高表達(dá)MAL62基因?qū)γ姘湍改透咛堑挠绊?/h1>
2021-01-20 10:33:30孫溪劉海晴張軍范志華黃亮
食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年1期
孫溪，劉海晴，張軍，范志華，黃亮
1(天津農(nóng)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，天津, 300384)2(天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津, 300384) 3(天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津, 300384)
面包工業(yè)中常常使用含糖面團(tuán)來制作甜面包，但高濃度的糖分會引發(fā)高滲脅迫，導(dǎo)致胞內(nèi)水分外遷，擾亂并破壞細(xì)胞質(zhì)膜上的離子梯度和細(xì)胞抵御能力，并最終使細(xì)胞破裂死亡[1]。為應(yīng)對此種情況，酵母細(xì)胞通常會富集甘油、海藻糖、氨基酸等物質(zhì)來抵御高滲脅迫引起的細(xì)胞損傷，提高菌株抗性[2]。
酵母菌能夠利用麥芽糖與MAL基因座(MAL1～4和MAL6)有關(guān)，每個MAL基因座均包含編碼麥芽糖運輸?shù)鞍椎腗ALx1(又名MALxT)，x代表基因座位置，編碼麥芽糖酶的MALx2(又名MALxS)，以及編碼正調(diào)節(jié)蛋白的MALx3(又名MALxR)，其中麥芽糖酶是麥芽糖水解的關(guān)鍵酶[3]。在之前的試驗中發(fā)現(xiàn)，工業(yè)酵母BY14a中高表達(dá)麥芽糖酶編碼基因MAL62，會提高突變株B+MAL62的胞內(nèi)海藻糖含量，增強突變株耐冷凍能力[4]。海藻糖是一種非還原性的葡二聚糖，隨著外界生存壓力的增強，其在胞內(nèi)的含量會隨之上升[5]。BELL等[6]發(fā)現(xiàn)，酵母在面臨滲透壓脅迫時，野生菌株比無法合成海藻糖的突變株(TPS1Δ、TPS2Δ)生存率更高。STAMBUK等[7]和JULES等[8]等研究發(fā)現(xiàn)，酵母從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運海藻糖時，菌株自身的麥芽糖代謝狀態(tài)會對這個過程有所影響，只有組成型表達(dá)的MAL基因座才能夠開啟Agt1p的海藻糖轉(zhuǎn)運功能。
目前有關(guān)菌體耐脅迫受麥芽糖代謝調(diào)控的相關(guān)研究僅集中在完整的MAL基因座上，針對單獨的麥芽糖酶與胞內(nèi)海藻糖含量以及酵母耐高滲能力之間的聯(lián)系并無報道。由于海藻糖具有保護(hù)胞內(nèi)可溶性酶和細(xì)胞膜穩(wěn)定性的功能[9]，因此，猜測MAL62基因的高表達(dá)可能會使突變株在耐冷凍以外獲得一定程度的耐高滲能力。鑒于此，本課題計劃探究麥芽糖酶編碼基因MAL62高表達(dá)對菌株的生長特性、形態(tài)特征、胞內(nèi)應(yīng)激物質(zhì)積累及產(chǎn)氣在不同糖濃度環(huán)境下所帶來的影響，并與市售高糖酵母進(jìn)行對比，初步探索相關(guān)現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因，為挖掘面包酵母麥芽糖酶多抗性奠定良好基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 菌種及培養(yǎng)基
釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY14a，天津科技大學(xué)張翠英教授惠贈；突變株B+MAL62及市售高糖活性干酵母GSJ與GML，保存于天津農(nóng)學(xué)院發(fā)酵與釀造食品實驗室。
酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YEPD)培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，固體YEPD添加瓊脂2%。LSMLD培養(yǎng)基：液體模擬面團(tuán)培養(yǎng)基,其配方參考文獻(xiàn)[10]。高糖培養(yǎng)基：在LSMLD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，將葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)替換為40%、50%與60%。培養(yǎng)基均需121 ℃滅菌20 min。
1.2 主要試劑與設(shè)備
