孔慶敏，朱慧越，田培郡，趙建新，張灝，陳衛(wèi)，王剛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

丙戊酸(valproic acid，VPA)是目前治療癲癇最常用的藥物之一[1]，而肝毒性是其應用過程中最嚴重的并發(fā)癥之一，一種類型是可逆性肝功能不全，另一種類型的肝損害是不可逆性的肝中毒甚至死亡[2-3]，實驗表明，孕期服用VPA的含量與胎兒致畸程度、認知及社交障礙正相關，并且對子代的免疫系統(tǒng)和肝臟功能也同樣具有一定的影響[4]。結(jié)合RODIER等[5]在1996年首次通過大鼠子宮暴露VPA得到子代自閉癥(autism spectrum disorder，ASD)大鼠，因其所得ASD大鼠與臨床癥狀相似，孕期高濃度VPA干預已成為獲取ASD模型動物的常用造模方法。

ASD患者常伴隨胃腸道功能紊亂，與ASD嚴重程度呈正相關，多表現(xiàn)為腸漏、便秘、腹瀉、食道反流、腹痛和脹氣等癥狀[6]。當腸道微生態(tài)系統(tǒng)失衡，腸道黏膜屏障受損時，腸道微生物代謝產(chǎn)物包括內(nèi)毒素、氨、吲哚、酚類、短鏈脂肪酸、假性神經(jīng)遞質(zhì)前體、炎癥介質(zhì)等透過腸道屏障進入腸系膜淋巴組織，過度激活機體免疫系統(tǒng)，引起異常免疫反應，導致肝細胞凋亡、壞死。此外，來自腸道中的各種毒素需要由肝臟清除，同時肝臟還能清除腸源性細菌、真菌等，更加重了肝功能受損[7]。已有研究表明益生菌可以通過對腸道微生態(tài)系統(tǒng)的維護，降低內(nèi)毒素和血氨等濃度，緩解肝臟的損傷，改善肝臟代謝功能[8]。

本研究通過孕期高濃度VPA暴露獲得ASD大鼠，考察從斷乳后到性成熟嗜酸乳桿菌La28干預對孕期VPA暴露引起的子代大鼠外周炎癥和肝功能的作用，為篩選出更適合ASD患兒發(fā)育過程的益生菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養(yǎng)基

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)La28來自于菌種保藏中心，菌株分離自健康人腸道。

Wistar大鼠(雄性5只，初始體質(zhì)量280～290 g；雌性10只，初始體質(zhì)量220～250 g)，北京維通利華實驗動物技術有限公司。本研究經(jīng)江南大學實驗動物倫理委員會批準(JN.NO.20180915S0601230[183])，并按照歐洲共同體關于實驗動物的準則(Directive 98 2010/63/EU)進行操作。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基+0.05%L-半胱氨酸鹽酸鹽。

1.1.2 主要試劑

IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10 Elisa試劑盒，R&D Systems公司；利培酮，西安楊森制藥有限公司；糞便提取試劑盒(FastDNA Spin Kit for Feces)，MP Biomedicals, Santa Ana, CA；L-半胱氨酸鹽酸鹽，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備

BS-480全自動生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；AW500SG大型厭氧工作站，英國Electrotek有限公司；SW-CJ-1CV 型微生物操作超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；大容量冷凍離心機，美國 Beckman公司；高速冷凍離心機，Eppendorf公司；UV-1800紫外可見分光光度合計，島津儀器有限公司；高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司。

1.2 灌胃用菌制備

將凍存在保護劑內(nèi)的嗜酸乳桿菌La28于液體培養(yǎng)基活化3次，活化后的菌液按體積分數(shù)為2%接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)18 h，8 000×g離心20 min，以無菌生理鹽水清洗菌體2遍后，用10%脫脂乳作為保護劑(采用傾注法測得菌落總數(shù)為109CFU/mL)，凍存在-80 ℃?zhèn)溆?，灌胃前? 000×g離心3 min，用生理鹽水重懸。

1.3 動物實驗

大鼠飼養(yǎng)于江南大學實驗動物中心，室溫(25±2) ℃，相對濕度50%～55%，光照時間12 h，黑暗時間12 h。適應1周后，于下午17∶00合籠，雌雄數(shù)量比例2∶1。第2天早上8∶00前對每只雌鼠進行陰道涂片檢查，觀察到精子則記錄為妊娠第0.5天，雌鼠受孕后分籠飼養(yǎng)，分為實驗組(n=5)和對照組(n=5)。孕期12.5 d，孕鼠腹腔注射600 mg/kg的VPA (用生理鹽水配制丙戊酸鈉溶液至質(zhì)量濃度250 mg/mL)[9]，而在對照組腹腔注射等量的生理鹽水。實驗組出生的雄性大鼠被分配到模型組，而對照組出生的雄性大鼠在出生后第21天被分配到健康組。從4周齡到8周齡，每天同一時間，嗜酸乳桿菌La28組(La28，n=5)灌胃菌液，模型組(VPA，n=5)和空白組(對照，n=5)灌胃等量生理鹽水，藥物對照組(MED，n=5)灌胃等量生理鹽水配制的利培酮。8周齡的最后一天，乙醚麻醉，取血后處死，凝血后于1 500×g離心15 min，取血清，凍存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 外周炎癥評價

