王婧，李敏，高娉娉，趙美，楊婕

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實驗室，甘肅 蘭州，730070)

冰葡萄酒屬于高檔甜型葡萄酒，因原料稀缺，酒體醇厚甘甜、香味濃郁而成為葡萄酒中的珍品[1]。近年來，由于全球氣候變暖，使釀酒葡萄果實出現(xiàn)成熟速度加快，糖分含量逐漸升高，酸度逐漸下降，風(fēng)味物質(zhì)含量降低等趨勢[2]，原料也不可避免的出現(xiàn)酸度缺乏、香氣復(fù)雜性欠缺等問題。酵母菌在葡萄酒釀造過程中的代謝活動會伴隨著甘油、酸類、醇類、酯類等物質(zhì)的生成而對葡萄酒質(zhì)量風(fēng)格產(chǎn)生重要影響[3]。近年來，隨著對葡萄酒相關(guān)酵母菌種的深入研究發(fā)現(xiàn)，一些具有潛在應(yīng)用價值的非釀酒酵母具有獨(dú)特的代謝通路和較強(qiáng)的酶活力，可以產(chǎn)生較低的酒精、增加甘油、調(diào)節(jié)酸度、釋放甘露糖蛋白或多糖，改善葡萄酒口感、增強(qiáng)顏色穩(wěn)定性以及香氣復(fù)雜性，且不同種屬的非釀酒酵母的貢獻(xiàn)也各不相同[4]。耐熱克魯維酵母(Lachanceathermotolerans)屬于Lachancea屬[5]，在酒精發(fā)酵過程中主要產(chǎn)生乳酸以增加溫帶葡萄種植區(qū)葡萄酒的酸度，有“生物酸化劑”之稱[6]。此外，L.thermotolerans亦能夠改善葡萄酒的一些質(zhì)量參數(shù)[7-12]。戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)在非釀酒酵母中具有較強(qiáng)的酒精發(fā)酵能力[13]，與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)相比能夠耐受葡萄汁中較高的滲透壓[14]，產(chǎn)生低濃度的乙酸和高級醇類，較高濃度的萜烯類物質(zhì)[15]。在工業(yè)化水平上，T.delbrueckii也是最早進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用的非釀酒酵母菌株[16]。目前關(guān)于L.thermotolerans和T.delbrueckii在干型葡萄酒上的研究報道較多，而在冰葡萄酒中應(yīng)用研究報道較少，尤其冰葡萄汁的發(fā)酵條件與其他類型的葡萄酒差異較大，其酒精發(fā)酵是在高滲透壓和高濃度SO2以及低溫條件下進(jìn)行，因此，針對非釀酒酵母菌株在冰葡萄酒生境下釀造特性的研究對于酵母資源的進(jìn)一步開發(fā)利用具有積極意義。

本試驗對實驗室保存的L.thermotolerans和T.delbrueckii菌株的嗜殺性、生長動態(tài)、耐受性、在冰葡萄酒生境下的發(fā)酵特性以及主要揮發(fā)性香氣化合物種類、含量等進(jìn)行分析，旨在評價兩菌株在冰葡萄酒釀造中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘貴人香’冰葡萄汁：2018年11月購于甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限責(zé)任公司，含糖量為34.45 °Brix、可滴定酸(以酒石酸計)6.75 g/L；當(dāng)天運(yùn)抵實驗室，加入60 mg/L SO2于4 ℃冰箱貯藏備用。

供試菌株Lachanceathermotolerans:LT1保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC,保藏編號33099)；菌株LT2由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實驗室篩選于自然發(fā)酵的葡萄醪中，根據(jù)其在WLN(wallerstein laboratory nutrient)鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)測序，其序列在NCBI上blast比對與Lachanceathermotolerans的序列100%匹配(登錄號MH472648.1)；菌株LT3保藏于CICC(保藏編號2.4066)。Torulasporadelbrueckii：TD1菌株來源于上海工業(yè)試驗所(保藏編號1004)；菌株TD2來源于山東扳倒井股份有限公司(保藏編號33295)；菌株TD3來源于甘肅省科學(xué)院生物研究所(保藏編號32851)。釀酒酵母活性干粉：CECA(編號SC)，安琪酵母公司提供；敏感菌株S.cerevisiae1 296：西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院贈送。

