紀(jì)雅飛，熊琦

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006)

納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)，屬于枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種，是一種可食用益生菌，對(duì)人體無(wú)病原性[1]。由該菌分泌的糖化酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能將碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等大分子物質(zhì)分解成低聚糖、小肽、氨基酸、有機(jī)酸等易被人體吸收的成分，從而提高營(yíng)養(yǎng)的利用率[2-3]。該菌能夠在酸性胃環(huán)境中保持高度的穩(wěn)定性[4]，且它的代謝產(chǎn)物具有溶栓[5-6]、抗腫瘤、降低血壓、抗氧化[7]、維持腸道微生態(tài)環(huán)境平衡的功能[8]。其發(fā)酵食品納豆現(xiàn)也成為心血管疾病高發(fā)區(qū)人群的首選健康食品[9]。

硒被認(rèn)為是地殼中常見的微量元素，在人體維持正常的生理代謝和健康水平中起到重要作用。但土壤中的硒缺乏是一個(gè)世界性的問題[10]，適當(dāng)補(bǔ)硒可促進(jìn)腸胃吸收功能，調(diào)節(jié)免疫功能，降低血液中有毒物質(zhì)含量如重金屬銅、鎘、鉛化合物等[11]。在各種形式的硒化合物中，有機(jī)硒比無(wú)機(jī)硒的毒性低且生物利用率高[12-13]，但人工合成有機(jī)硒難度較大，成本較高，因此采用生物法制備有機(jī)硒成為研究熱點(diǎn)。

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化納豆芽孢桿菌富硒的發(fā)酵條件，對(duì)樣品進(jìn)行透析及消化處理，并采用流動(dòng)注射氫化物-火焰原子吸收光譜法測(cè)定有機(jī)硒含量[14]，確定最佳有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率。納豆芽孢桿菌為可食用益生菌，其對(duì)無(wú)機(jī)硒進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得的有機(jī)硒可省去提取步驟，且該菌的轉(zhuǎn)化速率較快，降低了制備成本，在為富硒食品提供高效、低成本的生物硒源研究中具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌：山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院光合細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室；水中硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(5%硝酸)：北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；硝酸：天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；高氯酸：天津政成化學(xué)制品有限公司；硼氫化鉀、亞硒酸鈉、亞甲基藍(lán)：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；L-半胱氨酸：北京奧博拓達(dá)科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；恒溫?fù)u床、立式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AR1140電子分析天平 美國(guó)Ohaus公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海科析實(shí)驗(yàn)儀器廠；85-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；LH-2A型氫化物發(fā)生器 北京有色金屬研究總院；A6300火焰原子吸收分光光度計(jì) 日本島津(香港)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：2%葡萄糖、1.5%蛋白胨、0.5%氯化鈉、0.05%牛肉膏，pH值7.0～7.2，在115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng)

將4 ℃條件下保存的納豆芽孢桿菌以5%的接種量接入培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，活化3次備用。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將活化好的納豆芽孢桿菌以5%的接種量接入60 mL培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)，每2 h取樣一次測(cè)定OD600 nm值。

1.3.3 樣品處理及測(cè)定

1.3.3.1 透析樣品

使用分子量14000的透析袋于超純水中透析樣品，滴加質(zhì)量濃度為150 g/L的半胱氨酸溶液2～3滴，期間不斷更換超純水，加入適量亞甲基藍(lán)溶液，若亞甲基藍(lán)保持1 min以上不褪色，則無(wú)機(jī)硒已被全部析出。

1.3.3.2 消化樣品

取1 mL透析后的樣品加入燒杯中，添加10 mL混酸(硝酸∶高氯酸為4∶1)，放入2～3個(gè)玻璃珠冷消化過夜。次日置于電熱板加熱趕酸，待樣品剩余1 mL時(shí)冷卻并加入8 mL超純水，重復(fù)操作直至無(wú)可見白眼冒出，添加1∶1鹽酸8 mL沸水浴10 min，用10%鹽酸定容至25 mL容量瓶中待測(cè)。

