的種類和數(shù)量，最終客觀評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的科學(xué)方法，成為分析藥物化學(xué)成分的常用手段[14-15].在苦丁茶成分提取并初步優(yōu)化的基礎(chǔ)上[16]，選擇色譜條件，為建立指紋譜圖提供良好基礎(chǔ).明確苦丁茶化學(xué)組成，可以通過指紋圖譜的建立實(shí)現(xiàn)，對(duì)其成分的表征和對(duì)不同產(chǎn)地苦丁茶成分的研究，分析其中差異，能夠?yàn)槠渌幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究以及質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)[17].

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10個(gè)批次的苦丁茶分別來自海南(S1～S5)、江西(S6、S7)、云南(S8、S9)和福建(S10)四個(gè)地區(qū)不同藥房采購.

甲醇、乙腈：色譜級(jí)，天津市化學(xué)試劑一廠；甲醇、乙醇、乙酸：分析級(jí)，天津市化學(xué)試劑一廠.

KL-100超聲清洗儀：深圳市科力超聲清洗設(shè)備有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜：安捷倫科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試品溶液的制備 樣品預(yù)處理：苦丁茶粉碎成末，過60目篩得到苦丁茶粗粉樣品.準(zhǔn)確稱取2.0 g苦丁茶粗粉，加入25 mL 75%乙醇溶液提取，提取30 min后抽濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮完成后在25 mL容量瓶定容，補(bǔ)充提取劑至刻度線，搖勻備用.吸取1 mL提取液過0.45 μm濾膜，裝入HPLC樣品瓶中待測.

1.2.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件[18]

1) 提取方法的選擇.按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，采取超聲和加熱回流兩種提取方法，提取30 min后抽濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮完成后補(bǔ)充提取劑至相同體積，并搖勻.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，通過檢測選擇提取效果最佳的提取方式.

2) 提取溶劑的選擇.按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和7種不同提取劑各25 mL，(水和不同體積分?jǐn)?shù)25 mL的乙醇、甲醇，如50%乙醇、甲醇、75%乙醇、甲醇、100%乙醇、甲醇，)，超聲提取30 min后抽濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮完成后補(bǔ)充提取劑至相同體積，并搖勻.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，通過檢測選擇最佳的提取劑.

3) 超聲時(shí)間的選擇.按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，在超聲時(shí)間(30、60、90、120 min)下提取，提取完成后抽濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮完成后添加溶劑至原來體積位置，并搖勻.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，通過檢測選擇最佳的提取時(shí)間.

4) HPLC色譜條件的選擇[19-21].按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加苦丁茶粗粉2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，超聲提取30 min后抽濾，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮完成后補(bǔ)充提取劑至相同體積，并搖勻.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，確定檢測波長為260 nm，在檢測過程中，考察不同比例流動(dòng)相(甲醇和水、0.1%醋酸、0.5%醋酸；乙腈和水、0.1%醋酸、0.5%醋酸)、緩沖液的洗脫方式及流速(0.2 mL·min-1、0.4 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1)等各個(gè)條件下的HPLC色譜的出峰情況.

1.2.3 參照峰的選擇 按料液比為1∶12.5 g·mL-1，添加標(biāo)品綠原酸2 g和25 mL 75%的乙醇溶液，即得綠原酸對(duì)照品溶液.從中吸取1 mL溶液過0.45 μm濾膜，將濾液放入HPLC樣品瓶中，通過檢測考察綠原酸對(duì)照品的出峰情況.

1.2.4 指紋圖譜的建立與評(píng)價(jià) 樣品檢測后所得各個(gè)批次苦丁茶的HPLC指紋圖譜，將數(shù)據(jù)結(jié)果放入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”中進(jìn)行處理與分析，生成10批苦丁茶樣品的HPLC指紋圖譜.

1.2.5 方法學(xué)考察

1) 精密度試驗(yàn).在已經(jīng)確定的色譜分析條件下，對(duì)批號(hào)為S1的苦丁茶試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄260 nm波長下色譜圖，根據(jù)有關(guān)資料的查詢，選擇參照峰為綠原酸，作為計(jì)算的依據(jù)，參照峰和保留時(shí)間被確定為1，連續(xù)5次進(jìn)樣后，可獲得對(duì)應(yīng)的RSD值.

