步營，王飛，胡顯杰,2，朱文慧*，李學(xué)鵬，畢蕾，王玉亭

(1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；3.撫順獨鳳軒骨神生物技術(shù)股份有限公司，遼寧 撫順 113122；4.榮成協(xié)匯食品股份有限公司，山東 榮成 246309)

我國是世界上最大的貝類養(yǎng)殖國，貝類養(yǎng)殖已經(jīng)成為沿海海水養(yǎng)殖業(yè)的支柱之一。據(jù)統(tǒng)計，2018年我國海水養(yǎng)殖貝類總產(chǎn)量達(dá)1463.51萬噸，占貝類總產(chǎn)量的91.93%，其中，蛤類占海水養(yǎng)殖貝類總產(chǎn)量的27.88%[1]。藍(lán)蛤(Aloididaealoidi)是盛產(chǎn)于我國沿海的一種低值海洋貝類。藍(lán)蛤肉肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，且粗蛋白含量相比其他貝類較高，因此成為酶法制備呈味肽的優(yōu)質(zhì)原料[2]。水產(chǎn)蛋白質(zhì)在酶水解后經(jīng)常會產(chǎn)生苦味，使用傳統(tǒng)的化學(xué)和熱處理脫腥脫苦方法會嚴(yán)重破壞水產(chǎn)品品質(zhì)和營養(yǎng)價值[3]，這使得酶法水解在水產(chǎn)工業(yè)上的應(yīng)用受到了較大的限制。

超高壓(ultra-high pressure，UHP)在水產(chǎn)品加工行業(yè)逐漸受到關(guān)注，Kaur等[4]在室溫(25±2) ℃條件下，研究了不同壓力處理后黑虎蝦的品質(zhì)及貨架期變化；邵懿等研究發(fā)現(xiàn)，100 MPa高壓有利于鳀魚內(nèi)源酶對鳀魚蛋白的水解，外加風(fēng)味蛋白酶對高壓輔助水解效果有加強作用。Maria等[5]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理能夠增加球蛋白的水解度，在400 MPa下處理25 min達(dá)到最大水解度。然而，針對超高壓同時處理底物和酶的酶解工藝相關(guān)的系統(tǒng)研究，在水產(chǎn)方面鮮見報道。

鑒于此，本研究以藍(lán)蛤為研究對象，利用超高壓對其進行高壓酶解處理，旨在完善和豐富超高壓在水產(chǎn)應(yīng)用方面的基礎(chǔ)理論，為超高壓酶解的加工利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)蛤(鮮活)：購于錦州市林西水產(chǎn)市場；風(fēng)味蛋白酶(500 mg)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(11039)：食品級，北京市諾維信投資有限公司；0.05 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L2-600/0.6超高壓設(shè)備 天津華泰森淼公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；Biofuge Stratos臺式冷凍高速離心機 美國Thermo Fisher公司；Kjeltec 8400全自動定氮儀 瑞典Foss公司；SA-402B電子舌 日本Insent公司；PEN3電子鼻 德國Airsense 公司。

1.3 酶解液的制備

將鮮活的藍(lán)蛤靜置于4%的人工海水(海水晶配制)中吐沙，每隔2 h換1次水溶液，至吐沙完成，撈起，瀝干，冷凍。在0 ℃下去殼取肉，打碎，以料水比1∶1，選取復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，加壓或不加壓處理，在酶解溫度50 ℃、酶解pH 7.0、酶解時間4 h的條件下，對酶添加量之比(兩種酶添加總量為0.4%)、壓力、給壓時間這3個因素進行單因素試驗及正交優(yōu)化，測定酶解液氨基酸態(tài)氮和水解度值。

1.4 超高壓輔助酶解條件的確定

1.4.1 單因素試驗

在一定條件下，酶解完成后，樣品置于100 ℃沸水中滅酶10 min，離心(8000×g，20 min)，取上清液備用。

1.4.1.1 酶添加量之比的確定

酶添加量之比(復(fù)合蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶)為0∶4、1∶3、1∶1、3∶1、4∶0，壓力為150 MPa，給壓時間為60 min。