1.3.3.3 標(biāo)曲的制作

取0.5 mL硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用超純水定容獲得硒中間液，取5 mL硒中間液于100 mL容量瓶中，用超純水定容獲得硒標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取0，0.5，1，2，3，4，5 mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶中，加2.5 mL濃鹽酸，用超純水定容獲得質(zhì)量濃度梯度為0，5，10，20，30，40，50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定硒含量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.0047305X-0.00090495，R2=0.9995。

1.3.3.4 有機(jī)硒的測(cè)定

配制硼氫化鉀與氫氧化鈉混合溶液：將2 g硼氫化鉀、0.2 g氫氧化鈉置于100 mL容量瓶中定容，以氮?dú)鉃檩d氣，10%鹽酸為載流液，測(cè)定波長(zhǎng)196 nm，乙炔點(diǎn)火測(cè)定標(biāo)曲及樣品硒含量。代入公式(1)計(jì)算有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率：

公式(1)

式中：N為稀釋倍數(shù)；ρ1為所測(cè)有機(jī)硒質(zhì)量濃度，μg/L；ρ2為添加亞硒酸鈉質(zhì)量濃度，μg/mL；M1為亞硒酸鈉相對(duì)分子質(zhì)量；M2為硒相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

將納豆芽孢桿菌作為實(shí)驗(yàn)用菌，以亞硒酸鈉為無(wú)機(jī)硒源，以有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為最終考核指標(biāo),亞硒酸鈉與菌株同時(shí)添加，亞硒酸鈉添加量60 μg/mL、培養(yǎng)基初始pH值7、培養(yǎng)時(shí)間48 h、接種量5%為初始條件，在其他因素不變的條件下，分別考察單因素:亞硒酸鈉添加時(shí)間(亞硒酸鈉與菌株同時(shí)添加，培養(yǎng)8，16 h)、亞硒酸鈉添加量(10，30，60，90，120 μg/mL)、培養(yǎng)基初始pH值(5，6，7，8，9)、培養(yǎng)時(shí)間(3，6，12，24，48 h)及接種量(1%、3%、5%、7%、9%)對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

通過分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確定各因素對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響規(guī)律，確定接入菌體同時(shí)添加亞硒酸鈉，亞硒酸鈉添加量10 μg/mL為最佳條件，選取培養(yǎng)基初始pH值、接種量及培養(yǎng)時(shí)間作為因變量，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 納豆芽孢桿菌富硒培養(yǎng)參數(shù)的響應(yīng)面因素與水平Table 1 The response surface factors and levels of selenium-rich culture parameters of Bacillus natto

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、方差分析及回歸分析；采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)方差分析；采用Origin 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，該菌株接種后幾乎沒有出現(xiàn)延滯期，因?yàn)樾碌呐囵B(yǎng)環(huán)境與原有環(huán)境基本一致，納豆芽孢桿菌很快適應(yīng)了新環(huán)境并呈指數(shù)增長(zhǎng)。菌體生長(zhǎng)0～14 h納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)力旺盛，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。培養(yǎng)12 h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。菌體生長(zhǎng)18 h后進(jìn)入衰亡期。本實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)0(即亞硒酸鈉與菌株同時(shí)接入培養(yǎng)基)，8，16 h時(shí)加入亞硒酸鈉。

圖1 納豆芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Bacillus natto growth curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 亞硒酸鈉添加時(shí)間對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響

圖2 亞硒酸鈉添加時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of sodium selenite adding time on the conversion rate

由圖2可知，納豆芽孢桿菌與亞硒酸鈉同時(shí)加入培養(yǎng)基時(shí)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率最高，這與孫博等[15]的研究結(jié)果相同，亞硒酸鈉能夠抑制菌體生長(zhǎng)，不宜過早添加，所以在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期添加亞硒酸鈉，此時(shí)菌體生長(zhǎng)代謝旺盛，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率最高，考慮到該菌能夠快速適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境，即選取亞硒酸鈉與菌體同時(shí)接入培養(yǎng)基為最適亞硒酸鈉添加時(shí)間。