采用全自動生化分析儀檢測3組血清中IgA、IgG、IgM和C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)；用Elisa試劑盒檢測IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10。

1.5 肝功能評價

采用全自動生化分析儀檢測3組血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyl transferase，GGT)。

1.6 腸道菌群分析

VPA組大鼠(n=5)、對照組大鼠(n=5)、MED組(n=5)和La28組(n=5)大鼠在出生后第56天收集糞便樣本，使用糞便DNA提取試劑盒提取DNA。利用Illumina MiSeq 平臺對V3～V4區(qū)域進行擴增和測序[10]。

1.7 統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±均值標準誤差(mean±SD)表示。每個實驗至少重復3次。采用One-Way ANOVA以及Fisher’s LSD檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，P<0.05時具有顯著性差異。采用GraphPad Prism 7和R作圖，在Glaxay平臺進行LEfSe軟件分析，設置LDA Score的默認篩選值為2。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕鼠VPA暴露對子代的影響

孕期暴露的VPA可通過外周血循環(huán)和胎盤屏障均可直接進入子代體內(nèi)，利用其神經(jīng)毒性參與子代神經(jīng)管閉合，從而引發(fā)先天性的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育性疾病，此外，還會引起子代唇裂或腭裂、先天性心臟病、肢體缺陷、泌尿生殖器缺陷及肝臟脂質(zhì)代謝障礙等疾病[9]。如圖1所示(對照和VPA組大鼠均為5日齡)，孕期子宮暴露600 mg/kg VPA的子代大鼠出現(xiàn)了全部尾部畸形和部分手部畸形，尾部的畸形多表現(xiàn)為彎曲形狀，且與健康組比較短，手部的畸形表現(xiàn)為缺指，表明VPA在孕鼠子宮中成功暴露[11]。此外，SCHNEIDER等[12]發(fā)現(xiàn)孕期VPA暴露所得的自閉雄性小鼠的行為表現(xiàn)與ASD患者的臨床表現(xiàn)更為相似，因此本文選擇雄性子代進一步實驗。

2.2 嗜酸乳桿菌La28對孕期VPA暴露引起的子代大鼠外周炎癥的作用

2.2.1 嗜酸乳桿菌La28對血清細胞因子的作用

細胞因子通過促炎和抗炎途徑調(diào)節(jié)免疫反應。外周細胞因子可跨越血腦屏障參與中樞神經(jīng)活動。外周和神經(jīng)炎癥在ASD進程中發(fā)揮重要作用，ASD患者外周促炎因子水平上調(diào)，抑炎因子水平下調(diào)，同時伴隨著持續(xù)的神經(jīng)炎癥[13]。由圖2可知，從斷奶到性成熟期，孕期VPA暴露的子代大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平顯著升高，抑炎因子IL-10水平顯著下降。利培酮可以顯著下調(diào)大鼠的血清中IL-1β和TNF-α水平，但對IFN-γ水平?jīng)]有明顯的下調(diào)作用，甚至MED組比VPA組稍高，此外，利培酮可以輔助下調(diào)IL-6水平，上調(diào)IL-10水平。嗜酸乳桿菌La28可顯著下調(diào)大鼠血清中IL-6和TNF-α水平，同時IFN-γ和IL-1β水平均有所下降，IL-10水平上調(diào)，因此，嗜酸乳桿菌La28可以輔助降低促炎因子濃度上調(diào)抑炎因子水平，從而調(diào)節(jié)早期VPA暴露引起的血清促炎和抑炎因子水平的異常。已有研究明確益生菌在免疫調(diào)節(jié)中的作用，主要通過提高上皮細胞的完整性，調(diào)節(jié)上皮細胞分泌細胞因子提高免疫應答[14]。另外還可以輔助抑制NF-κB激活[15]和調(diào)節(jié)Toll樣受體的表達[16]，降低促炎細胞因子的表達。