2) 穩(wěn)定性試驗(yàn).S1批次的苦丁茶按要求制成樣品溶液，設(shè)置已確定的色譜條件，選擇時(shí)長為0、2、4、6、12 h，綠原酸為參照峰，計(jì)算RSD值.

3) 重復(fù)性試驗(yàn).S1批次的苦丁茶樣品，按優(yōu)化方案下1.2.2項(xiàng)中顯示方法，按照相同標(biāo)準(zhǔn)平行配置5份樣品溶液，根據(jù)已經(jīng)確定的色譜條件檢測，綠原酸為參照峰，計(jì)算RSD值.

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

如圖1所示，采用相同的提取試劑，兩者所得HPLC指紋圖譜出峰時(shí)間及種類都非常相似.但超聲提取法的操作可控性更高，所以選擇超聲輔提方式獲得提取物.

圖1 提取方法的考察Fig.1 Investigation of extraction methods

2.2 提取試劑的選擇

選擇以超聲提取法作為提取方式后，考察比較不同提取劑對(duì)苦丁茶主成分提取的影響.如圖2所示，在各提取劑的HPLC圖譜中，主成分的種類相同，從圖中可以看出，進(jìn)樣量相同時(shí)提取率存在差別，其中75%乙醇的分離效果更好，即選75%乙醇作為提取溶劑來進(jìn)行后面的實(shí)驗(yàn).

圖2 提取溶劑的考察Fig.2 Investigation of extraction solvents

2.3 超聲時(shí)間的選擇

如圖3所示，使用75%乙醇進(jìn)行超聲提取，不同提取時(shí)間的指紋圖譜中提取率的變化不明顯，隨著時(shí)間的增加主物質(zhì)的提取率并未出現(xiàn)增長的現(xiàn)象，從圖中可以看出，提取120 min后，含有的主成分量降低，超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)會(huì)增大介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)速度，使提取劑與所提物質(zhì)充分接觸提高提取率，與此同時(shí)也會(huì)造成極大的破壞作用，苦丁茶在較長時(shí)間的超聲震動(dòng)中，會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)一定程度的分解，影響主成分的提取，因此提取時(shí)間過長是不適宜的，綜合整體情況考慮，30 min的提取時(shí)間是合適的選擇.

圖3 提取時(shí)間的考察Fig.3 Investigation of extraction time

2.4 HPLC色譜條件的選擇和優(yōu)化

2.4.1 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 采取5種不同系統(tǒng)的流動(dòng)相解決苦丁茶中含有少量綠原酸帶來的拖尾現(xiàn)象，盡管在加入三乙胺后狀況有所改善，但其自身對(duì)實(shí)驗(yàn)會(huì)造成一定的影響，因此改變系統(tǒng)中的流動(dòng)相能從根本上解決兩者的困擾.如圖4所示，在未添加冰醋酸(甲醇—水、乙腈—水)系統(tǒng)中的分離效果較添加冰醋酸的效果差，出現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象，不作為考慮對(duì)象.在加入冰醋酸后，分離度發(fā)生改變，冰醋酸的濃度從0.1%增加至0.5%,出峰的形狀和時(shí)間趨向于預(yù)期效果，比較甲醇—0.5%冰醋酸和乙腈—0.5%冰醋酸的色譜圖可以看出，組分的出峰時(shí)間最為合適的是甲醇-0.5%冰醋酸流動(dòng)相.

2.4.2 洗脫方式的選擇 HPLC法中，存在等度洗脫和梯度洗脫兩種方式，梯度洗脫是指改變鹽的濃度增加洗脫雜質(zhì)的效果，一般適用于成分復(fù)雜，雜峰出現(xiàn)時(shí)間晚的情況，等度洗脫的單一濃度對(duì)雜質(zhì)的洗脫效果更佳，但操作也更為復(fù)雜.苦丁茶中所含化學(xué)成分復(fù)雜且極性相差較大，兩者分開使用分離不完全，將兩者結(jié)合會(huì)有更加的效果.如表1中所示，實(shí)驗(yàn)采取等梯度洗脫的方式結(jié)合，極大程度考慮出峰時(shí)間晚及分離狀況不佳的現(xiàn)象.圖5中能明顯看出，此洗脫程序應(yīng)用時(shí)出峰時(shí)間適中，分離效果好，色譜峰信息較為豐富.