2.2.2 亞硒酸鈉添加量對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響

圖3 亞硒酸鈉添加量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of the additive amount of sodium selenite on the conversion rate

由圖3可知，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率隨著亞硒酸鈉添加量的升高而降低，細(xì)菌將亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的過程是其在受到亞硒酸鈉的毒性作用脅迫后的一種自我保護(hù)行為，亞硒酸鈉濃度越高，對(duì)納豆芽孢桿的毒性作用越大，菌體生長(zhǎng)受到抑制[16]，所以該菌在高濃度亞硒酸鈉環(huán)境中有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率較低，因此選擇10 μg/mL為最適亞硒酸鈉添加量。

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響

圖4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of initial pH value of culture medium on the conversion rate

由圖4可知，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率隨著培養(yǎng)基初始pH值的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，pH值為7時(shí)轉(zhuǎn)化率最佳。pH對(duì)菌體膜滲透性、細(xì)胞膜電荷及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)離子化程度具有影響作用，從而對(duì)其營(yíng)養(yǎng)的吸收及生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[17-18]，過酸過堿都不利于納豆芽孢桿菌吸收營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)，使有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率降低，因此選擇pH值為7作為最適培養(yǎng)基初始pH值。

2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of culture time on the conversion rate

由圖5可知，培養(yǎng)3～6 h有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率顯著升高，結(jié)合生長(zhǎng)曲線，此時(shí)菌體進(jìn)入新環(huán)境，生長(zhǎng)旺盛，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率升高較明顯。培養(yǎng)6～12 h轉(zhuǎn)化率雖有提升但不顯著，此時(shí)菌體的生長(zhǎng)狀況較前6 h有下降趨勢(shì)，加之亞硒酸鈉對(duì)菌體生長(zhǎng)具有抑制作用，所以有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率升高不明顯。培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定，菌體生長(zhǎng)12 h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，所以有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率逐漸趨于平穩(wěn)，這與靳志強(qiáng)等[19]的研究結(jié)果相似。所以選擇6 h為最適培養(yǎng)時(shí)間。

2.2.5 接種量對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響

圖6 接種量對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on the conversion rate

由圖6可知，接種量為3%時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，隨著接種量的增大或減小，轉(zhuǎn)化率有所降低，接種量為9%時(shí)轉(zhuǎn)化率有升高的趨勢(shì)但并不顯著。因?yàn)榻臃N量對(duì)菌種的生長(zhǎng)有一定的影響，接種量過小時(shí)，導(dǎo)致菌體細(xì)胞內(nèi)的某些維生素和輔基發(fā)生擴(kuò)散，不利于菌種生長(zhǎng)；接種量過大時(shí)，加快了菌體對(duì)培養(yǎng)基的消耗，也不利于菌種的生長(zhǎng)[20]。所以選擇3%為最適接種量。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及回歸分析

以取得有機(jī)硒最高轉(zhuǎn)化率為目的，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇培養(yǎng)基初始pH值(A)、接種量(B)、培養(yǎng)時(shí)間(C)作為因變量，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率(Y)作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)化率Table 2 RSM design and conversion rate

表3 有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率回歸模型及顯著性分析Table 3 Organic selenium conversion rate regression model and significance analysis