1.2 儀器與試劑

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YEPD)培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10.0、葡萄糖20.0、蛋白胨20.0、瓊脂20.0；YEPD-MB培養(yǎng)基：在YEPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，用0.1 mol/L的檸檬酸磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.6后，加入20.0 g/L瓊脂和0.3 g/L亞甲基藍(lán)指示劑。以上培養(yǎng)基均現(xiàn)用現(xiàn)配，并于121 ℃高壓滅菌20 min備用。

主要試劑：2-辛醇(色譜純)，SIGMA-ALDRICH(上海)貿(mào)易有限公司；L-蘋果酸和L-乳酸(色譜純)，上海源葉生物科技有限公司；NaOH、NaCl、Na2CO3、鹽酸、醋酸鈉、醋酸、無水葡萄糖等試劑(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；500051S立式高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-150-II生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Genesis 10 s紫外-可見分光光度計、Ultimate 3 000高效液相色譜儀、TRA-CE1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株活化和種子液制備

挑取供試菌株單菌落于YEPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，以2%的接種量分別接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行酵母菌接種試驗(細(xì)胞生物量均達(dá)到108CFU/mL)。

1.3.2 菌株嗜殺性測定

參照ULLIVARRI等[17]的牛津杯抑菌法。將敏感菌株S.cerevisiae1296 以2%的接種量接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h后，稀釋菌懸液至107CFU/mL，取100 μL涂布于YEPD-MB培養(yǎng)基，再取200 μL供試菌株的菌懸液分別加入牛津杯中，28 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察并測定酵母菌株周圍藍(lán)色的死菌帶，測定抑菌圈直徑與菌落直徑，其差值表示抑菌圈大小。

1.3.3 菌株生長曲線測定

參照楊婕等[18]的方法并略作修改。分別挑取各供試菌株的單菌落于YEPD液體培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，再以2%的接種量分別接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，16 ℃條件下培養(yǎng)，每隔2 h取250 μL菌液于離心管中，以未接種的YEPD培養(yǎng)基作為空白對照，使用紫外分光光度計測定OD630 nm的吸光值，繪制生長曲線。

1.3.4 菌株耐受性測定

參照楊婕等[18]和劉燦珍等[19]的方法并略作修改。以釀酒酵母SC為對照，分別測定3株L.thermotolerans(LT1、LT2、LT3)和3株T.delbrueckii(TD1、TD2、TD3)菌株的耐高糖、耐高酒精、耐高濃度SO2及耐低溫性能。將各菌株種子液以2%的接種量分別接種于葡萄糖質(zhì)量濃度分別為250、300、350、400、450、500 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為6%、9%、12%、15%；SO2質(zhì)量濃度分別為100、200、300、400 mg/L，溫度為10、13、16、19 ℃的YEPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，使用紫外分光光度計測定不同處理下的供試酵母菌株的OD630 nm的吸光值。

1.3.5 菌株發(fā)酵特性試驗

將各菌株種子液以2%接種量分別接種于水浴殺菌處理的冰葡萄汁中進(jìn)行純種發(fā)酵(初始菌體數(shù)量均為107CFU/mL)，每個樣品設(shè)3個平行。其中，水浴滅菌處理是將冰葡萄汁分裝于無菌棕色罐中，裝液量為70%，60 ℃水浴10 min[2]，水浴處理后取樣進(jìn)行平板計數(shù)，其滅菌后菌落總數(shù)小于10 CFU/mL，具有可行性。

1.3.5.1 乳酸測定

參照BUGLASS等[20]和PEREZ等[21]方法，并略作修改，采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。色譜條件：色譜柱BDS HYPERSILC18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；檢測器為二極管陣列檢測器；流動相為0.005 mol/L的硫酸水溶液；流速0.5 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長210 nm。

