宋奕， 丁道芳， 朱寅， 王星華

（1.蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇蘇州 215000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心，上海 201203；3.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 201203）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）好發(fā)于使用頻繁，且負(fù)重大、活動(dòng)多的關(guān)節(jié)，如膝、髖、脊柱、踝等，其中又以膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）最為常見。根據(jù)最新的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)目前癥狀性KOA 的患病率為8.1%，這一比例意味著我國(guó)目前大約有1.1 億KOA 患者，而65 歲以上KOA 患病率甚至已達(dá)到50%[1]。KOA 的主要病理改變是軟骨的退行性變。正常情況下軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，而在KOA 狀態(tài)，這一平衡被打破，最終導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的退變和凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)的松散。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)腔的炎癥是導(dǎo)致這一平衡被打破的主要原因之一，且KOA 發(fā)病過程中的炎癥反應(yīng)及軟骨退變都有絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）- MAPK 激酶（MEK）信號(hào)通路參與。對(duì)于KOA 的治療，目前除了健康教育和功能鍛煉外，仍以藥物治療為主。膝痹通絡(luò)方是蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院治療KOA 的經(jīng)驗(yàn)方，臨床取得較好療效，能顯著改善膝關(guān)節(jié)疼痛及活動(dòng)度。炎癥因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）是KOA 炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，本研究通過以其誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞退變模擬KOA 軟骨退變，觀察膝痹通絡(luò)方含藥血清對(duì)退變軟骨細(xì)胞的影響，并從MAPK-MEK 信號(hào)通路探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物新生24 h 雌性SD 大鼠10 只，清潔級(jí)雌性3 月齡SD 大鼠20 只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（滬2008-0016）。

1. 2藥物、試劑與儀器膝痹通絡(luò)方組成中藥（杜仲10 g，牛膝10 g，黃芪20 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g，白芍10 g，獨(dú)活10 g，雞血藤30 g，秦艽6 g，木瓜10 g）由蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供，為江陰江天藥業(yè)免煎顆粒劑；胎牛血清、H-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（法國(guó)Biowest 公司）；IL-1β（美國(guó)RD 公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（美國(guó)Sigma 公司）；PCR 試劑盒（美國(guó)Selleck 公司）；性別決定區(qū)Y框蛋白（SOX9）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）抗體、磷酸化原癌基因絲蘇氨酸蛋白激酶（P-Raf1）抗體、Raf1 抗體、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶（p-MEK1）抗體、MEK1抗體、GAPDH 抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）抗體（美國(guó)EarthOx 公司）。離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；IX41 顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法及免疫熒光鑒定采用上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學(xué)中心已成熟的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法[2]。將10只新生24 h雌性SD 大鼠脫頸椎處死，取雙側(cè)肱骨頭處軟骨，清除殘留組織后剪成1 mm × 1 mm × 1 mm 大小骨塊，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)用1 g/L 的Ⅱ型膠原酶消化1 h，收集消化后的細(xì)胞懸浮液，并重復(fù)3～4 次，懸浮液離心后收集細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸并接種細(xì)胞，隔日換液。取P1代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞鑒定：以40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞10 min后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2 次，磷酸鹽Tween20緩沖液（PBST）通透20～30 min，體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉浸泡1 h，加入Ⅱ型膠原抗體（稀釋度為1∶200），4 ℃孵育過夜。再用PBS清洗3 次，加入FITC 標(biāo)記的抗小鼠二抗（稀釋度1∶200），室溫避光孵育1 h，PBST 清洗3次后加入DAPI 染液（10 μg/L），5 min 后熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.4膝痹通絡(luò)方含藥血清制備膝痹通絡(luò)方中藥顆粒劑混合后用開水沖泡，充分?jǐn)嚢枞芙?、冷卻，根據(jù)人-大鼠體表面積比值折算出大鼠口服劑量為10.86 g·kg-1·d-1，以5.43、10.86、21.72 g·kg-1·d-1的口服劑量分別設(shè)為低、中、高濃度組。將20 只清潔級(jí)雌性3 月齡SD 大鼠隨機(jī)分成4 組，其中正常組8只，高、中、低濃度中藥組各4只，每200 g體質(zhì)量大鼠每日灌胃2 mL，高、中、低濃度中藥組大鼠分別對(duì)應(yīng)灌胃高、中、低濃度膝痹通絡(luò)方，正常組每日灌胃等體積生理鹽水。每日灌服1 次，連續(xù)3 d。末次灌藥1 h后腹主動(dòng)脈取血，取上層血清56 ℃滅活后過濾分裝，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細(xì)胞分組培養(yǎng)收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的軟骨細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，以5 mL接種于直徑6 cm 培養(yǎng)皿，將細(xì)胞隨機(jī)分為5 組，即正常對(duì)照組、IL-1β 組、高濃度中藥組、中濃度中藥組和低濃度中藥組。正常對(duì)照組：加入正常大鼠血清培養(yǎng)；IL-1β組：加入正常大鼠血清和20 ng/mL IL-1β培養(yǎng)；高、中、低濃度中藥組：分別對(duì)應(yīng)加入高、中、低濃度的膝痹通絡(luò)方含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，并加入20 ng/mL IL-1β。培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡（100 倍）下觀察軟骨細(xì)胞大小、密度與形態(tài)，同時(shí)提取細(xì)胞RNA 和蛋白進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)。

