羅本華,龐宇舟,張玲,吳椋冰,何疆,李文康,李玉秋

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 針灸推拿學(xué)院， 廣西 南寧 530001)

0 引言

5羥色胺1A受體(serotonin 1A receptor，5-HT1A)和5羥色胺2A受體(serotonin 2A receptor，5-HT2A)是與睡眠和覺(jué)醒密切相關(guān)的經(jīng)典中樞5羥色胺(serotonin，5-HT)神經(jīng)遞質(zhì)的2個(gè)受體亞型，5-HT1A偶聯(lián)Gi/o降低腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase, AC)活性，減少環(huán)一磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate, cAMP)量，影響大腦調(diào)節(jié)情緒、喚醒等功能。通常5-HT1A激動(dòng)能緩解焦慮、增加淺深睡眠，5-HT2A偶聯(lián)G2q/11，激活磷酯酶C(Phospholipase C, PLC)，激動(dòng)5-HT2A可抑制漫波睡眠、引起覺(jué)醒增加。當(dāng)前，5-HT1A及5-HT2A受體拮抗劑也是睡眠失常和睡眠相關(guān)病癥治療的一線(xiàn)藥物[1-3]；這兩個(gè)受體在睡眠調(diào)節(jié)中起作用，其與中樞5-HT促眠機(jī)制有一定關(guān)系，但二者是否相關(guān)不甚清楚。針刺臍內(nèi)環(huán)合失眠穴是臨床失眠癥的有效療法[4]，具有改善對(duì)氯苯丙氨酸(p-chlorophenylalanine, PCPA)失眠大鼠神經(jīng)行為學(xué)以及改善中樞5-HT遞質(zhì)障礙機(jī)制和5-HT1A(5-HT2A)受體機(jī)制等實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[5]，本研究旨在探討5-HT1A和5-HT2A后信號(hào)通路對(duì)失眠中樞5-HT障礙機(jī)制改善的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動(dòng)物

80只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重(250±15)g，均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；室內(nèi)20～25 ℃，晝夜循環(huán)采光，飲水不限，喂食定時(shí)，預(yù)養(yǎng)15 d。

1.1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)PCPA試劑(批號(hào)：H30Y014；Alfa Aesar)；Ⅰ抗Gαq/11/14(Santa cruz，貨號(hào)：Sc-365906 )、Gαi/o(CST，貨號(hào)：5290S )、GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶；Bioswamp，貨號(hào)：PAB36269)，Ⅱ抗：Goat anti-Mouse IgG (Bioswamp，貨號(hào)：SAB43714 )；大鼠5-HT、cAMP、PLCβELISA試劑盒(均Bioswamp)，武漢基因美生物科技有限公司，批號(hào)：GR-201912、201907、RA20590。

1.1.3 儀器

SIGMA3-18K型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma)；Bio-Tek 800酶標(biāo)儀；Thermo洗板機(jī)；BIO-RAD電泳儀；電動(dòng)勻漿儀；培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

從80只正常SD大鼠中隨機(jī)抽出16只作為正常組，剩下64只經(jīng)腹腔注射PCPA溶液，制作PCPA失眠大鼠模型，篩選造模成功的48只失眠模型大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法均分至針刺組、模型組、非穴組，各組16只。各組動(dòng)物按分組隨機(jī)號(hào)順序編為1～16號(hào)；在各自干預(yù)完成后，每組取1～6號(hào)動(dòng)物進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，每組其余7～16號(hào)動(dòng)物再進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)及各組相應(yīng)指標(biāo)間統(tǒng)計(jì)相關(guān)分析。

1.2.2 PCPA失眠模型制作

PCPA臨用前按大鼠45 mg/(1 ml·100 g)用量，用弱堿性生理鹽水(pH7～8)配置成混懸液備用。

按文獻(xiàn)[4]采用“腹腔注射PCPA法”制作PCPA失眠模型，并篩選模型。

正常組按每 “1 ml/100 g大鼠體重”腹腔注射弱堿性0.9 %NS溶液。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)干預(yù)處理及療程

4組按相應(yīng)干預(yù)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1) 正常組和模型組：均給予與針刺組相同時(shí)間及強(qiáng)度的抓摸刺激干預(yù)(7 min)，無(wú)其他治療。

