馮文杏， 胡銳， 孫新鋒， 韓志毅， 馬文峰， 張衛(wèi)， 周小舟

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518033）

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，異質(zhì)性強，死亡率高。約90%與癌癥相關(guān)的死亡是由轉(zhuǎn)移性疾病而不是原發(fā)性腫瘤引起的[1-2]。侵襲性腫瘤前緣細(xì)胞多表現(xiàn)出一種去分化的形態(tài)，這種形態(tài)是由上皮標(biāo)志物和細(xì)胞與細(xì)胞間連接的丟失引起的，并獲得間葉細(xì)胞標(biāo)志物的表達[3-4]，這種細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變程序稱為上皮間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。上皮間質(zhì)化與多種腫瘤功能相關(guān)，包括腫瘤的發(fā)生、惡性進展、腫瘤的干性、腫瘤細(xì)胞的遷移、侵入血管、轉(zhuǎn)移和對治療的抵抗等方面[5]。中醫(yī)學(xué)無“肝癌”病名，根據(jù)相關(guān)癥狀其隸屬于“鼓脹”“肝積”“肝脹”等范疇，在病因病機上存在正虛邪實的特點?；谶@一特點，周小舟主任在臨床中運用芪術(shù)抗癌方治療肝癌獲得了良好的療效[6]，但其機制尚不明確。因此，本研究通過體外實驗探討芪術(shù)抗癌方對肝癌HepG2 細(xì)胞上皮間質(zhì)化的影響，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株HepG2購自武漢博士德公司。

1.2試劑與儀器轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）（美國R&D 公司）；E 鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、N 鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體、Vimentin 抗體、Snail 抗體、纖黏蛋白（Fibronectin）抗體（美國Abcam 公司）；GAPDH 抗體、β-actin 抗體（美國Sigma 公司）。ChemiDocTMMP 全自動凝膠成像和化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)、垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3芪術(shù)抗癌方凍干粉浸提液制備芪術(shù)抗癌方由黃芪10 g、炒白術(shù)15 g、柴胡5 g、白芍10 g、薏苡仁30 g、淮山藥15 g、雞內(nèi)金10 g、莪術(shù)10 g、白花蛇舌草15 g、炙甘草5 g 組成，各中藥材凍干粉由深圳市中醫(yī)院制劑科制備。浸提液制備方法：用微量天平稱取凍干粉置于無菌離心管中，以DMEM培養(yǎng)液充分溶解，用0.22 μm微孔濾器過濾得到母液，以DMEM稀釋獲得1 mg/mL濃度的浸提液，均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與傳代人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）+1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)95%濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2。每2 d 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞生長融合達80% ～90%時，以2.5 g/L 胰蛋白酶[含0.2 g/L 乙二胺四乙酸（EDTA）]消化、傳代。

1. 5分組并鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)將指數(shù)生長的HepG2 細(xì)胞按1×106個/孔接種在6 孔板，貼壁后，空白對照組以DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，TGF-β1組加入TGF-β 10 ng/mL 培養(yǎng)，中藥組分別加入TGF-β1 10 ng/mL+芪術(shù)抗癌方浸提液1 mg/mL、TGF-β1 10 ng/mL+芪術(shù)抗癌方浸提液2 mg/mL 培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.6劃痕實驗觀察細(xì)胞遷移能力實驗前在超凈臺用記號筆在6 孔板背后沿直尺均勻地劃橫線5 ～6 條，接種細(xì)胞量以隔夜能達到80%為計。第2 天吸除培養(yǎng)基，用槍頭比著直尺垂直于板背后的橫線劃痕，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕洗3 次，洗去劃下的細(xì)胞。分組培養(yǎng)方法同“1.5”項，分別于0 h 和培養(yǎng)24 h 在同一劃痕處顯微鏡下拍照。用ImageJ 軟件計算0、24 h 劃痕面積，愈合百分比=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%。

1. 7蛋白免疫印記法檢測細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Snail的表達將指數(shù)生長的HepG2 細(xì)胞按1×106個/孔接種在6 孔板，貼壁后分組培養(yǎng)方法同“1.5”項。48 h 后吸除培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置于冰上提取細(xì)胞蛋白，蛋白濃度及配平采用Bradford 法，配平后于100 ℃水浴10 min 變性，離心，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)蛋白分子量配制相應(yīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠，將等量蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉60 min，孵育對應(yīng)一抗4 ℃冰箱過夜，孵育對應(yīng)二抗，曝光顯影、圖像分析。采用Image-Lab軟件進行電泳條帶灰度值分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin或GAPDH）灰度值的比值表示。

1.8統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較，方差齊時采用LSD 檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組HepG2細(xì)胞形態(tài)變化比較圖1 結(jié)果顯示：HepG2細(xì)胞加入TGF-β1后，可見細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長多形樣間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變（箭頭處），而加入芪術(shù)抗癌方共培養(yǎng)的2個治療組，可見細(xì)胞呈鈍圓，維持緊密連接。

圖1 各組HepG2細(xì)胞形態(tài)變化比較（×40）Figure 1 Comparison of the morphological changes of HepG2 cells in various groups（×40）