定性定量：將不同濃度的乳酸標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)樣，根據(jù)保留時間、出峰時間進(jìn)行定性；以不同標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，出峰面積進(jìn)行定量，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到乳酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(y=10.768x+0.035 5，R2=0.999 7)。

1.3.5.2 酒樣理化指標(biāo)測定

參照GB/T 15 038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]對殘?zhí)恰⒁掖俭w積分?jǐn)?shù)、揮發(fā)酸、總酸等基本理化指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.3.6 小容器發(fā)酵試驗

1.3.6.1 ‘貴人香’冰葡萄酒釀造工藝

冰葡萄酒釀造工藝參照李景明等[1]的方法；巴殺處理參照BENITO等[2]方法并略作修改:

冰葡萄汁→加SO2(60 mg/L)、果膠酶(20 mg/L)處理→巴氏殺菌處理(65 ℃，10 min)→接種試驗→16 ℃(低溫發(fā)酵)→終止發(fā)酵→倒罐→陳釀→指標(biāo)測定

1.3.6.2 菌株單獨(dú)接種試驗

將各菌株種子液分別以2%接種量接種于水浴殺菌處理的冰葡萄汁中進(jìn)行純種發(fā)酵(初始菌體數(shù)量均為107CFU/mL)，將接種酒樣置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到10%～11%時降溫至0 ℃左右，并添加SO2至120 mg/L，終止發(fā)酵，密封陳釀3個月后測定主要理化指標(biāo)及揮發(fā)性香氣化合物。

1.3.7 揮發(fā)性化合物測定

參照王玉華等[8]的方法，采用頂空固相微萃取-色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrum, HS-SPME-GC-MS)進(jìn)行測定。

HS-SPME處理：取8 mL酒樣于萃取瓶中，加入2.40 g NaCl及10 μL 8.82 mg/L 2-辛醇(內(nèi)標(biāo)物)，放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子密封后，置于磁力攪拌器上搖勻，于40 ℃下水浴平衡30 min，插入萃取頭磁力攪拌吸附富集30 min。

GC-MS條件：DB-WAX(60 m×2.5 mm，0.25 μm)色譜柱；柱升溫程序：40 ℃保持7 min，以4 ℃/min升至200 ℃，保持8 min；載氣：He，純度99.99%；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；不分流進(jìn)樣。電子轟擊離子源(EI)；離子源能量70 eV；傳輸線溫度：220 ℃；離子源溫度：240 ℃；質(zhì)譜掃描范圍50～350m/z。

定性分析：采用質(zhì)譜全離子掃描圖譜，根據(jù)本實驗室在相同檢測條件下建立的各化合物的保留時間、保留指數(shù)和質(zhì)譜信息以及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫檢索比對進(jìn)行定性分析。

定量分析：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，按公式(1)進(jìn)行計算：

(1)

式中：ρ，香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度；ρ內(nèi)，內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度；A1，測得香氣物質(zhì)的峰面積；A，測得內(nèi)標(biāo)物的峰面積；f，內(nèi)標(biāo)物的校正因子，f=1。

氣味活性值(odor activity value, OAV)：香氣物質(zhì)的含量與嗅覺閾值的比值。

1.3.8 感官分析

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]。按表1的評分標(biāo)準(zhǔn)給酒樣打分[23-24]。

表1 冰葡萄酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of ice wine

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均設(shè)3次重復(fù)。采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan’s多重比較在置信區(qū)間P<0.05下對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，對不同處理酒樣的香氣化合物進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株嗜殺性測定

嗜殺性是釀酒酵母生理特性的重要指標(biāo)之一，嗜殺性強(qiáng)的菌株能更好的保障葡萄酒正常的發(fā)酵過程，拮抗其他微生物的干擾。圖1為6株供試菌株對于敏感菌株S.cerevisiae1296的嗜殺性。由圖1可知，3株L.thermotolerans具有嗜殺性，抑菌圈的直徑分別為2.32、2.8和2.25 mm，其中LT2的嗜殺性最強(qiáng)。3株T.delbrueckii中只有TD2具有嗜殺性，抑菌圈的大小約為2.3 mm。