2) 針刺組：按臍內(nèi)環(huán)穴加失眠穴方針刺方法干預(yù)。

① 先予臍內(nèi)環(huán)穴針刺干預(yù)。

取穴：臍內(nèi)環(huán)穴，針刺心肝脾肺腎五臟穴點(diǎn)。臍內(nèi)環(huán)穴參照“十五”規(guī)劃教材《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠神闕穴定位(P328)及神闕至中脘20 mm折算”相應(yīng)定位，即是神闕旁開(kāi)2.5 mm處一條圓環(huán)線(xiàn)；其中，正左是脾胃，正右是肝，正上為心，正下為腎，左上方及右上方是肺，共6點(diǎn)。

針刺方法：采用0.25 mm×25 mm毫針，以10°～15°由內(nèi)向外刺2～4 mm深，不行針刺手法，留針30 s出針，共需3 min。

② 再予失眠方穴針刺干預(yù)。

取穴：支溝雙、神門(mén)雙、足三里雙、三陰交雙。大鼠支溝穴定位前肢外側(cè)，距腕關(guān)節(jié)4.5 mm左右的尺橈骨間，直刺1 mm；神門(mén)在前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣，直刺1 mm；足三里在膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處，直刺7 mm；三陰交在后肢內(nèi)踝尖直上10 mm，直刺5 mm。

針刺方法：采用0.25 mm×25 mm毫針，刺入穴位規(guī)定深度，施90°以?xún)?nèi)、頻率90～180次/min的小幅度高頻捻轉(zhuǎn)手法30 s出針，操作共需4 min。

該針刺組每次治療共7 min。

3) 非穴組： 非穴點(diǎn)按文獻(xiàn)[4]取兩肋下的固定點(diǎn)[4]及刺法，每點(diǎn)行針120 s后留90 s即出針，雙穴共7 min。

4組均按以上各自干預(yù)方案，1次/d，總6次。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海馬取材

實(shí)驗(yàn)干預(yù)完成后次日，斷頭處死實(shí)驗(yàn)大鼠，開(kāi)顱取出全腦，冰上分離海馬組織，冷0.9 %NS溶液洗凈血液，電子稱(chēng)稱(chēng)重后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.2.5 5-HT、cAMP、PLCβ含量檢測(cè)

按文獻(xiàn)[4]，采用“雙抗體夾心法”檢測(cè)大鼠海馬組織中5-HT、cAMP、PLCβ含量。

1.2.6 大鼠海馬Gαi/o、Gαq/11/14表達(dá)檢測(cè)

主要步驟：①提取總蛋白：取新鮮海馬組織稱(chēng)量，加適量蛋白酶抑制劑和蛋白裂解液，置冰水混和物中電動(dòng)研磨并勻漿，12 000轉(zhuǎn)，4 ℃離心，收集上清液，分裝，-80 ℃保存；②BCA法蛋白定量；③蛋白電泳；④轉(zhuǎn)膜；⑤封閉；⑥一抗孵育；⑦二抗孵育；⑧顯定影。應(yīng)用Quantity One軟件計(jì)算各組目標(biāo)蛋白條帶的灰度值，并與同一膜上相應(yīng)同組GAPDH 條帶的灰度值進(jìn)行比較，就該蛋白比值統(tǒng)計(jì)組間差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)PCPA大鼠海馬5-HT、PLCβ、cAMP含量的影響，如表1。

表1 各組大鼠海馬5-HT、PLCβ、cAMP含量的影響Tab.1 The contents of 5-HT, PLCβ, and cAMP in hippocampus of four group rats (Mean±S.D)

從表1可以看出：與正常組比較，PCPA失眠模型組5-HT、cAMP含量均較顯著性降低，而PLCβ含量顯著性升高；通過(guò)針刺后5-HT、cAMP含量均得以顯著升高，PLCβ含量顯著降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，也顯示經(jīng)穴作用的特異性。

2.2 各組5-HT與PLCβ、cAMP指標(biāo)間的相關(guān)性，如表2。

表2 各組大鼠海馬5-HT與PLCβ、cAMP指標(biāo)間相關(guān)性表Tab.2 The index correlation between 5-HT and PLCβ, cAMP in hippocampus of rats in each group(Mean ± S.D)

表2可見(jiàn)，各組5-HT與PLCβ之間呈負(fù)相關(guān)性，5-HT與cAMP之間均呈正相關(guān)性，各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

2.3 對(duì)PCPA大鼠海馬Gαi/o/GAPDH與Gαq/11/14/GAPDH相對(duì)表達(dá)的影響，見(jiàn)表3、圖1與圖2。

表3 各組大鼠海馬Gαi/o/GAPDH與Gαq/11/14/GAPDH含量的影響Tab.3 The relative contents of Gαi/o/GAPDH and Gαq/11/14/GAPDH in hippocampus of four group rats