1.4.1.2 壓力的確定

酶添加量之比(復(fù)合蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶)為3∶1，壓力為100，150，200，250，300 MPa，給壓時間為60 min。

1.4.1.3 給壓時間的確定

酶添加量之比(復(fù)合蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶)為3∶1，壓力為250 MPa，給壓時間為30，40，50，60，70 min。

1.4.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以酶添加量之比、壓力、給壓時間為影響因素進行L9(33)正交試驗[6]，通過測定氨基酸態(tài)氮含量和水解度，選擇最優(yōu)水平組合，因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.5 試驗方法

1.5.1 氨基酸態(tài)氮的測定

采用甲醛滴定法，參考王琳等[7]的方法進行氨基酸態(tài)氮的測定。

1.5.2 水解度的測定

DH(%)=水解液中氨基酸態(tài)氮含量/原料中總氮含量。

(1)

式中：原料中總氮含量采用凱式定氮法測定[8]。

1.5.3 感官評價

由10名經(jīng)過培訓(xùn)小組成員(5名男性，5名女性；年齡在23～25歲)對不同壓力、不同給壓時間的酶解液進行品評。首先，對他們在滋味、氣味、色澤3個方面進行培訓(xùn)；其次，在25 ℃下，小組成員單獨接受隨機3位數(shù)的樣本和蒸餾水，以便在樣品之間漱口。一組測試結(jié)束后，小組成員休息5 min，然后對另外5個樣本再次進行感官品評[9-10]，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評價權(quán)重表Table 2 The sensory evaluation weight table

1.5.4 電子舌的測定

參照鄭舒文等[11]的方法改進得：將藍(lán)蛤酶解液按體積比稀釋10倍，過濾(0.45，0.22 μm的濾膜)，取80 mL樣液置于電子舌測試杯中，對其苦、鮮、苦和鮮味的回味進行測定，以基準(zhǔn)液做空白對照。

1.5.5 電子鼻分析

電子鼻是模擬人體嗅覺，利用傳感器對10類揮發(fā)性化合物進行鑒定識別的新型無損檢測技術(shù)。傳感器由10種金屬氧化物半導(dǎo)體型化學(xué)傳感元件組成[12]，每種傳感元件對應(yīng)的主要敏感物質(zhì)見表3。

表3 化學(xué)傳感器及其對應(yīng)的敏感物質(zhì)類型Table 3 The chemical sensors and their corresponding sensitive substances' types

樣品處理：用50 mL的燒杯，稱量5 g左右的待測樣品，用保鮮膜封口，在室溫下平衡30 min。在25 ℃環(huán)境中運用電子鼻傳感器對樣品進行檢測。檢測時間120 s，進樣流量和內(nèi)部流量均為600 L/min，數(shù)據(jù)采集時間為85 s和90 s[13]。

1.5.6 數(shù)據(jù)分析

每個處理進行3次重復(fù)，采用軟件SPSS 19.0進行ANOVA分析和正交試驗數(shù)據(jù)分析，并以P<0.05表示差異顯著，采用Origin 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓酶解工藝的確定

2.1.1 酶添加量之比對酶解程度的影響

在壓力150 MPa、給壓時間60 min的條件下，研究了不同酶添加量之比(復(fù)合蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶)對藍(lán)蛤酶解液氨基酸態(tài)氮和水解度的影響，見圖1。

圖1 不同酶添加量之比對藍(lán)蛤酶解液氨基酸態(tài)氮和水解度的影響Fig.1 The effect of different ratios of enzyme additive amount on amino acid nitrogen and hydrolysis degree of Aloididae aloidi hydrolysate

由圖1可知，氨基酸態(tài)氮和水解度在不同酶添加量之和作用下呈上升趨勢，且差異顯著(P<0.05)。結(jié)合酶解液風(fēng)味考慮，單酶(復(fù)合蛋白酶)酶解的酶解液味苦，腥味重，不能很好地改善酶解液的風(fēng)味，故選取復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶為3∶1的比例用于下一步試驗，并將(復(fù)合蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶)1∶1、3∶1、4∶0作為正交試驗分析條件以確定最佳添加量。

