盧文紅，谷翊群*，賈孟春，周芳

(1.國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所/WHO人類生殖研究合作中心(北京)，北京 100081；2.國家衛(wèi)生健康委男性生殖健康重點實驗室，北京 100081)

世界衛(wèi)生組織(WHO)《人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實驗室檢驗手冊》于1980年首次出版，以滿足臨床與科研對人類精液標準化檢測程序日益增長的需求。該手冊是人類精液實驗室檢查和處理程序及方法的標準操作指南，旨在提高精液分析的質量和提高不同實驗室結果的可比性。

在過去40年里，該手冊進行了4次修訂與補充(1987年、1992年、1999年和2010年)，內容涉及精液檢查的標準化操作程序、精子功能、精漿生化、精液處理與冷凍以及質量保證等，已成為國際公認的標準，被世界各地臨床和實驗室廣泛使用。中國衛(wèi)生部已在2003年將其納入人類輔助生殖技術規(guī)范。

WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊(第5版)》精液參考值的數據是來自全球3大洲8個國家的前瞻性、多中心臨床研究的結果，通過循證醫(yī)學研究獲得的精液參數參考值具有里程碑式意義。自2010年出版以來成為WHO最受歡迎的出版物之一，即使在最近幾年其下載量也在穩(wěn)步增長。它是男科實驗室及全球范圍內開展精液分析操作的其他實驗室、醫(yī)院和研究機構使用的標準操作手冊。該手冊在國際大會、科學會議、以及WHO合作中心、專業(yè)學會和其他學術機構的培訓項目中進行了廣泛傳播。截止到2021年，已被3 000余篇同行評議論文和評論引用。

國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所從1992年起至今，作為WHO人類生殖研究合作中心，一直肩負著引進與推廣WHO相關技術標準與指南的職能，先后將手冊的第3版、第4版、第5版引入國內，翻譯成中文由人民衛(wèi)生出版社正式出版發(fā)行，并在全國范圍內長期進行精液分析標準化與質量控制的推廣，受到我國生殖醫(yī)學、男科學等領域及相關從業(yè)人員的廣泛歡迎。手冊供不應求，尤其第5版更是經歷5次印刷，舉辦了60余期標準化與質控培訓。

2021年7月WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊(第6版)》一經問世，便得到了業(yè)內廣泛關注。國家衛(wèi)生健康委科學技術研究所和四川省人口和計劃生育科學研究所作為WHO人類生殖研究合作中心獲得了WHO授權，將其翻譯成中文，并將由WHO出版合作中心人民衛(wèi)生出版社出版發(fā)行。

一、《人類精液檢查與處理實驗室手冊(第6版)》的變化

第6版手冊由9章組成，包括精液檢查(基本檢查、擴展性檢查、前沿性檢查)、精子制備及冷凍保存、以及質量評估和質量控制等，刪減、新增和擴展了部分章節(jié)。

1.基本檢查：是確定精液變量穩(wěn)定的常規(guī)方法，不僅是男科實驗室，任何開展精液檢查的實驗室都能遵循。

精子計數依然推薦使用改良Neubauer血細胞計數板的方法，但計數的方法有了改變。明確推薦了伊紅苯胺黑染色法作為精子存活率診斷的首選方法，伊紅染色和低滲腫脹實驗只作為備選方法。刪減了參考值下限的描述。對于精子活動率大于40%的樣本沒有必要做存活率評估。與第5版手冊中淡粉色判讀為活精子不同，明確了只有精子頭為白色的精子為活精子、淡粉色為死精子。

臨床數據表明，鑒別快速前向運動精子非常重要。因此，關于精子活力分級，第6版手冊建議恢復到快速前向運動、慢速前向運動、非前向運動和不活動4個活力級別，但精子活動率的參考值范圍卻依然是按前向運動(PR)、非前向運動(NP)、不活動(IM)3個活力級別計算。

第6版手冊強調，精子形態(tài)學評估的價值不僅在于其可用于判斷自然妊娠和輔助生殖技術(ART)結局的預后，還可以為男性生殖器官包括睪丸和附睪功能判斷提供更多診斷信息。對于3%和5%的精子“正常”形態(tài)率的判斷，則要求必須由訓練有素的人員評估1 500個精子來完成；對于無尾精子(只有頭部的精子)超過總精子數20%的精液，應單獨計算并在報告中注明；新版本提供了精子形態(tài)學評估順序圖；使用其它染色方法進行精子形態(tài)學評估，需用本手冊所描述的巴氏染色方法進行驗證；更加強調了精子形態(tài)學分析的內部和外部質量控制以及在形態(tài)學分析時使用多鍵分類計數器。

2.擴展性檢查：可以在某些情況下由實驗室選擇或根據臨床醫(yī)生的特殊要求而使用的項目。手冊增加了精子DNA損傷、遺傳學和炎癥細胞等相關檢查項目。提出了基因突變是導致不育和精液常規(guī)檢查異常的原因。新增了精液相關細胞因子、趨化因子等檢測的方法、試劑、檢測步驟等內容。

在精液參數異常的男性中普遍存在精子DNA損傷，并且已有報道指出其與精液參數正常男性的不育有關。由于與精液質量相關，精子DNA損傷檢測是男性不育檢查中的重要補充內容，已成為男科學基礎和臨床中論述最多、最有前景的精子損傷分子標志物之一。本版手冊增加了大量篇幅對其原理和檢測方法進行了描述。