從表3可以看出：PCPA失眠模型組Gαi/o稍有升高，針刺后數(shù)據(jù)稍有下調(diào)，但四組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而PCPA失眠模型組Gαq/11/14相對(duì)表達(dá)明顯降低，通過(guò)針刺后Gαq/11/14相對(duì)表達(dá)明顯升高，四組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，未顯示經(jīng)穴作用的特異性。

圖1所示為各組PCPA大鼠海馬Gαi/o/GAPDH相對(duì)表達(dá)量，模型組和非穴組較正常組表達(dá)要強(qiáng)，灰度深，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組PCPA大鼠海馬Gαi/o/GAPDH相對(duì)表達(dá)Fig.1 The expression of Gαi/o/GAPDH in the hippocampus of the four group rats

圖2所示為各組PCPA大鼠海馬Gαq/11/14相對(duì)表達(dá)量，模型組和非穴組較正常組表達(dá)明顯要弱，灰度淺，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組PCPA大鼠海馬Gαq/11/14/GAPDH相對(duì)表達(dá)Fig.2 The expression of Gαq/11/1/GAPDH in the hippocampus of the four group rats

3 討論

失眠癥總病機(jī)是“陰陽(yáng)失衡、水火失調(diào)”[6-7]。失眠穴方由“支溝、神門(mén)、足三里、三陰交”組成，立意關(guān)鍵是瀉火補(bǔ)水，用經(jīng)也取平衡陰陽(yáng)之義，是原廣西中醫(yī)藥大學(xué)肖繼芳教授治療失眠癥的針刺驗(yàn)方。臍內(nèi)環(huán)穴位于腹陰側(cè)臍旁開(kāi)0.5寸，溝通任沖，以諸陰之會(huì)任脈神闕為中心，是總的調(diào)陰和陽(yáng)要穴；又為機(jī)體三部人部所在，先后天之根，善調(diào)節(jié)先天后天，結(jié)合針向針刺，是調(diào)理臟腑信息和氣血之樞紐；由于臍通五臟神和氣，基本性起到針刺調(diào)氣調(diào)神作用；因而，臍內(nèi)環(huán)穴針刺是壯醫(yī)針刺的基礎(chǔ)調(diào)氣方法，在全身諸多疾病廣泛作為基礎(chǔ)調(diào)理方法使用，在失眠癥壯醫(yī)臨床中也是較具研究基礎(chǔ)和臨床效驗(yàn)的效方。數(shù)年來(lái)，筆者驗(yàn)證了臍內(nèi)環(huán)結(jié)合失眠穴方針刺治療失眠癥取效極好，明顯優(yōu)于二者單一針刺[4]， 這樣能有效地結(jié)合臍內(nèi)環(huán)針平衡陰陽(yáng)、調(diào)節(jié)臟腑、治神調(diào)氣的整體作用和失眠穴方肢體經(jīng)穴調(diào)節(jié)的遠(yuǎn)治作用，較切合失眠癥的總病機(jī)，是以確立其為失眠癥的研究方法。

睡眠生理病理基于睡眠-覺(jué)醒機(jī)制，睡眠障礙與一些中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)生改變密切相關(guān)[8-9]。中樞5-HT對(duì)慢波睡眠的發(fā)生和維持起著重要作用，是公認(rèn)的“致眠因子”[10]；海馬是參與腦內(nèi)5-HT睡眠-覺(jué)醒機(jī)制的重要結(jié)構(gòu)組織之一[11]；PCPA是中樞5-HT合成抑制劑，研究表明，腹腔注射PCPA 能導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)5-HT濃度下降約80 %[12]，導(dǎo)致睡眠晝夜節(jié)律消失，達(dá)到完全失眠，故PCPA大鼠模型是目前廣獲認(rèn)可及經(jīng)典的失眠癥研究動(dòng)物模型。中樞5-HT促睡眠物質(zhì)是受細(xì)胞功能調(diào)節(jié)分泌、合成或分解的，機(jī)體中5-HT受體亞型由自身5-HT配體直接激活，研究證明PCPA失眠中樞5-HT遞質(zhì)又受細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度水平調(diào)節(jié)的[13]，cAMP又是5-HT1A、5-HT2A受體后信號(hào)通路上的下游關(guān)鍵信號(hào)分子[14]，推測(cè)5-HT亞型受體介導(dǎo)的下游胞內(nèi)Gα/cAMP、Gα/cGMP/PLC細(xì)胞睡眠機(jī)制與中樞5-HT遞質(zhì)障礙機(jī)制可能存在某些相關(guān)性；5-HT1A、5-HT2A均屬G蛋白偶聯(lián)受體，海馬中均廣泛分布，5-HT1A偶聯(lián)Gαi/o，降低AC活性，減少cAMP生成，影響大腦調(diào)節(jié)情緒、喚醒和晝夜節(jié)律等功能，但大鼠海馬組織中5-HT1A對(duì)AC活性具有雙重調(diào)節(jié)作用[15]；5-HT2A偶聯(lián)Gαq/11，激活PLC，PLCβ(β-Phospholipase C, β型磷酯酶C)是Gαq/11調(diào)節(jié)的主要亞型，在調(diào)節(jié)睡眠覺(jué)醒中的起重要作用[13]。