2.1.2 壓力對酶解程度的影響

在酶添加量(復(fù)合蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶)之比3∶1、給壓時間60 min的條件下，研究了不同壓力對藍(lán)蛤酶解液氨基酸態(tài)氮和水解度的影響，見圖2。

圖2 不同壓力對藍(lán)蛤酶解液氨基酸態(tài)氮和水解度的影響Fig.2 The effect of different pressures on amino acidnitrogen and hydrolysis degree ofAloididae aloidi hydrolysate

由圖2可知，氨基酸態(tài)氮和水解度在不同壓力作用下呈先上升后下降的趨勢，在250 MPa時出現(xiàn)最大值，且差異顯著(P<0.05)。在100～250 MPa時，氨基酸態(tài)氮和水解度緩慢上升，在壓力>250 MPa時，氨基酸態(tài)氮和水解度直線下降，且氨基酸態(tài)氮和水解度低于常壓酶解值。有可能是在一定壓力下，酶三、四級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，改變了酶切位點，提高了酶活性，使水解能力增強；當(dāng)壓力超過臨界點時，酶結(jié)構(gòu)被破壞，酶失活或變性，使水解能力降低[14]。故選取250 MPa用于下一步試驗，并將150，200，250 MPa作為正交試驗分析條件以確定最佳壓力。

2.1.3 給壓時間對酶解程度的影響

在酶添加量之比(復(fù)合蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶)3∶1、壓力150 MPa的條件下，研究了不同給壓時間對藍(lán)蛤酶解液氨基酸態(tài)氮和水解度的影響，見圖3。

圖3 不同給壓時間對藍(lán)蛤酶解液氨基酸態(tài)氮和水解度的影響Fig.3 The effect of different time on amino acid nitrogen and hydrolysis degree of Aloididae aloidi hydrolysate

由圖3可知，氨基酸態(tài)氮和水解度在不同給壓時間作用下有相同趨勢，在50 min時出現(xiàn)最高值，且差異顯著(P<0.05)。說明在相同壓力下，隨著給壓時間的延長，壓力對酶作用越強，當(dāng)給壓時間超過50 min時，壓力對酶有抑制現(xiàn)象。故選取50 min作為下一步酶解的最適條件。

2.1.4 超高壓酶解工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗結(jié)果及條件驗證

2.1.4.1 超高壓酶解工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗結(jié)果

超高壓酶解工藝參數(shù)優(yōu)化的正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表4 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 The orthogonal array design and results

續(xù) 表

由直觀分析可知，影響因素的順序為酶添加量之比>給壓時間>壓力，最優(yōu)組合是A1C3B3。超高壓酶解最優(yōu)工藝條件為：酶添加量之比1∶1，壓力250 MPa，給壓時間60 min。正交試驗的方差分析結(jié)果見表5。

表5 正交試驗方差分析Table 5 The variance analysis of orthogonal test

由表5可知，壓力和給壓時間對超高壓酶解基本沒影響，酶添加量之比對超高壓酶解沒有顯著影響。

2.1.4.2 正交試驗結(jié)果驗證

因最優(yōu)組在正交表中沒有體現(xiàn)，故對正交試驗結(jié)果進行驗證。稱取一定量的藍(lán)蛤肉溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.0，按其重量的0.2%分別添加1∶1的風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，在壓力250 MPa下給壓60 min后置于50 ℃水浴鍋中酶解4 h，在100 ℃滅酶10 min，離心(8000×g，20 min)，取上清液備用。測得氨基酸態(tài)氮含量為0.39 g/dL，水解度為45.09%，高于正交試驗中所有組分測得的氨基酸態(tài)氮值和水解度值，說明試驗具有可靠性。故以常壓酶解做對照組，以超高壓處理做試驗組，進行酶解液風(fēng)味和藍(lán)蛤蛋白結(jié)構(gòu)變化的研究。