2.4.3 檢測波長的選擇 圖6所示為波長掃描范圍200～400 nm特定波長下的色譜圖，通過不同波長之間的色譜圖進(jìn)行相互對(duì)比發(fā)現(xiàn)，260 nm波長下苦丁茶樣品出峰數(shù)目較多，色譜峰分離度和均衡性較好，因此，選擇檢測波長為260 nm.

2.4.4 流速的選擇 如圖7所示，在確定洗脫方式后，比較不同流速在260 nm波長檢測下的出峰情況，不同流速下的色譜圖差別較大，0.2 mL·min-1時(shí)的色譜圖中主峰和雜峰的相互交錯(cuò)，主要物質(zhì)的分離效果不佳，而流速為0.8 mL·min-1和1.0 mL·min-1時(shí)樣品中出峰時(shí)間過快，且1.0 mL·min-1分離度不佳.對(duì)比流速0.4 mL·min-1和0.6 mL·min-1的色譜圖，兩者比較相似，峰形和分離效果都較好，其中流速為0.6 mL·min-1的出峰時(shí)間稍早些更為合適，因此選擇流速0.6 mL·min-1最為恰當(dāng).

2.5 參照峰的選擇

苦丁茶樣品中化學(xué)成分眾多，含有綠原酸等常見物質(zhì)，因此量取標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸溶液4 μL 按照上述選擇的最優(yōu)色譜條件進(jìn)樣分析，考察綠原酸作為對(duì)照樣品的適宜性.如圖8綠原酸溶液分析的HPLC色譜圖，該圖中色譜峰的出峰時(shí)間及響應(yīng)值都良好，適合作為樣品檢測的參照峰.

圖4 流動(dòng)相的選擇Fig.4 Investigation of mobile phases

表1 洗脫程序Tab.1 Elution program

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取S1批號(hào)的苦丁茶樣品，按上述提取優(yōu)化條件制成供試樣液，采用已確定的色譜條件檢測，整理連續(xù)5次進(jìn)樣檢測的數(shù)據(jù)，計(jì)算得到RSD值.如表2所示，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.014 2%～0.135 3%，相對(duì)峰面積的RSD為0.257 4%～3.960 9%，在此結(jié)果范圍內(nèi)，儀器精密度合格.

圖5 洗脫程序色譜圖Fig.5 Elution program chromatogram

圖6 HPLC不同檢測波長的考察結(jié)果Fig.6 Investigation of different detection wavelength

圖7 HPLC流速的考察Fig.7 Investigation of flow rate

圖8 綠原酸的HPLC色譜圖Fig.8 HPLC diagram of chlorogenic acid

表2 精密度試驗(yàn)RSD結(jié)果Tab.2 Precision test RSD results %

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1批號(hào)的苦丁茶樣品，按上述提取優(yōu)化條件制成供試樣液，按最優(yōu)色譜條件檢測，考察樣品在0、2、4、6、12 h內(nèi)的穩(wěn)定性，計(jì)算得到RSD值，結(jié)果如表3所示.從表中可以看出，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.021 5%～0.139 1%，相對(duì)峰面積的RSD為0.542 6%～3.924 1%，數(shù)據(jù)結(jié)果顯示該苦丁茶樣品溶液在12 h內(nèi)具有穩(wěn)定性.

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1批號(hào)的苦丁茶樣品，按上述提取優(yōu)化條件制成供試樣液，平行制備5份，進(jìn)行檢測.如表4結(jié)果顯示，共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.013 2%～0.133 2%，相對(duì)峰面積的RSD為0.642 3%～4.047 0%，樣品溶液在該優(yōu)化條件下檢測重現(xiàn)性較好.