研究結(jié)果顯示，一方面，PCPA失眠大鼠5-HT含量與Gαq/11蛋白表達(dá)均顯著降低，而PLCβ顯著升高，5-HT與PLCβ之間受損程度呈負(fù)相關(guān)性關(guān)系；經(jīng)過(guò)失眠方結(jié)合臍內(nèi)環(huán)穴針刺后5-HT、Gαq/11(G蛋白αq/11亞基)含量顯著升高，而PLCβ含量顯著下降，顯示經(jīng)穴相對(duì)特異性，且與PCPA大鼠5-HT的改善程度也呈負(fù)相關(guān)性，結(jié)合前期發(fā)現(xiàn)PCPA模型大鼠5-HT2A的蛋白、基因表達(dá)均顯著降低，該針刺顯著下調(diào)5-HT2A的蛋白[5]及基因表達(dá)的結(jié)果，說(shuō)明PCPA失眠模型大鼠不僅存在中樞5-HT遞質(zhì)障礙機(jī)制，也存在5-HT2A/Gαq/11/PLCβ受體后信號(hào)通路的受損機(jī)制，而該針刺對(duì)這二種障礙機(jī)制均有良性改善，5-HT2A受體后通路改善則抑制促醒有助于睡眠改善。另一方面，實(shí)驗(yàn)中PCPA失眠大鼠cAMP含量顯著下降，且5-HT與cAMP之間受損呈正相關(guān)性關(guān)系，該針刺方法顯著升高了cAMP含量，且與PCPA大鼠5-HT受損的改善呈正相關(guān)性，而針刺對(duì)Gαi/o(G蛋白αi/o亞基)無(wú)顯著改善作用，諸組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)合前期檢測(cè)到PCPA失眠大鼠海馬5-HT1A的蛋白及基因表達(dá)明顯降低，而該針刺有統(tǒng)計(jì)意義的升高[5]結(jié)果；從5-HT1A受體后信號(hào)通路的效應(yīng)看，PCPA失眠大鼠也存在受體后5-HT1A/Gαi/o/cAMP信號(hào)通路受損的機(jī)制，該針刺起到了改善這一信號(hào)通路損傷機(jī)制，與改善PCPA失眠大鼠中樞5-HT遞質(zhì)障礙機(jī)制相一致；本實(shí)驗(yàn)中，針刺后這一信號(hào)通路cAMP生成增加，導(dǎo)致5-HT合成、釋放增加，有助于失眠中樞5-HT遞質(zhì)障礙機(jī)制的改善，從而改善5-HT1A受體后通路則調(diào)節(jié)促眠功能。綜合二個(gè)受體后通路實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：PCPA模型大鼠存在中樞5-HT遞質(zhì)信號(hào)傳遞障礙機(jī)制，也存在5-HT1A、5-HT2A受體后細(xì)胞信號(hào)通路的障礙，二種障礙機(jī)制間存在某種內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，或形成一定神經(jīng)環(huán)路影響睡眠；而該針?lè)饶芨纳芇CPA大鼠核心的中樞5-HT遞質(zhì)障礙機(jī)制，也能調(diào)控并改善了受體后5-HT1A/Gαi/o/cAMP、5-HT2A/Gαq/11/PLCβ細(xì)胞信號(hào)通路的損傷機(jī)制，該兩個(gè)細(xì)胞通路機(jī)制改善也有助于中樞5-HT遞質(zhì)障礙機(jī)制的改善，綜合改善了睡眠障礙。