樓志華，劉翔，張勁楠

1(江蘇省奧谷生物科技有限公司，江蘇 常州，213300)2(溧陽(yáng)維信生物科技有限公司，江蘇 常州，213300)

麥芽四糖酶 (glucan 1,4-α-maltotetraohydrolase)，又名麥芽四糖淀粉水解酶,可以連續(xù)地催化淀粉狀多糖中非還原型末端麥芽四糖殘基的水解，主要產(chǎn)物為麥芽四糖[1]。而麥芽四糖因其獨(dú)特的理化特性，一度被譽(yù)為最有希望的麥芽低聚糖[2]，在食品加工行業(yè)有著廣泛、重要的應(yīng)用。

麥芽四糖酶基因主要來(lái)源于斯氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)和嗜糖假單胞菌(Pseudomonassaccharophila)，二者來(lái)源的麥芽四糖酶均為α構(gòu)型。相比而言，嗜糖假單胞菌來(lái)源的麥芽四糖酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均較好，在40 ℃以下和pH 5.5～11均能長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定；在最適溫度(55 ℃)、最適pH(6.7)以及在其他宿主內(nèi)表達(dá)后酶活力也均較高[3]。這些因素表明嗜糖假單胞菌來(lái)源的麥芽四糖酶更適合于工業(yè)化應(yīng)用，也因而備受學(xué)者的關(guān)注。國(guó)內(nèi)，ZHOU、趙云等[4-5]在大腸桿菌中克隆表達(dá)了嗜糖假單胞菌來(lái)源的麥芽四糖酶，但獲得的重組酶大部分是包涵體，重組酶活力并不高。2019年，張梓芊、楊亞楠等[6-7]在Bacillussubtilis中構(gòu)建了表達(dá)系統(tǒng)胞外表達(dá)了嗜糖假單胞菌來(lái)源的麥芽四糖酶，發(fā)現(xiàn)其比活力為980.49 U/mg，通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化后，在搖瓶水平重組酶活力可高達(dá)147 U/mL。這些報(bào)道中，重組酶酶學(xué)性質(zhì)基本一致，在芽孢桿菌中表達(dá)可獲得更高的活力。國(guó)外，美國(guó)杰能科公司上市的麥芽四糖酶SAS3則以地衣芽孢桿菌為宿主進(jìn)行重組表達(dá)[8]，并且在地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)相關(guān)淀粉酶方面形成了技術(shù)封鎖，因此導(dǎo)致國(guó)內(nèi)純化的麥芽四糖價(jià)格極高。地衣芽孢桿菌是優(yōu)良的食品安全級(jí)表達(dá)宿主，被美國(guó)FDA認(rèn)定為食品安全級(jí)菌株(Generally Recognized As Safe, GRAS)已有近40年的歷史，而且該菌產(chǎn)酶能力高，胞外蛋白分泌能力大約是枯草芽孢桿菌的2倍[9]。然而，國(guó)內(nèi)目前還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)重組地衣芽孢桿菌表達(dá)麥芽四糖酶的研究。

本研究擬構(gòu)建地衣芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)來(lái)源于嗜糖假單胞菌的麥芽四糖酶基因進(jìn)行木糖誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)果聚糖合酶信號(hào)肽使麥芽四糖酶分泌至胞外，并對(duì)構(gòu)建的重組菌進(jìn)行初步發(fā)酵條件優(yōu)化，以期為地衣芽孢桿菌的異源表達(dá)以及麥芽四糖酶的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用敲除了α-淀粉酶基因amyL和堿性蛋白酶基因aprE的地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisCICIM B1391(BLΔAE)、E.coliJM109以及大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pHY300-PLK，均購(gòu)于江南大學(xué)，由江蘇省奧谷生物科技有限公司保藏。重組質(zhì)粒pBLSY2由江南大學(xué)石貴陽(yáng)教授惠贈(zèng)，該重組質(zhì)粒攜帶了來(lái)源于B.licheniformisCICIM B1391自身的木糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子及其調(diào)控蛋白基因、枯草芽孢桿菌果聚糖合酶信號(hào)肽基因sacBss、B.licheniformisATCC 14580的麥芽糖淀粉酶基因以及木糖異構(gòu)酶基因的終止子ter。嗜糖假單胞菌麥芽四糖酶基因序列由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查尋獲得，序列號(hào)為：X16732.1，將該序列和終止子ter一并委托上海生物工程有限公司合成，合成后的片段插入至質(zhì)粒pET28a中，即pET28a-G4-ter。重組質(zhì)粒pBLxys、pBLG4，重組地衣芽孢桿菌BLG4由本研究構(gòu)建。