1.6 qPCR法檢測(cè)軟骨細(xì)胞MMP3、SOX9、A-CAN、ADAMTS4/5基因的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，抽提軟骨細(xì)胞總RNA并進(jìn)行濃度測(cè)定，取2 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)的相對(duì)變化，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃30 s，初步變性1 個(gè)循環(huán)；95 ℃5 s變性，60 ℃30 s 退火，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)；72 ℃30 s延伸。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.7 Western Blot法檢測(cè)軟骨細(xì)胞SOX9、MMP13、P-Raf1、Raf1、P-MEK1、MEK1蛋白表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行細(xì)胞裂解提取蛋白，測(cè)定濃度，分裝，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，溫封閉液浸泡1 h，加入上述一抗孵育過夜，洗膜后，再加入二抗溫孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)并X 線膠片曝光顯影，應(yīng)用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異通過單因素方差分析并采用LSD-t法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1軟骨細(xì)胞的免疫熒光染色鑒定倒置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)經(jīng)Ⅱ型膠原免疫熒光染色后發(fā)出鮮亮的紅色熒光（見圖1-a），為強(qiáng)陽(yáng)性表現(xiàn)，證實(shí)為軟骨細(xì)胞，細(xì)胞核未著色，表明Ⅱ型膠原蛋白在細(xì)胞核內(nèi)無表達(dá)。幾乎所有細(xì)胞經(jīng)DAPI 染色后細(xì)胞核均發(fā)出藍(lán)色熒光（見圖1-b）。圖1-c 為圖1-a和圖1-b的疊加，絕大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白，證明提取的軟骨細(xì)胞純度高。

圖1 軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的免疫熒光染色Figure 1 Immunofluorescence staining results for typeⅡcollagen in chondrocytes

圖2 各組軟骨細(xì)胞形態(tài)比較（×100）Figure 2 Comparison of the morphological features of chondrocytes in various groups（×100）

圖3 各組軟骨細(xì)胞MMP3、SOX9、A-CAN、ADAMTS4、ADAMTS5基因表達(dá)比較（±s）Figure 3 Comparison of the expression levels of MMP3，SOX9，A-CAN，ADAMTS4，ADAMTS5 genes in chondrocytes of various groups（±s）

2. 2各組軟骨細(xì)胞形態(tài)比較倒置顯微鏡下可見：正常對(duì)照組軟骨細(xì)胞呈三角形、多角形，形態(tài)飽滿，融合后呈“鋪路石”樣；與正常對(duì)照組比較，IL-1β組及各濃度中藥膝痹通絡(luò)方組軟骨細(xì)胞形態(tài)明顯細(xì)長(zhǎng)、單薄，呈長(zhǎng)梭形改變，呈明顯的退變形態(tài)，但各濃度中藥組軟骨細(xì)胞退變形態(tài)較IL-1β組減輕。見圖2。