2.2各組HepG2細(xì)胞遷移能力比較圖2 結(jié)果顯示：HepG2細(xì)胞加入TGF-β1后，細(xì)胞劃痕愈合百分比增加，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；加入芪術(shù)抗癌方共培養(yǎng)的2 個治療組細(xì)胞劃痕愈合百分比較TGF-β1 組均顯著減?。≒<0.05）。

圖2 各組HepG2細(xì)胞遷移能力比較Figure 2 Comparison of the migration abilities of HepG2 cells in various groups

2. 3各組HepG2細(xì)胞上皮間質(zhì)化蛋白表達情況比較圖3 結(jié)果顯示：TGF-β1 組上皮表型標(biāo)記物E-cadherin表達水平較空白對照組降低，間質(zhì)表型標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin、Fibronectin 和Snail表達水平較空白對照組均升高，其中，2 組的Fibronectin 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與TGF-β1組比較，芪術(shù)抗癌方2 個治療組E-cadherin表達水平均升高，N-cadherin、Vimentin、Snail 和Fibronectin 表達水平均降低，其中：芪術(shù)抗癌方1 mg/mL 組Vimentin、Snail 表達水平，與TGF-β1組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；芪術(shù)抗癌方2 mg/mL 組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Fibronectin表達水平，與TGF-β1組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05 或P<0.01）。表明芪術(shù)抗癌方對HepG2 細(xì)胞上皮間質(zhì)化的抑制作用呈濃度依賴性，濃度越高，抑制效果越大。

圖3 各組HepG2細(xì)胞上皮間質(zhì)化蛋白表達情況比較Figure 3 Comparison of the expression of EMT proteins in HepG2 cells from various groups

3 討論

芪術(shù)抗癌方為周小舟教授在臨床治療肝癌患者經(jīng)驗中總結(jié)創(chuàng)立的。周小舟教授認(rèn)為肝癌的主要病因是正氣不足與外感疫毒相互作用所致，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有關(guān)乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、過度飲酒等病原因素與機體免疫失調(diào)研究[7]的綜合結(jié)果，通過臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)肝癌的主要證型是氣虛血瘀[8]。芪術(shù)抗癌方以益氣散結(jié)、疏肝健脾為法，方中：黃芪益氣扶正、莪術(shù)活血消積為君，白術(shù)、雞內(nèi)金、山藥補脾散結(jié)為臣，柴胡、白芍疏肝柔肝，白花蛇舌草、薏苡仁養(yǎng)肝利濕為佐，炙甘草調(diào)和諸藥。突出了“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實脾”的思想。周小舟課題組對芪術(shù)抗癌方進行了系列臨床研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)導(dǎo)管肝動脈化療栓塞術(shù)（TACE）+抗癌方組與單純行TACE組比較，總有效率分別為90.6%（29/32）、65.6%（21/32），腫瘤初次復(fù)發(fā)率分別為9.37%（3/32）、34.38%（11/32），可明顯改善患者的生存質(zhì)量、減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移并提高患者的生存率[9]。

上皮間質(zhì)化是胚胎發(fā)育和器官形成過程中至關(guān)重要的細(xì)胞重塑過程，是上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)特征的細(xì)胞生物學(xué)行為，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，變成多形和松散的間質(zhì)狀態(tài)。上皮間質(zhì)化是執(zhí)行對特殊誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化因子即上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）、miRNAs、表觀遺傳和轉(zhuǎn)化后調(diào)節(jié)子表達的反應(yīng)[10]，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞去分化，抑制上皮細(xì)胞特征蛋白的表達，包括E-cadherin，以及激活間質(zhì)化表型蛋白，包括N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等。SNAIL、TWIST、ZEB家族被認(rèn)為是主要的EMT-TFs，已被大量實驗證實[11-12]。

癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)化以上皮細(xì)胞極性的喪失、E-cadherin 相關(guān)的細(xì)胞與細(xì)胞間黏合劑的崩解、間質(zhì)標(biāo)記陽性獲得為特征，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的遷移性增加[13]。在一定情況下多種經(jīng)典生長因子均可誘發(fā)上皮間質(zhì)化，這些因子不僅僅由腫瘤細(xì)胞分泌，也可以由腫瘤基質(zhì)細(xì)胞分泌，其中TGF-β被認(rèn)為是上皮間質(zhì)化最有效的誘導(dǎo)因子之一[14-15]。中醫(yī)藥在肝癌的治療中顯示其獨特優(yōu)勢，在對部分中藥單體（如姜黃素、槲皮素、木犀草素、白藜蘆醇等）及復(fù)方的研究中發(fā)現(xiàn)其有一定的抗上皮間質(zhì)化效果[16]。

綜上所述，本研究用TGF-β1刺激HepG2細(xì)胞后，HepG2 細(xì)胞的形態(tài)向多形和狹長狀間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，間質(zhì)表型蛋白表達增強，細(xì)胞遷移能力增加，提示TGF-β1誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)化。而加入芪術(shù)抗癌方共培養(yǎng)后，細(xì)胞可維持在緊密連接狀態(tài)，上皮表型蛋白表達增強，間質(zhì)表型蛋白表達較減弱，細(xì)胞遷移能力下降，表明芪術(shù)抗癌方對TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞上皮間質(zhì)化具有抑制作用，但這種抑制效果的具體機制還需要進一步研究。