圖1 供試菌株嗜殺性結(jié)果Fig.1 Homicidal results of the tested strains

2.2 L.thermotolerans和T.delbrueckii供試菌株的生長曲線

由圖2可知，在16 ℃低溫條件下，3株L.thermotolerans菌株的生長趨勢大致相同(圖2-a)，均經(jīng)過了4～6 h的延滯期，然后需8～10 h的指數(shù)生長期，在第18 小時以后菌體數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定期。在指數(shù)生長期，L.thermotolerans的生長速率略低于對照SC，但達(dá)到穩(wěn)定期后菌體數(shù)量基本一致。3株T.delbrueckii在經(jīng)過6 h的延滯期后需10～14 h的指數(shù)生長期，并于第20～22小時達(dá)到穩(wěn)定期(圖2-b)。3株T.delbrueckii菌株在指數(shù)生長期的生長速率明顯低于SC，達(dá)到穩(wěn)定期后菌體數(shù)量也均較低于SC。

a-L.thermotolerans菌株;b-T.delbrueckii菌株圖2 供試菌株在YEPD培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 Growth curve of tested strains in YEPD medium

2.3 菌株耐受性分析

2.3.1 高糖耐受性

冰葡萄酒是在低溫下高糖發(fā)酵的一種甜型葡萄酒，冰葡萄汁中的糖度通常大于350 g/L，是發(fā)酵液中高滲透壓的主要因素，對酵母的生長繁殖具有一定脅迫抑制作用[25]。由圖3-a可知，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，釀酒酵母SC及供試的6株非釀酒酵母菌株的OD值均呈下降趨勢，但各菌株表現(xiàn)出的耐受性差異較大。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度在250～400 g/L時，所有菌株的OD值均大于1.2,但 LT1、LT3和TD1菌株的OD值顯著低于其他菌株；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到500 g/L時，供試的6株非釀酒酵母菌株的OD值顯著低于SC，其中，TD1菌株的OD值最低(約為0.6)，只能進(jìn)行微弱生長，LT2菌株顯著高于其他幾株非釀酒酵母菌株。因此，本試驗中3株L.thermotolerans菌株和TD2、TD3菌株對高糖環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)。

a-葡萄糖;b-SO2;c-乙醇;d-溫度圖3 供試菌株在不同條件下的生長情況Fig.3 Growth of tested strains under different conditions 注：不同字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3.2 高SO2的耐受性

在冰酒釀造中，當(dāng)達(dá)到所需酒度時需要終止發(fā)酵，通常采取的措施是添加高濃度SO2及降低溫度。如圖3-b所示，以釀酒酵母SC為對照，6株供試菌株的OD值均隨著SO2質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢，但LT1菌株與其他菌株相比對SO2的敏感性較強(qiáng)，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度為100 mg/L時其生長受到明顯抑制；菌株LT2、LT3在SO2質(zhì)量濃度達(dá)到400 mg/L其耐受性與SC差異不顯著，但顯著高于3株T.delbrueckii菌株，由此可知，菌株LT2、LT3具有非常強(qiáng)的SO2耐受性，而3株T.delbrueckii菌株之間對SO2耐受性無顯著差異。

2.3.3 乙醇耐受性

大多數(shù)非釀酒酵母由于酒精耐受性不高而只能存在于葡萄酒酒精發(fā)酵的前期和中期。而本研究中6株非釀酒酵母均具有較強(qiáng)的乙醇耐受性，由圖3-c可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到15%時，耐受性最低的LT3菌株的OD值也達(dá)到了1.5，其次，除了LT3和TD3菌株，其他4株供試非釀酒酵母菌株的OD值與釀酒酵母SC的差異不大，表明供試的幾株非釀酒酵母均具有良好的乙醇耐受性，這一結(jié)果與已有報道結(jié)果基本一致[19，26]。