圖1 VPA暴露對子代大鼠的致畸作用Fig.1 The teratogenic effect on offspring rats by VPA exposure

圖2 嗜酸乳桿菌La28對血清細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平的影響Fig.2 Effects of L.acidophilus La28 on the level of IL-1β,IL-6,IL-10,IFN-γ and TNF-α

2.2.2 嗜酸乳桿菌La28對血清CRP的作用

CRP是由肝臟合成的一種五聚體蛋白，是體內(nèi)急性相反應標志物[17]。已有研究表明，外周血CRP水平升高與抑郁癥、躁郁癥、精神分裂癥等神經(jīng)系統(tǒng)類疾病有關[18-19]。此外，動物研究已經(jīng)報道，外周血CRP水平反映的慢性炎癥狀態(tài)與小鼠的ASD樣行為相關[20-21]。且已有報道益生菌可參與下調(diào)CRP水平[22]，本研究中孕期VPA暴露的子代大鼠血清中CRP水平顯著上調(diào)(圖3)。利培酮可下調(diào)大鼠的血清CRP水平，從斷奶到性成熟期灌胃嗜酸乳桿菌La28的大鼠血清中CRP水平下調(diào)，雖然MED組和嗜酸乳桿菌La28組均可下調(diào)CRP水平，但兩組與VPA組均沒有顯著性差異，因此，嗜酸乳桿菌La28可以緩解早期VPA暴露引起的血清免疫因子CRP水平異常。

圖3 嗜酸乳桿菌La28對血清CRP水平的影響Fig.3 Effects of L.acidophilus La28 on the level of CRP

2.2.3 嗜酸乳桿菌La28對血清免疫球蛋白的作用

研究發(fā)現(xiàn)ASD患者的IgG亞型不全，IgA的血清含量低[23]，其中血清型IgA存在于血清中，血清IgA具有某些IgG和IgM的免疫功能，特異性IgA能中和血液中的抗原，同時也出現(xiàn)替代性補體免疫系統(tǒng)[24]。

另外，有研究表明有些ASD患者的IgA含量極低，甚至幾乎沒有，而分泌型IgA具有保護腸壁的黏膜組織的功能，因而ASD患者的腸黏膜較容易受損[23]，這與本實驗結(jié)果一致。由圖4可知，孕期VPA暴露的子代大鼠血清中IgG和IgA水平顯著上調(diào)，IgM無顯著性差異。利培酮可顯著下調(diào)大鼠的血清IgG水平，對IgA和IgM沒有明顯調(diào)節(jié)作用。從斷奶到性成熟，嗜酸乳桿菌La28的干預可下調(diào)大鼠血清中IgG水平，但與VPA組沒有顯著性差異，與MED組同樣對IgA和IgM沒有明顯調(diào)節(jié)作用。嗜酸乳桿菌La28對早期VPA暴露引起的免疫球蛋白IgG水平異常有明顯作用，且這與已有研究表明益生菌干預機體IgA的水平?jīng)]有顯著調(diào)控效果結(jié)果一致[25-26]。

圖4 嗜酸乳桿菌La28對血清IgG、IgM和IgA水平的影響Fig.4 Effects of L.acidophilus La28 on the level of IgG，IgM and IgA

2.3 嗜酸乳桿菌La28孕期VPA暴露的子代大鼠肝功能的作用

如圖5所示，孕期VPA暴露的子代大鼠ALT、AST、ALP和GGT水平顯著上調(diào)。利培酮可下調(diào)大鼠ALT、AST、ALT和GGT水平，提升肝功能，從斷奶到性成熟期，嗜酸乳桿菌La28的干預可下調(diào)大鼠ALT、AST、ALP和GGT水平，且可顯著調(diào)節(jié)ALT和GGT水平。因此，嗜酸乳桿菌La28可以顯著緩解早期VPA暴露引起的肝損傷。研究表明,益生菌主要通過改善腸道環(huán)境，調(diào)控腸道微生物組成結(jié)構(gòu)和短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物水平來維持腸道屏障功能，加強腸道的黏膜屏障作用，減少腸源性內(nèi)毒性通過門靜脈系統(tǒng)、內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)進入肝臟，進而改善肝臟病變程度[27-28]。

圖5 嗜酸乳桿菌La28對ALP、ALT、AST和GGT水平的影響Fig.5 Effects of L.acidophilus La28 on the level of ALP,ALT,AST and GGT