2.2 超高壓酶解對酶解液風(fēng)味的影響

2.2.1 感官評價分析

感官評價是人通過自身感覺對產(chǎn)品進行直觀描述，量化地反映產(chǎn)品特性。超高壓處理組和常壓處理組的感官總評分及滋味、氣味、色澤分值見表6。

表6 感官評價結(jié)果Table 6 The sensory evaluation results

由表6可知，經(jīng)過超高壓處理酶解液的滋味、氣味、色澤和總評分均高于常壓處理組酶解液的感官評分；其中色澤相對差異最小，滋味差異最大，說明超高壓酶解對改善風(fēng)味效果顯著。

2.2.2 電子鼻分析

根據(jù)樣品頂空揮發(fā)物的數(shù)據(jù)處理和模式識別[15]，結(jié)果表示為主成分分析(PCA)和LDA。

PCA是將數(shù)據(jù)降維并進行線性分類，得到主要的二維散點圖[16]。常壓和UP250處理酶解液PCA分析結(jié)果圖見圖4。

圖4 不同處理藍(lán)蛤酶解液PCA分析結(jié)果Fig.4 PCA analysis results of Aloididae aloidi enzymatic hydrolysate by different treatments

圖4中每個橢圓代表常壓組和UP250處理組樣液的數(shù)據(jù)采集點。經(jīng)分析可知，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為97.91%和1.16%，大于85%，表明PCA結(jié)果分析能代表樣品主要的信息特征。經(jīng)過超高壓處理，酶解液PC1和PC2都發(fā)生了變化。和常壓處理組相比，UP250組PC1變化較大，PC2幾乎無變化。說明PCA方法在數(shù)據(jù)分析中合適，電子鼻可以準(zhǔn)確地區(qū)分兩種酶解液。

LDA是一種常規(guī)的模式識別和樣品分類方法。LDA主要是利用投影的原理將數(shù)據(jù)降維，會使組間數(shù)據(jù)分開，而組內(nèi)數(shù)據(jù)聚集。LDA方法注重的是揮發(fā)性成分的響應(yīng)值在空間的分布狀態(tài)以及彼此之間的距離分析[17]。采用電子鼻分別檢測常壓與UP250處理的酶解液LDA結(jié)果，見圖5。

圖5 不同處理藍(lán)蛤酶解液LDA分析結(jié)果Fig.5 LDA analysis results of Aloididae aloidi enzymatic hydrolysate by different treatments

由圖5可知，線性判別函數(shù)LD1和LD2的貢獻(xiàn)率分別為98.60%和0.18%，區(qū)分度沒有PCA的大，但是LDA圖可在一定程度上表現(xiàn)出兩種酶解液之間氣味差異的遠(yuǎn)近程度。UP250向上出現(xiàn)微小偏移，說明UP250酶解液中芳香成分差異較小，氣味較為接近。

2.2.3 電子舌結(jié)果分析

電子舌通過模擬人的味覺識別系統(tǒng)，可以在量化感官數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上評價體系的一致性。因而結(jié)合感官與電子舌的分析方法，更能真實地反映藍(lán)蛤酶解液的滋味輪廓。超高壓處理組與常壓處理組的藍(lán)蛤酶解液苦味、鮮味和其回味值見表7。

表7 苦味、鮮味及其回味結(jié)果Table 7 The results of bitterness, umami and aftertaste

由表7可知，經(jīng)過超高壓處理后，酶解液的苦味及其回味降低，鮮味及其回味增大，結(jié)果與感官評價結(jié)果一致，進一步證明超高壓對改善水產(chǎn)品酶解液的風(fēng)味有顯著效果。

3 結(jié)論

通過正交試驗確定了超高壓酶解最佳工藝：酶添加量之比(復(fù)合蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶)3∶1、壓力250 MPa、給壓時間60 min。利用感官評價、電子舌分析得出在壓力250 MPa，時間60 min條件時其滋味比常壓處理的酶解液好；電子鼻分析可以很好地區(qū)分兩種酶解液[18]。超高壓酶解可以改善酶解液的滋味，提高鮮味，降低苦腥味。超高壓輔助酶解是制備優(yōu)質(zhì)海鮮調(diào)味基料的一種新型技術(shù)。