1.2 工具酶、引物和試劑

含DNA聚合酶的Taq和Pfu預(yù)混液、T4 DNA連接酶，Thermo Fisher公司；各種限制性內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒,TAKARA有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1；酵母粉和蛋白胨,安琪酵母有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3 DNA操作技術(shù)

質(zhì)粒提取、DNA片段純化、回收等均參照TAKARA試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)、DNA瓊脂糖凝膠電泳、酶切、連接以及轉(zhuǎn)化子篩選等均參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[10]。

1.4 木糖誘導(dǎo)分泌表達(dá)載體的構(gòu)建

首先以重組質(zhì)粒pBLSY2為模板，以PxylF、PxylsR為引物，擴(kuò)增含木糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子及其調(diào)控蛋白基因和信號(hào)肽的基因片段Blxyl-sacBss，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。然后分別同pHY300-PLK經(jīng)HindⅢ和KpnⅠ酶切后通過(guò)膠回收克隆至pHY300-PLK，獲得木糖誘導(dǎo)分泌表達(dá)的重組質(zhì)粒pBLxys后轉(zhuǎn)化至E.coliJM109，即E.coliJM109/pBLxys。再以pET28a-G4-ter為模板，以引物PxylsF、PterR擴(kuò)增麥芽四糖酶結(jié)構(gòu)基因，反應(yīng)條件與上述一致，再分別同pHY300-PLK經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ酶切后通過(guò)膠回收克隆至pBLxys，即為木糖誘導(dǎo)分泌表達(dá)麥芽四糖酶的重組質(zhì)粒pBLG4，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化子篩選后，送去測(cè)序，測(cè)序正確后即獲得攜帶pBLG4重組質(zhì)粒的E.coliJM109/pBLG4。

1.5 重組地衣芽孢桿菌的構(gòu)建

培養(yǎng)E.coliJM109/pBLxys、E.coliJM109/pBLG4，提取重組質(zhì)粒pBLxys、pBLG4后，按文獻(xiàn)[13]所述電轉(zhuǎn)方法分別將其轉(zhuǎn)入BLΔAE，從而獲得重組地衣芽孢桿菌BLXYLS和BLG4。

1.6 麥芽四糖酶酶活定義及測(cè)定

麥芽四糖酶酶活力單位(U)定義為：在pH 7.0和50 ℃的反應(yīng)條件下，每分鐘分解可溶性淀粉生成相當(dāng)于1 μmoL葡萄糖所需的酶量。

麥芽四糖酶酶活測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[5]。

1.7 發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

LBG培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨FP321 10.0，酵母粉FM408 5.0，NaCl 10.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麥芽糊精 90，蛋白胨FP321 20，酵母粉FM408 10，玉米漿干粉5，(NH4)2HPO410，K2HPO4·3H2O 9.12，KH2PO41.36，CaCl20.50，MgSO4·7H2O 0.50。

在進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，均使用擋板搖瓶進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵前均加入終質(zhì)量濃度為20 mg/L的四環(huán)素。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI顯示，嗜糖假單胞菌麥芽四糖酶基因序列(G4-ter)總長(zhǎng)約1.7 kbp，編碼551個(gè)氨基酸，理論上蛋白大小為59.9 kDa，而終止子序列總長(zhǎng)為0.1 kbp，因此KpnⅠ和XbaⅠ酶切后應(yīng)獲得約1.8 kbp和6.3 kbp大小的2條核酸條帶。Blxyl-sacBss基因片段長(zhǎng)度約為1.4 kbp，經(jīng)HindⅢ和KpnⅠ酶切后應(yīng)獲得約6.7 kbp和1.4 kbp大小的2條核酸條帶。對(duì)獲得的克隆宿主E.coliJM109/ pBLG4提取重組質(zhì)粒pBLG4，質(zhì)粒大小約8.1 kbp，構(gòu)建重組表達(dá)載體圖見(jiàn)圖1。然后分別用HindⅢ、HindⅢ和KpnⅠ、KpnⅠ和XbaⅠ酶切，電泳鑒定結(jié)果如圖2，結(jié)合測(cè)序結(jié)果，可以充分說(shuō)明重組表達(dá)載體構(gòu)建正確。

2.2 重組麥芽四糖酶的表達(dá)