2.3.4 低溫耐受性

冰葡萄汁通常于初冬季節(jié)才能獲取，通常將冰酒釀造溫度控制在10～19 ℃的低溫條件下進(jìn)行。由圖3-d可知，當(dāng)溫度在10 ℃時，供試菌株中只有釀酒酵母SC和TD2菌株的OD值大于0.5，表現(xiàn)出微弱的生長。隨著溫度升高，供試菌株的OD值均呈上升趨勢。當(dāng)溫度上升到16 ℃時，除LT1菌株外其他菌株的OD值均大于1.0，當(dāng)溫度達(dá)到19 ℃時，供試菌株的OD值均大于1.2，然而6株非釀酒酵母的OD值均顯著低于SC(OD值1.8)，其中TD1、TD2菌株的OD值均大于1.4，對低溫的適應(yīng)性較優(yōu)于TD3和LT2菌株，LT1和LT3菌株的低溫適應(yīng)性弱于其他菌株。

2.4 L.thermotolerans菌株乳酸生成量

對于冰葡萄酒來說，適量的有機(jī)酸類物質(zhì)可提高葡萄酒的風(fēng)味和口感，其甜酸協(xié)調(diào)的口感是冰葡萄酒的一個重要感官標(biāo)準(zhǔn)[8]，L.thermotolerans主要代謝特點(diǎn)是能夠產(chǎn)生乳酸。由圖4可知，在發(fā)酵溫度為16 ℃的條件下，3株L.thermotolerans菌株對冰葡萄汁發(fā)酵過程中能夠代謝產(chǎn)生L-乳酸，LT1、LT2和LT3均在第6天時達(dá)到最大值，分別為1.970、2.195和1.705 g/L，可以看出，在冰葡萄汁低溫發(fā)酵的條件下，LT2菌株的L-乳酸含量顯著高于其他2株L.thermotolerans。

圖4 三株L.thermotolerans菌株的乳酸生成量Fig.4 Production of lactic acid of three L.thermomotolerans strains

2.5 酒樣理化指標(biāo)分析

由表2可知，供試菌株釀制的冰葡萄酒主要理化指標(biāo)均符合GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》[27]國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。釀酒酵母SC釀制的冰酒乙醇體積分?jǐn)?shù)為14.0%，顯著高于其他6個非釀酒酵母處理組，其中3株L.thermotolerans處理組酒樣能夠達(dá)到的乙醇體積分為11.00%～11.43%，顯著低于3株T.delbrueckii酒樣(12.07%～12.83%)；從完成酒精發(fā)酵所需的時間來看，6株非釀酒酵母比釀酒酵母酒精發(fā)酵時間延長了10～25 d；3株L.thermotolerans酒樣中揮發(fā)酸含量顯著低于其他試驗組，其中LT2酒樣揮發(fā)酸含量低于對照70.74%，減少了約1.38 g/L；3株T.delbrueckii菌株發(fā)酵的酒樣中，揮發(fā)酸含量比對照SC顯著降低了50%～55.31%，減少了約0.94～1.05 g/L。BELY等[14]研究也指出，與釀酒酵母相比，T.delbrueckii可使揮發(fā)酸減少0.5～0.8 g/L，減少的程度主要取決于不同的T.delbrueckii菌株。

表2 酒樣基本理化指標(biāo)Table 2 Basic physico-chemical indices of wine samples

綜上所述，通過對3株L.thermotolerans和3株T.delbrueckii的生長曲線、耐受性及發(fā)酵性能分析，表明了L.thermotolerans和T.delbrueckii在高質(zhì)量濃度葡萄糖、高乙醇體積分?jǐn)?shù)、高SO2和低溫等條件下均具有較好的定殖能力，其中LT2和LT3、TD2和TD3等4株菌株耐受性良好。通過對供試的3株L.thermotolerans菌株的乳酸產(chǎn)生量及6株非釀酒酵母酒精發(fā)酵性能分析，最終以LT2和TD2菌株為優(yōu)選菌株，進(jìn)行單獨(dú)接種發(fā)酵以分析其在冰酒釀造中的應(yīng)用潛力。