2. 3各組軟骨細(xì)胞MMP3、SOX9、A-CAN、ADAMTS4、ADAMTS5基因表達(dá)比較圖3 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，IL-1β 組軟骨細(xì)胞MMP3、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），SOX9、A-CAN mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，各濃度中藥組軟骨細(xì)胞MMP3、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達(dá)水平明顯降低，SOX9、A-CAN mRNA 表達(dá)水平升高，其中，高濃度中藥組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4各組軟骨細(xì)胞MMP13、SOX9、P-Raf1、Raf1、P-MEK1、MEK1 蛋白表達(dá)比較圖4 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，IL-1β 組軟骨細(xì)胞MMP13 蛋白表達(dá)，Raf1、MEK1磷酸化水平明顯升高，SOX9蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。與IL-1β 組比較，各濃度中藥組MMP13蛋白表達(dá)、Raf1、MEK1磷酸化水平明顯降低，SOX9 蛋白表達(dá)水平升高（均P＜0.05）。

圖4 各組軟骨細(xì)胞MMP13、SOX9、P-Raf1、Raf1、P-MEK1、MEK1蛋白表達(dá)比較（±s）Figure 4 Comparison of the expression levels of MMP13,SOX9,P-RAF1,Raf1,P-Mek1,and MEK1 proteins in chondrocytes of various groups（±s）

3 討論

3.1 KOA的中醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，歷代醫(yī)家對(duì)于其論述及治法各有特色。其雖病位在筋骨，但本在于腎。老齡患者肝腎漸虧，髓枯血虛，筋骨失于濡養(yǎng)而不復(fù)堅(jiān)固，損傷或復(fù)感風(fēng)、寒、濕、熱等外邪時(shí)疼痛發(fā)作，久病則筋脈攣縮，無力束骨，可引起關(guān)節(jié)不穩(wěn)及屈伸不利癥狀。而血瘀則是機(jī)體衰退過程中潛在的病理因素，外傷勞損、氣候變化都可致瘀血痹阻，阻礙筋骨關(guān)節(jié)的潤(rùn)養(yǎng)，加重關(guān)節(jié)的退化[3]。膝痹通絡(luò)方是蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科治療KOA 的經(jīng)驗(yàn)方，方中：杜仲、牛膝補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；黃芪補(bǔ)氣健脾；當(dāng)歸、川芎、白芍養(yǎng)血活血；獨(dú)活、雞血藤、秦艽、木瓜祛風(fēng)除痹，舒筋通絡(luò)。全方共奏補(bǔ)益肝腎、活血祛瘀之功。

3.2 KOA的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，KOA患者因?yàn)槟挲g增長(zhǎng)及膝關(guān)節(jié)力線的改變，膝關(guān)節(jié)長(zhǎng)期處于疲勞狀態(tài)，關(guān)節(jié)穩(wěn)定性下降，軟骨和半月板存在物理性磨損。而近些年來，關(guān)節(jié)滑膜的炎癥所扮演的角色越來越得到重視，滑膜炎癥的進(jìn)展程度可以直接反映KOA 的嚴(yán)重程度，也是KOA 發(fā)生、發(fā)展的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素[4-5]。有學(xué)者對(duì)只有癥狀而無影像學(xué)改變的KOA 患者進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡隨防，發(fā)現(xiàn)約50%的患者關(guān)節(jié)鏡下有局限性滑膜炎癥表現(xiàn)，且這些患者在1年之后，都出現(xiàn)了局部軟骨破壞的表現(xiàn)[6]。在關(guān)節(jié)退變的早期即有炎癥的參與，并伴隨軟骨細(xì)胞的退變、細(xì)胞外基質(zhì)的破壞。當(dāng)關(guān)節(jié)滑膜受到刺激，可誘發(fā)滑膜內(nèi)血管增生擴(kuò)張、滑膜細(xì)胞的活躍增生等一系列反應(yīng)，并釋放大量炎癥因子，侵蝕關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨，軟骨在化學(xué)性侵蝕及物理性摩擦的惡性循環(huán)下，進(jìn)行性磨損、變薄甚至缺如，致關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨質(zhì)硬化。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1 是關(guān)鍵性炎性因子之一，也是炎癥發(fā)生的始動(dòng)因素，可直接調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞MMPs的生成，抑制蛋白多糖及Ⅱ型膠原等軟骨基質(zhì)的合成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的退變及凋亡，直接導(dǎo)致軟骨的化學(xué)性損傷，加速骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[7]。IL-1 又分IL-1α 和IL-1β 2 種亞型，其中IL-1β 是主要亞型，隨著KOA 的病情發(fā)展，關(guān)節(jié)內(nèi)IL-1β可呈持續(xù)性增高，基于此，本研究采用IL-1β作為軟骨細(xì)胞退變的誘導(dǎo)因子，模擬KOA 患者體內(nèi)軟骨退變模型。