2.4 孕期VPA暴露的子代大鼠外周炎癥和肝功能指標的相關性分析

已有研究表明，外周炎癥和肝功能密切相關，來自腸道中的各種毒素通過門靜脈系統(tǒng)作用于肝臟，引發(fā)炎癥反應，導致肝功能受損[29-30]。因而，對本實驗中的外周炎癥指標和肝功能指標進行相關性分析(圖6)，發(fā)現(xiàn)IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP和IgG與肝功能指標均呈正相關，其中IL-6與ALT(r=0.700，P=0.024)、AST(r=0.702，P=0.024)、ALP(r=0.723，P=0.018)和GGT(r=0.790，P=0.007)4個指標都顯著正相關，IL-1β與ALP(r=0.729，P=0.017)呈顯著正相關。IL-10與ALT(r=-0.773，P=0.009)、AST(r=-0.745，P=0.013)和GGT(r=-0.705，P=0.023)4個指標都顯著負相關。嗜酸乳桿菌La28可以顯著降低外周IL-6的水平，同時也顯著降低了ALT和GGT的表達水平，因而推測嗜酸乳桿菌La28可能是通過調(diào)節(jié)VPA大鼠腸道環(huán)境降低外周IL-6的水平從而達到改善肝功能效果。

圖6 外周炎癥與肝功能指標相關性分析Fig.6 Correlation analysis between peripheral inflammation and liver function indicators

2.5 嗜酸乳桿菌La28對孕期VPA暴露的子代大鼠神經(jīng)炎癥和肝功能的綜合作用效果

利用主成分分析對上述所有指標進行綜合分析，由圖7可知，嗜酸乳桿菌La28對VPA暴露引起的子代大鼠的外周炎癥和肝功能的綜合緩解能力較好。

圖7 外周炎癥與肝功能指標綜合主成分分析Fig.7 Principal component analysis of peripheral inflammation and liver function indicators

2.6 嗜酸乳桿菌La28對VPA暴露的子代大鼠腸道菌群的影響

越來越多的證據(jù)表明腸道菌群失衡與ASD的嚴重程度有關[31]，基于腸道菌群失調(diào)在ASD中的作用，利用益生菌將腸道菌群重塑為健康狀態(tài)是近幾年提出的作為ASD的潛在治療方法。因此，基于16S rRNA擴增測序手段，進一步研究了嗜酸乳桿菌La28對孕期VPA暴露的子代大鼠的腸道微生物的影響。已有發(fā)現(xiàn)，在孤獨癥兒童的糞便樣本中，厚壁菌門的豐度低于健康兒童，厚壁菌門與擬桿菌門比值(F/B)升高[32-33]。這與本實驗研究結(jié)果一致，如圖8-a所示，孕期VPA暴露的子代大鼠F/B顯著上調(diào)，嗜酸乳桿菌La28和利培酮干預可以降低F/B水平，表明嗜酸乳桿菌La28菌群組成上能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。利用LEfSe分析確定了各組的優(yōu)勢菌群(圖8-b)，在屬水平上，孕期VPA暴露的子代大鼠的優(yōu)勢菌屬為Roseburia；利培酮干預后優(yōu)勢菌屬為Pseudomonas和Bifidobacterium；嗜酸乳桿菌La28干預后的優(yōu)勢菌屬為Anaerostipes。進一步對各組腸道菌群的屬水平進行分析，從圖8-c可知，與孕期VPA暴露的子代大鼠的腸道菌群比，嗜酸乳桿菌La28可以顯著提高Mucispirillum、Allobaculumhe、Desulfovibrio、Lactobacillus、Odoribacter和Bifidobacterium豐度(P<0.05)，其中對照組與嗜酸乳桿菌La28組的Allobaculumhe豐度沒有差異，且均高于VPA組和MED組，嗜酸乳桿菌La28組的Mucispirillum顯著性高于其他3組。說明嗜酸乳桿菌La28通過上調(diào)Allobaculumhe和Mucispirillum的相對豐度，增加厚壁菌門豐度，降低擬桿菌門豐度來調(diào)節(jié)腸道菌群從而改善VPA暴露引起子代大鼠的神經(jīng)炎癥和肝功能。

a-厚壁菌門與擬桿菌門比值；b-屬水平各組優(yōu)勢菌群；c-門水平和屬水平豐度差異 g-屬水平；p-門水平;f-科水平;o-目水平;k-界水平圖8 嗜酸乳桿菌La28對腸道菌群的影響Fig.8 Effects of L.acidophilus La28 on gut microbiota

3 結(jié)論

經(jīng)嗜酸乳桿菌La28干預后，對VPA暴露引起子代大鼠的神經(jīng)炎癥和肝功能具有有效的改善作用。其中，嗜酸乳桿菌La28對抑制促炎因子IL-6和TNF-α的表達和調(diào)節(jié)肝代謝酶ALT和 GGT的表達效果更佳，且在腸道菌群調(diào)節(jié)上效果更為顯著，為篩選出更適合ASD患兒發(fā)育過程的益生菌提供一定參考。