2.6 LT2和TD2菌株單獨(dú)接種發(fā)酵的冰葡萄酒品質(zhì)分析

2.6.1 基本理化指標(biāo)分析

酒精發(fā)酵結(jié)束后，各試驗酒樣中殘?zhí)?、乙醇、揮發(fā)酸、總酸的含量如表3所示，根據(jù)國標(biāo)GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》中總糖 ≥ 125 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)為9.0%～14.0%及揮發(fā)酸 ≤ 2.1 g/L的要求，本次試驗所得酒樣均達(dá)到國標(biāo)要求，其中處理組TD2和LT2酒樣中揮發(fā)酸含量比對照SC酒樣分別降低55.3%和73.4%，總酸含量分別高出SC酒樣的9.2%和23.0%；pH值比SC酒樣降低4.0%和7.4%。

表3 ‘貴人香’冰酒基本理化指標(biāo)Table 3 Physico-chemical indices of ‘Italian Riesling’ ice wines

2.6.2 主要揮發(fā)性香氣化合物的分析

采用SPME-GC-MS技術(shù)對各酒樣中香氣物質(zhì)進(jìn)行分析，共檢測出50～63種香氣成分，包括16～19種高級醇類、15～18種酯類、8～9種脂肪酸類、6～10種萜烯類和5～7種其他類化合物。由圖5可知，各酒樣中香氣物質(zhì)的種類和含量差異較大。3個酒樣中高級醇含量最多，但2個處理酒樣與對照之間均無顯著差異(P< 0.05)；各酒樣中酯類物質(zhì)含量差異較大(955.25～2 999.68 μg/L)，TD2和LT2的總酯含量比SC酒樣(2 999.68 μg/L)分別下降了40.99%和68.15%，說明這2種非釀酒酵母在冰酒釀造中合成酯類物質(zhì)的能力遠(yuǎn)低于釀酒酵母，但TD2和LT2酒樣中萜烯類物質(zhì)含量顯著增加，高于SC酒樣的84.6%和89.70%；葡萄酒中大部分揮發(fā)性有機(jī)酸主要是發(fā)酵的副產(chǎn)物，低級飽和脂肪酸通常帶有不愉快的嗅感[28]，本試驗中TD2和LT2菌株發(fā)酵的酒樣中有機(jī)酸含量顯著低于對照SC酒樣的83.69%和93.69%；其他類化合物主要以醛酮類為主，由于含量較低未進(jìn)行分析。

圖5 不同酒樣產(chǎn)香特性比較Fig.5 Comparison of aroma production characteristics of different wine samples 注：圖中柱形圖代表香氣物質(zhì)含量，折線圖代表香氣物質(zhì)數(shù)量

OAV是評價單一香氣化合物對葡萄酒整體香氣貢獻(xiàn)程度的指標(biāo)，為了直觀分析釀酒酵母SC與2種非釀酒酵母LT2和TD2純種發(fā)酵的冰葡萄酒樣的香氣特點(diǎn)，對表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析(principal component analysis，PCA)，由圖6和圖7可知，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為70.33%和29.67%。其中，SC位于PC1和PC2的正向端，與正己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、棕櫚酸乙酯、癸酸和9-癸烯酸相關(guān)性強(qiáng)，對SC酒樣的花香、果香和脂肪味等貢獻(xiàn)較大；TD2位于PC1的負(fù)向端和PC2的正向端，與苯乙醇和乙酸苯乙酯有較大的關(guān)聯(lián)，對TD2酒樣的花香味貢獻(xiàn)較大；LT2位于PC1和PC2的負(fù)向端，與正己醇、1-戊醇和芳樟醇等香氣物質(zhì)關(guān)聯(lián)緊密，對LT2酒樣的醇香、花香等貢獻(xiàn)較大。通過PCA發(fā)現(xiàn),3個不同供試酒樣之間有較大的香氣差異，SC主要體現(xiàn)了酯類物質(zhì)的香氣，TD2主要體現(xiàn)了醇類物質(zhì)的香氣，這與BELDA等[15]研究一致，LT2主要增加了萜烯類香氣物質(zhì)帶來的花果香氣，BENITO等[6]研究也表明了這一點(diǎn)。