MMPs是一個(gè)龐大的蛋白酶超家族，其家族成員能降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)，在膝關(guān)節(jié)，MMPs 可因IL-1 等炎癥因子刺激后，由軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，MMPs的過度表達(dá)，可加速軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨進(jìn)行性破壞。在MMPs家族中，以MMP3和MMP13在KOA 的參與度最為突出。膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中最為主要的成分是Ⅱ型膠原，其次為蛋白多糖，MMP13 是所有MMPs 家族中降解Ⅱ型膠原蛋白能力最強(qiáng)的，而MMP3 對(duì)于A-CAN 又有較高的裂解活性，隨著細(xì)胞外基質(zhì)的降解，軟骨的生物學(xué)特點(diǎn)發(fā)生改變，抗應(yīng)力能力也大大下降，加速退變，因此，MMP3 和MMP13 是反映KOA 軟骨退變程度的重要標(biāo)志物[8]。與MMPs 等經(jīng)典蛋白酶相比，聚蛋白多糖酶家族（ADAMTSs）對(duì)KOA 的影響在近些年才逐漸受到重視，其中ADAMTS4 和ADAMTS5 是軟骨細(xì)胞外A-CAN 的主要降解酶。研究發(fā)現(xiàn)，敲除ADAMTS4和ADAMTS5基因的小鼠在誘導(dǎo)KOA 過程中，與正常小鼠相比，僅出現(xiàn)了輕度膝關(guān)節(jié)退變，特別是敲除ADAMTS5 基因后，小鼠軟骨缺損程度明顯輕于敲除ADAMTS4 基因及正常的小鼠[9-10]。SOX9 對(duì)軟骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用，被稱為軟骨的“主調(diào)節(jié)因子”。SOX9 可同時(shí)調(diào)控Ⅱ型膠原及A-CAN 的表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的生成與修復(fù)，又可抑制ADAMTS4 和ADAMTS5 等聚蛋白酶以及MMPs 在KOA 早期的表達(dá)，可以說是KOA軟骨的保護(hù)器[11-12]。