將對(duì)照菌BLXYLS和重組菌BLG4分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，接種后8 h均加入10 g/L木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，然后繼續(xù)培養(yǎng)30 h，離心后收集發(fā)酵液上清，分別檢測(cè)二者胞外麥芽四糖酶活力。結(jié)果顯示，只有重組菌BLG4檢測(cè)到活力，而對(duì)照菌BLXYLS未檢測(cè)到活力。將二者發(fā)酵液上清進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢园l(fā)現(xiàn)在約60 kDa處出現(xiàn)一明顯的表達(dá)條帶，這與理論推測(cè)的蛋白大小基本一致，表明重組菌成功地將麥芽四糖酶分泌到了發(fā)酵液中。

Blxyl-木糖異構(gòu)酶啟動(dòng)子及其調(diào)控蛋白基因；sacBss-枯草 芽孢桿菌果聚糖合酶信號(hào)肽基因；G4-嗜糖假單胞菌 麥芽四糖酶基因；ter-木糖異構(gòu)酶基因的終止子圖1 重組表達(dá)載體pBLG4Fig.1 Diagram of recombinant expression vector pBLG4

M-Maker；1-pBLG4/Hind Ⅲ；2-pBLG4/Hind Ⅲ+ Kpn Ⅰ； 3-pBLG4/Kpn Ⅰ+ Xba Ⅰ圖2 重組表達(dá)載體pBLG4驗(yàn)證電泳圖Fig.2 Electropherogram of recombinant expression vector pBLG4

M-Maker；1-BLXYLS；2-BLG4圖3 發(fā)酵液上清液SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electropherogram of fermentation broth supernatant

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

重組菌接種后，在37 ℃、250 r/min下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在接種后的8、12、16、20、24、28、32 h取樣檢測(cè)OD600，并添加10 g/L木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)酵至24 h時(shí)補(bǔ)加30 g/L麥芽糊精，發(fā)酵至48 h時(shí)添加10 g/L的木糖，然后繼續(xù)發(fā)酵至72 h結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，取樣檢測(cè)OD600和發(fā)酵液中的麥芽四糖酶活力，結(jié)果如表2、圖4所示。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)重組菌生長(zhǎng)影響較小，但對(duì)發(fā)酵結(jié)束時(shí)胞外麥芽四糖酶酶活有顯著影響。隨著誘導(dǎo)劑添加時(shí)間的延遲(8～24 h)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)檢測(cè)到的胞外酶活呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵24 h添加誘導(dǎo)劑時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)胞外酶活力高達(dá)(138.2±11.2) U/mL；而當(dāng)28、32 h添加誘導(dǎo)劑時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)酶活有所降低。

事實(shí)上，這與木糖操縱子在地衣芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)錄特性有關(guān)，據(jù)文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期到穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)換期間木糖操縱子轉(zhuǎn)錄活性顯著增加，并且這種較高的轉(zhuǎn)錄活性會(huì)維持近12 h。根據(jù)檢測(cè)到的菌體量來(lái)看，發(fā)酵至24 h后，重組菌的生長(zhǎng)速率明顯降低，該時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期到穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)換期間，因此，在發(fā)酵24 h時(shí)誘導(dǎo)能夠檢測(cè)到較高的麥芽四糖酶酶活。

2.3.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)發(fā)酵的影響

重組菌接種后，在37 ℃、250 r/min下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至24 h時(shí)，添加10 g/L木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，并添加30 g/L麥芽糊精，分別轉(zhuǎn)移至25、30、37、42 ℃，發(fā)酵至48 h時(shí)添加10 g/L的木糖和30 g/L，然后繼續(xù)發(fā)酵至72 h結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，取樣檢測(cè)OD600和發(fā)酵液中的麥芽四糖酶活力，結(jié)果如圖5所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶均有顯著的影響。在25～37 ℃，隨著溫度升高，發(fā)酵結(jié)束后的菌體量也越來(lái)越高，而42 ℃時(shí)，菌體量又有所降低，這說(shuō)明重組菌最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)，胞外酶活力最高可達(dá)(161.4±10.4) U/mL，37 ℃次之，42 ℃時(shí)胞外酶活力最低。

重組菌在溫度脅迫下的產(chǎn)酶特性是可以預(yù)見(jiàn)的。溫度低時(shí)，菌體整體代謝速率較慢，酶的合成速率也會(huì)降低[14]。而溫度較高時(shí)，盡管菌體代謝速率增加，但地衣芽孢桿菌分泌的其他蛋白酶也會(huì)增加[15]，對(duì)重組酶的水解速率也會(huì)增加，另外重組酶自身的穩(wěn)定性也可能有所下降。所以，誘導(dǎo)溫度變化對(duì)重組菌生長(zhǎng)和重組酶酶活力均有較大的影響。