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD結(jié)果Tab.3 Stability test RSD results %

表4 重復(fù)性試驗(yàn)RSD結(jié)果Tab.4 RSD results of repeated tests %

2.7 建立指紋圖譜與相似度評(píng)價(jià)

2.7.1 10批苦丁茶樣品指紋圖譜建立 指紋圖譜的建立及研究結(jié)果可為后續(xù)苦丁茶藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ).按照前文中最優(yōu)提取條件將各地區(qū)藥房中得到的不同批次苦丁茶樣品制備成供檢測樣液，總計(jì)10批樣品溶液.按照最優(yōu)色譜條件依次檢測，得到來自不同藥房10批苦丁茶的HPLC色譜圖，如圖9所示.圖10是利用軟件“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”處理后的對(duì)照HPLC指紋圖譜，而此實(shí)驗(yàn)的完成，能初步對(duì)苦丁茶的主成分進(jìn)行表征，是苦丁茶藥物藥效研究的重要環(huán)節(jié).

圖9 10批苦丁茶樣品的HPLC圖譜Fig.9 HPLC analysis of 10 batches of Ilex latifolia Thunb.samples

圖10 苦丁茶對(duì)照指紋圖譜Fig.10 Reference fingerprint of Ilex latifolia Thunb.

表5中可以看出相對(duì)峰面積RSD最高達(dá)到39.031 0%，最低為15.683 6%，結(jié)果表明，各批次苦丁茶的組分含量之間存在較大差異，10批苦丁茶產(chǎn)地的種植條件，環(huán)境氣候以及貯存方式都可能是產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因.

表5 10批苦丁茶指紋圖譜共有峰RSD結(jié)果Tab.5 RSD results were found in fingerprints of 10 batches of Ilex latifolia Thunb. %

2.7.2 相似度評(píng)價(jià) 表6中可知，軟件數(shù)據(jù)處理時(shí)可直接匹配10批苦丁茶的指紋峰，與已有的共有模型測定相關(guān)性，最終數(shù)據(jù)為10批樣品相似度均>0.9，符合中藥指紋圖譜技術(shù)要求.

表5、6的結(jié)果顯示，10批苦丁茶的相對(duì)保留時(shí)間RSD值<1%，所含化學(xué)成分保持一致，相似度>0.9，符合中藥指紋圖譜技術(shù)要求，表明不同批次樣品雖然存在各種影響組分含量差異的原因，但其基本比例還會(huì)保持一定水平，對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中影響相對(duì)較小，建立苦丁茶HPLC指紋圖譜能真實(shí)反映質(zhì)與量的關(guān)系，幫助苦丁茶的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù).

表6 10批不同產(chǎn)地苦丁茶相似度Tab.6 Similarity of 10 batches of Ilex latifolia Thunb.from different origins

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在綜合考慮苦丁茶樣品的提取率和組分含量后，對(duì)供試樣品制備過程中的提取方式、提取時(shí)間以及提取試劑等三個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化.加熱提取和超聲提取的色譜圖差異小，相似度高，但從操作簡便的角度看，超聲提取更具優(yōu)勢.在同種提取方式下，考察了不同提取溶劑對(duì)苦丁茶提取率高低，最終選擇75%乙醇作為提取劑.確定提取方式和提取溶劑后，比較不同超聲時(shí)間30 min、60 min、90 min、120 min的適宜性，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增長提取率變化不大，且超聲時(shí)間過長對(duì)苦丁茶的成分結(jié)構(gòu)有破壞，因此選擇30 min作為超聲提取時(shí)間.HPLC能清晰分辨藥物中的各類活性物質(zhì)，分離條件的優(yōu)化，在主成分分離和組分種類分析中具有重要作用，確定了流動(dòng)相為甲醇—0.5%醋酸、等梯度洗脫方式、吸收波長為260 nm、流速為0.6 mL·min-1的最優(yōu)色譜條件，通過對(duì)分離條件的優(yōu)化，則會(huì)減少進(jìn)樣物質(zhì)不必要的損耗，出峰效果上也能有很好的輔助作用.精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性方法學(xué)實(shí)驗(yàn)，是一項(xiàng)保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)縝密的程序性流程，很大程度上增加數(shù)據(jù)的嚴(yán)謹(jǐn)性.結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所用儀器的精密度良好，樣品溶液12 h內(nèi)保持較高穩(wěn)定性，在優(yōu)化的提取方式和檢測條件下樣品展現(xiàn)良好重復(fù)性.實(shí)驗(yàn)成功建立苦丁茶的指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)苦丁茶主物質(zhì)初步探究，并在相應(yīng)的軟件中，對(duì)10批苦丁茶樣品的共有峰進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果為10批樣品相似度均>0.9，符合要求.