表4 供試酒樣中OAV>1的主要揮發(fā)性香氣成分及含量Table 5 Main volatile aroma components (OAV>1) in ice wine samples

圖6 香氣化合物(OAV>1)主成分分析的因子載荷圖Fig.6 Loadings plot from PCA of volatile aroma compounds (OAV>1)

圖7 香氣化合物主成分分析的供試酒樣的分布圖Fig.7 Score plot from PCA of the volatile aroma compounds

2.7 感官評價分析

試驗得到的3種貴人香冰葡萄酒均為澄清的金黃色酒體，由圖8中可知，在色澤和澄清度方面各酒樣的分值無明顯差異；從香氣評分來看，處理組TD2酒樣的花香、果香以及香氣強(qiáng)度方面的得分較高于LT2和SC酒樣，這一特點(diǎn)與TD2酒樣中苯乙醇和乙酸苯乙酯檢出量最高的結(jié)果相符；各處理酒樣在異味方面的得分無明顯差異；就口感方面而言，LT2處理酒樣的酸味和甜酸平衡感明顯高于TD2和SC酒樣，說明LT2酒樣中乳酸的產(chǎn)生對冰酒的酸甜協(xié)調(diào)性具有積極影響；從整體評分來看，2組處理酒樣的得分均明顯高于對照組?？偟膩砜矗琓D2菌株純種發(fā)酵的貴人香冰葡萄酒在一定程度上增加了花果香氣，而LT2菌株發(fā)酵的酒樣增強(qiáng)了酸度，有助于平衡冰酒的甜膩感，使口感協(xié)調(diào)。

圖8 感官分析雷達(dá)圖Fig.8 Radar map of sensory analysis

3 結(jié)論

通過對不同來源的3株L.thermotolerans和3株T.delbrueckii菌株的嗜殺性、生長特性和發(fā)酵性能的分析，結(jié)果表明：3株L.thermotolerans和TD2菌株均具有較強(qiáng)的嗜殺性；6株供試的非釀酒酵母菌株在16 ℃的低溫條件下均經(jīng)歷4～6 h的延滯期后很快進(jìn)入對數(shù)生長期，穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)量高，生長良好；LT2、TD2菌株在葡萄糖質(zhì)量濃度為400～500 g/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%、SO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為400 mg/L、溫度為13～19 ℃等條件下耐受性良好。3株L.thermotolerans菌株中LT2菌株的乳酸產(chǎn)量最高(2.195 g/L)。LT2和TD2菌株純種發(fā)酵能夠使冰葡萄酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到11%～12%，并且與釀酒酵母純種發(fā)酵的酒樣相比，萜烯類物質(zhì)總含量顯著增加，酯類、有機(jī)酸類物質(zhì)總含量顯著降低；其中TD2菌株純種發(fā)酵能夠增加乙酸苯乙酯、丙酸苯乙酯、反式-4-癸烯酸乙酯等乙醇酯以及萜烯類物質(zhì)的含量；LT2菌株能夠增加芳樟醇含量，賦予葡萄酒花香。感官分析表明，TD2菌株純種發(fā)酵的冰葡萄酒有較明顯的花、果香氣；LT2菌株能夠增強(qiáng)冰葡萄酒的酸度，有助于平衡冰酒的甜膩感，使口感協(xié)調(diào)。綜上所述，L.thermotolerans和T.delbrueckii菌株純種發(fā)酵在一定程度對冰葡萄酒的感官品質(zhì)有一定的積極影響。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步考察L.thermotolerans和T.delbrueckii分別與釀酒酵母混菌發(fā)酵的接種方式對冰葡萄酒品質(zhì)的影響，以期為利用非釀酒酵母提升冰葡萄酒的品質(zhì)提供理論參考。