表2 不同時(shí)間添加誘導(dǎo)劑發(fā)酵結(jié)束時(shí)的菌體量Table 2 Biomass at the end of fermentation under different induction time

圖4 誘導(dǎo)劑不同添加時(shí)間對(duì)重組菌表達(dá)麥芽四糖酶的影響Fig.4 Effect of different adding time of inducer on the expression of maltotetraose in recombinant bacteria

圖5 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌表達(dá)麥芽四糖酶的影響Fig.5 Effect of induction temperature on the expression of maltotetraose in recombinant bacteria

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

根據(jù)2.3.1和2.3.2的結(jié)果，在37 ℃、250 r/min下對(duì)重組菌進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至24 h時(shí)，添加2%木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，并轉(zhuǎn)移至30 ℃繼續(xù)發(fā)酵。誘導(dǎo)后每隔12 h檢測(cè)菌體量OD600和麥芽四糖酶酶活。結(jié)果如圖6所示?？梢钥吹?，發(fā)酵至84 h時(shí)，胞外檢測(cè)到的最大酶活力為(168.2±9.41) U/mL，之后酶活力明顯開(kāi)始下降。顯然，重組地衣芽孢桿菌胞外酶活力開(kāi)始下降的時(shí)間要略晚于穩(wěn)定期，這與2.3.1小節(jié)所記錄的特性相符，表明木糖誘導(dǎo)型重組地衣芽孢桿菌發(fā)酵至穩(wěn)定期結(jié)束時(shí)停止發(fā)酵最為合適。

圖6 重組地衣芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.6 Growth and maltotetraose production curves of recombinant Bacillus licheniformis

在后續(xù)應(yīng)用過(guò)程中，對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了簡(jiǎn)單研究。以淀粉液為化液底物反應(yīng)時(shí)，其最適pH為7.0，最適反應(yīng)溫度為50 ℃，并且在反應(yīng)48 h后，相對(duì)酶活力仍能達(dá)50%以上，結(jié)合異淀粉酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，麥芽四糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)72.4%，其特性與文獻(xiàn)報(bào)道[5-7]基本一致，表明重組酶的酶學(xué)性質(zhì)未發(fā)生明顯改變，有良好的應(yīng)用前景。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)麥芽四糖酶的發(fā)酵還處于基礎(chǔ)研究階段，多見(jiàn)于在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌中的表達(dá)，在地衣芽孢桿菌中的表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道。楊亞楠等[7]在以枯草芽孢桿菌表達(dá)來(lái)源于嗜糖假單胞麥芽四糖酶的表達(dá)時(shí)，搖瓶水平酶活力可力達(dá)147 U/mL，本研究搖瓶水平酶活力可達(dá)(168.2±9.41) U/mL，較之有所提高，但提高有限。多項(xiàng)研究顯示，地衣芽孢桿菌胞外蛋白分泌量可達(dá)枯草芽孢桿菌的2倍[9]，這表明地衣芽孢的表達(dá)性能仍未被完全開(kāi)發(fā)，其優(yōu)勢(shì)尚未完全發(fā)揮，可提升的空間仍然很大。據(jù)報(bào)道[1]，美國(guó)杰能科公司也是通過(guò)重組地衣芽孢桿菌分批補(bǔ)料發(fā)酵，表達(dá)嗜糖假單胞菌的麥芽四糖酶，根據(jù)該酶的比酶活[7]及地衣芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性，保守估計(jì)其發(fā)酵水平應(yīng)在10 000 U/mL左右。就本研究結(jié)果來(lái)看，盡管繼續(xù)通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化能夠繼續(xù)提升發(fā)酵水平，但提升效果可能有限，還需要充分挖掘地衣芽孢桿菌的表達(dá)潛力，提升其表達(dá)能力，諸如在密碼子偏好性[16]，酶蛋白修飾[17]，蛋白酶基因繼續(xù)敲除[18]，高效啟動(dòng)子開(kāi)發(fā)[19-20]等方面均可繼續(xù)進(jìn)行深入研究。

3 結(jié)論

本研究利用地衣芽孢桿菌木糖誘導(dǎo)分泌表達(dá)載體，對(duì)來(lái)源于嗜糖假單胞菌麥芽四糖基因進(jìn)行了表達(dá)，重組酶成功地分泌至胞外，能夠在發(fā)酵液上清液中檢測(cè)到酶活力，而且目標(biāo)蛋白大小符合理論大小。對(duì)重組菌進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化：在24 h添加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度30 ℃，發(fā)酵至穩(wěn)定期結(jié)束停止發(fā)酵，搖瓶水平可高達(dá)(168.2±9.41) U/mL。