續(xù) 表

由表3可得回歸方程為：Y=88.43+6.90A+7.00B+6.01C+6.65AB+0.54AC+4.59BC-9.88A2-23.96B2-6.03C2。

此模型F=17.59，P<0.01，差異極顯著，表明本次模型建立有意義；R2=0.9577，表明回歸方程擬合度良好，實(shí)驗(yàn)方法可靠，能夠?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)；失擬項(xiàng)F=4.06，P>0.05，無(wú)顯著性差異，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果中非正常誤差較小，可由此模型得到有機(jī)硒最佳轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)因素培養(yǎng)基初始pH值(A)、接種量(B)、培養(yǎng)時(shí)間(C)對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的主次影響順序：B>A>C。一次項(xiàng)A、B和二次項(xiàng)A2、B2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，一次項(xiàng)C和交互項(xiàng)AB對(duì)響應(yīng)值影響顯著，其余項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響不顯著。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)因素交互作用分析

各因素交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖見圖7～圖9，均采用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行繪制。

圖7 培養(yǎng)基初始pH值與接種量對(duì)轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.7 Response surface plot and contour of the effect of initial pH and inoculation amount on conversion rate

圖8 培養(yǎng)基初始pH值與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.8 Response surface plot and contour of the effect of initial pH and culture time on conversion rate

圖9 接種量與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.9 Response surface plot and contour of inoculation amount and culture time on conversion rate

響應(yīng)面法是通過分析自變量之間的相互作用以及自變量對(duì)響應(yīng)值影響優(yōu)化工藝的方法，是一種用于食品加工中高產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量驗(yàn)收的技術(shù)[21]。本研究通過Design Expert 8.0.5軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得結(jié)果進(jìn)行分析并繪制各實(shí)驗(yàn)因素間交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖，等高線的橢圓程度表示兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，橢圓程度越大表示影響越顯著[22]。響應(yīng)面的坡度表示實(shí)驗(yàn)因素對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響大小，坡度越大表示影響越大。

由圖7可知，接種量1%～5%、培養(yǎng)基初始pH值在6～8范圍內(nèi)，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率先升高后降低。接種量3%、pH 7.0附近值對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響較重要。接種量響應(yīng)面坡度較大，表明接種量對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率影響較大。等高線橢圓程度大，表明培養(yǎng)基初始pH值與接種量的交互作用明顯。由圖8可知，響應(yīng)面整體坡度小，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)不顯著的升高趨勢(shì)，培養(yǎng)基初始pH值在6～8范圍內(nèi)，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率先升高后降低。等高線橢圓程度小，表明培養(yǎng)基初始pH值與培養(yǎng)時(shí)間的交互作用不明顯，結(jié)果與顯著性分析一致。由圖9可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率有不顯著的升高趨勢(shì)；隨著接種量的增大，有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)且響應(yīng)面坡度較大，結(jié)合圖7中結(jié)果表明接種量是影響納豆芽孢桿菌有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的重要條件。

2.3.3 最優(yōu)轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)條件的確定及驗(yàn)證

通過Design Expert 8.0.5軟件分析獲得最優(yōu)發(fā)酵條件為：培養(yǎng)基初始pH值7.46，接種量3.54%，培養(yǎng)時(shí)間10.30 h，轉(zhuǎn)化率理論值為92.8194%。考慮到實(shí)際操作的難易程度，將培養(yǎng)基初始pH值改為7.5，接種量改為3.5%，培養(yǎng)時(shí)間改為10 h。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為91.21%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異，表明通過響應(yīng)面法優(yōu)化所得的納豆芽孢桿菌富硒培養(yǎng)參數(shù)具備可靠性和可操作性。

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化了納豆芽孢桿菌富硒的發(fā)酵條件，最終確定的優(yōu)化條件為：接入菌體時(shí)添加亞硒酸鈉，接種量為3.5%，亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為10 μg/mL，培養(yǎng)基初始pH值為7.5，培養(yǎng)時(shí)間為10 h。通過以上條件所得有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為91.21%。此次研究在為富硒食品提供高效、低成本的生物硒源研究中具有一定的參考價(jià)值，且納豆芽孢桿菌對(duì)無(wú)機(jī)硒進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得的有機(jī)硒可省去提取步驟，轉(zhuǎn)化速率較快，降低了制備成本，具有良好的應(yīng)用前景。