新增了基因和基因組測序內容。臨床上，越來越多的人意識到染色體異常[數量異常、結構異常(包括微缺失和微重復)]和基因突變是導致各種男性不育癥的基礎病因，而這正是在精液分析中觀察到的許多異常的原因。盡管基因和基因組測序常規(guī)在醫(yī)學遺傳學實驗室進行，但一些男科實驗室也在做同樣的檢測。

關于精液中未成熟生殖細胞的評估，WHO《人類精液及精子宮頸粘液相互作用檢查實驗室手冊(第4版)》將精液中未成熟生殖細胞600萬/毫升以上界定為異常，但因未找到該界限值的可靠證據基礎，第6版建議不再將其作為參考值。

為明確生殖道炎癥對于男性不育的影響，泌尿男科醫(yī)生可能提出對精液中的趨化因子和細胞因子進行評估。本手冊納入了精液中白細胞介素檢測方法。

3.前沿性檢查：目前不作為生育力低下男性初步評估的常規(guī)方法。這一部分包括了非常專業(yè)化的、主要用于研究的方法和其他新興檢測技術。

有研究認為，氧化應激可能是影響人類精子功能和妊娠結局的重要因素；新的證據也表明了精子DNA完整性和染色質組裝與生育力的關系。前沿性檢查一節(jié)中詳細介紹了精子氧化應激和活性氧實驗、精子染色質檢測(苯胺藍和色霉素A3染色)的具體實驗操作及討論。

手冊重寫了計算機輔助精子分析(CASA)部分，強調了CASA對于檢測精子濃度的局限性與質控要求，增加了CASA檢測精子超活化運動的內容。

對精子跨膜離子流和轉運的功能分析，可更好地了解男性不育因素和男性生殖器官疾病。為此，手冊新增了檢測精子跨膜離子流和轉運的內容。

4.人類精子冷凍保存和儲存：增加了冷凍樣本的安全性、精液冷凍保存方案、快速液氮熏蒸冷凍、冷凍精液的解凍、玻璃化冷凍等內容，更具可操作性。本手冊對人類精子的冷凍保存提出了具體建議：將樣本分管分罐分開儲存；對使用的材料和留存標本建立定期核驗程序；所有儲罐都應有液位監(jiān)控報警系統(tǒng)，以監(jiān)測溫度和液氮液位，傳感器應連接警報器，可通過實驗室人員的終端進行提醒。

新證據表明，玻璃化冷凍是冷凍保存精液的一種有價值的方法。該方法的原理是將小體積樣本與無污染液氮直接接觸并快速冷凍，可以防止冰晶的形成，并減少精子的滲透性損傷。在麥管玻璃化冷凍(無菌玻璃化冷凍)中，也可以使用封閉系統(tǒng)，不需要無菌的液氮。

5.質量保證和質量控制：手冊保留了質量保證和質量控制章節(jié)，對部分內容進行了修訂，以使非統(tǒng)計專業(yè)人員更容易理解。

此外，因為一些檢測技術不適宜臨床使用，本手冊刪減了精子-卵母細胞相互作用試驗、人卵透明帶結合試驗、去透明帶倉鼠卵穿透試驗及精子與宮頸粘液接觸試驗等方法。

二、關于精液參考值范圍

前4版手冊提供了傳統(tǒng)人工檢查精液的參考值范圍與下限。在第5版手冊中，采用妊娠等待時間(time to pregnancy，TTP)對12個月內使其性伴侶自然懷孕的男性最接近伴侶妊娠時點的精液(精液標本來自3大洲的8個國家，獲得各個精液參數所使用的精液樣本數不一致，400例～1 900例不等)檢測結果的分布進行了統(tǒng)計，分布的第5個百分位點確定為可生育男性的精液參考值下限。數據來源于前瞻性多中心臨床研究。

而第6版是在第5版研究數據的基礎上，增加了來自中國、埃及、希臘、伊朗、意大利等國家2010年以后符合第5版手冊中TTP研究納入標準、自然懷孕時間在一年內(TTP為12個月之內)的同質性新數據(總數據量大約3 500例)進行了二次統(tǒng)計分析，計算出參考值范圍與下限。本手冊與第5版手冊相比，精液參考值范圍與下限變化不大，一些參數略有上下微調，表明在過去10年間在全球范圍內精液參數沒有出現明顯變化趨勢。

在過去的10年中WHO并沒有在全球范圍內牽頭開展多中心臨床研究，本手冊獲得的新數據與第5版數據收集年代不同，且有些數據的地域代表性有限。此外，由于精液檢查的諸多不確定性以及生育和不育男性的精液參數存在重疊分布，本手冊給出的精液參考值范圍可作為臨床男性不育治療決策的參考，但應避免過度解讀。

在此感謝同道們對《人類精液檢查與處理實驗室手冊(第6版)》中譯本的關注，歡迎大家對即將出版的中文譯本的翻譯內容提出寶貴意見。我們團隊將會在后續(xù)的學術會議或系列培訓中就一些技術問題進行深入解讀，共同提高我國男科學及男性生殖醫(yī)學實驗室檢測同質化水平。