3.3 MAPK-MEK信號(hào)通路在KOA中的作用IL-1等關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥因子還能誘發(fā)軟骨細(xì)胞中的一系列酶促反應(yīng)，進(jìn)一步加速軟骨細(xì)胞的退變，其中MAPKs 信號(hào)通路是參與骨關(guān)節(jié)炎中軟骨破壞最重要的通路之一[13]。MAPK-MEK 通路是MAPKs 家族中的經(jīng)典通路，主要由Raf、MEK、ERK三級(jí)酶聯(lián)功能單位構(gòu)成，當(dāng)其依次被磷酸化激活后，可誘發(fā)下游更為廣泛的蛋白表達(dá)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生理應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。在膝關(guān)節(jié)中，上游的Ras活化可進(jìn)一步激活Raf 蛋白，Raf 磷酸化后激活MEK1/MEK2，進(jìn)而活化ERK1和ERK2，最后下游的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入軟骨細(xì)胞核內(nèi)參與細(xì)胞的增殖、分化、鈣化等一系列生理病理過程，大大改變軟骨細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境[14]。當(dāng)IL-1、TNF-α等炎癥因子與軟骨細(xì)胞膜上的受體結(jié)合或機(jī)械應(yīng)力刺激后，軟骨細(xì)胞內(nèi)的MAPKs 信號(hào)通路被激活，引起MMPs大量表達(dá)，導(dǎo)致軟骨被快速破壞，此外，該信號(hào)通路還廣泛參與軟骨細(xì)胞的凋亡、肥大、鈣化等病理過程[15]。針對(duì)MAPK-MEK 信號(hào)通路的一些治療，在臨床和實(shí)驗(yàn)中也被證實(shí)是有效的。Prasadam等[16]給KOA 大鼠關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸及UO126（MAPK-MEK 通路抑制劑），結(jié)果發(fā)現(xiàn)UO126 可明顯抑制軟骨細(xì)胞肥大相關(guān)蛋白（COL10 和RUNX2）及退變相關(guān)蛋白（ADAMTs5和MMP13）的表達(dá)，延緩軟骨細(xì)胞的退化，治療效果優(yōu)于未治療組及單用透明質(zhì)酸組。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，電針、手法松解等中醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)也可通過調(diào)節(jié)該通路，達(dá)到改善關(guān)節(jié)疼痛癥狀，延緩關(guān)節(jié)退化，以及減輕關(guān)節(jié)炎癥的目的[17-18]。

3.4膝痹通絡(luò)方治療KOA的機(jī)制探討膝痹通絡(luò)方為我院經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效肯定。本研究從細(xì)胞分子生物學(xué)角度，對(duì)其治療機(jī)制進(jìn)行了探索。本研究在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中加入IL-1β，模擬軟骨細(xì)胞退變，顯微鏡下直觀可見細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生改變，與正常組相比呈扁平、狹長(zhǎng)的退化形態(tài)。進(jìn)一步以qPCR 和Western Blot 法檢測(cè)相關(guān)基因及蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)MMPs、ADAMTs 等促軟骨細(xì)胞退變的蛋白酶水平明顯上升，而抑軟骨細(xì)胞退變的轉(zhuǎn)錄因子SOX9 及A-CAN 表達(dá)水平明顯下降，與既往研究[7]結(jié)果相符。而加入不同濃度膝痹通絡(luò)方含藥血清組的軟骨細(xì)胞雖也呈現(xiàn)退化狀態(tài)，但整體狀態(tài)優(yōu)于IL-1β組。表明膝痹通絡(luò)方可一定程度抑制IL-1β 所致的軟骨細(xì)胞MMPs、ADAMTs 的過表達(dá)，亦可緩解IL-1β對(duì)SOX9、A-CAN 的抑制作用。

基于MAPK-MEK信號(hào)通路在KOA發(fā)病過程中的重要作用，本研究進(jìn)一步觀察膝痹通絡(luò)方含藥血清對(duì)該信號(hào)通路的影響。MAPK-MEK 信號(hào)通路的活性主要取決于通路中相關(guān)磷酸化蛋白的水平，而非總蛋白含量。本研究中，軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后Raf1、MEK 磷酸化水平顯著增高，證實(shí)了IL-1β 可上調(diào)MAPK-MEK 信號(hào)通路的活性，而各濃度中藥組軟骨細(xì)胞Raf1 和MEK 磷酸化水平較IL-1β組明顯下降，提示膝痹通絡(luò)方含藥血清可抑制IL-1β 所誘導(dǎo)的MAPK-MEK 信號(hào)通路的過度活躍。

綜上所述，膝痹通絡(luò)方含藥血清可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的退變，保護(hù)軟骨細(xì)胞，其具體機(jī)制可能是抑制了IL-1β 所致的MAPK-MEK 信號(hào)通路的過度活躍。但本實(shí)驗(yàn)僅為體外實(shí)驗(yàn)，軟骨細(xì)胞在體內(nèi)和體外的生物學(xué)活性可能存在一定差異，因此需進(jìn)一步通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本方的有效性和安全性，這也是本課題組下一步的研究計(jì)劃。