葡萄糖、酵母浸粉和瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蛋白胨，天津市英博生化試劑有限公司；海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品(分析純99%)，Sigma公司；丙三醇(分析純)，天津試劑廠；甘油檢測試劑盒，Megazyme公司；高筋小麥粉，五得利金富強；其他未注明試劑均為分析純，國藥化學(xué)試劑公司。
恒溫培養(yǎng)箱(DHP-420BS)，天津市中環(huán)電爐有限公司；立式搖床(HNY-2102C)，天津歐諾儀器股份有限公司；移液器(Research plus)，Effendorf公司；高速冷凍離心機(gL20A)，中科院生物物理所技術(shù)服務(wù)公司；離子濺射儀(SD-3000)，北京博遠(yuǎn)微納科技有限公司；臺式掃描電子顯微鏡(Phenom pro)，荷蘭飛納公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 菌種培養(yǎng)條件
挑取1環(huán)菌泥接入5 mL YEPD培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩24 h，以1%接種量轉(zhuǎn)入高糖LSMLD培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)相應(yīng)時間。
1.3.2 海藻糖與甘油檢測方法
取適量菌體，雙蒸水洗滌2次。胞內(nèi)海藻糖測定采用硫酸蒽酮法[11]，甘油含量的測定采用Megazyme甘油檢測試劑盒[12]，實驗重復(fù)3次取平均值。
李離說：“昔年須菩提大師找孫悟空，弘忍大師找惠能，都是這么干的啊，米熟久矣，猶欠篩哉，提醒我們幾個，三更天等您回來?。∫俏覀儧]有認(rèn)出您的花間游跟翡翠鐲子，聽吳耕的話，也騎驢子走了，您這半個月做掌柜的工夫豈不是白瞎了？”
1.3.3 生長性能測定
菌體在高糖培養(yǎng)基中30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)64 h，每隔2 h取樣，雙蒸水洗滌2次后測定OD600，以空白培養(yǎng)基作為對照，繪制生長曲線，實驗重復(fù)3次取平均值。
1.3.4 細(xì)胞形態(tài)觀察
菌體在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，雙蒸水洗滌菌體2次，立即涂布于導(dǎo)電膠，真空噴金，臺式掃描電鏡觀察。
1.3.5 產(chǎn)氣性能測定
杜氏產(chǎn)氣：每5 mL高糖培養(yǎng)基中接入1 mL種子液，30 ℃，間隔12 h觀察杜氏小管中產(chǎn)氣量。分為0～5等級：0級，管內(nèi)無氣體；1級至5級分別為管內(nèi)1/8、1/4、1/2、3/4及滿氣。結(jié)果取3次實驗平均值。
實際產(chǎn)氣實驗：采用量筒法進(jìn)行實際產(chǎn)氣實驗[13]，含糖面團(tuán)[14]于30 ℃條件下間隔30 min記錄體積，結(jié)果取3次實驗平均值。
1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法
2 結(jié)果與分析
2.1 胞內(nèi)物質(zhì)含量
各菌株胞內(nèi)海藻糖含量如圖1所示，40%糖脅迫環(huán)境下，B+MAL62胞內(nèi)海藻糖含量為51.15 mg/g，比BY14a高出64.27%(P<0.05)；當(dāng)糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由50%升至60%時，B+MAL62的胞內(nèi)海藻糖則可分別比BY14a提高55.03%與59.06%(P<0.05)。但與市售高糖菌株相比，B+MAL62的優(yōu)勢則不明顯，當(dāng)脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由40%提至60%時，B+MAL62的胞內(nèi)海藻糖僅僅比市售高糖酵母的平均值高出12.26%、12.44%和12.74%。因此，盡管高表達(dá)MAL62基因能夠明顯提升出發(fā)菌株的胞內(nèi)海藻糖含量，但僅能夠達(dá)到與市售高糖酵母相近的水平。
圖1 高糖環(huán)境下各菌株的胞內(nèi)海藻糖含量Fig.1 Contents of intracellular trehalose of the four strains under high sugar stress
各菌株胞內(nèi)甘油含量如圖2所示，當(dāng)脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%時，B+MAL62的胞內(nèi)甘油含量為17.41 μg/mg，為BY14a時的2.30倍；當(dāng)糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升至50%與60%時，則分別為2.20與2.24倍(P<0.01)。與市售高糖菌株相比，B+MAL62的胞內(nèi)甘油水平亦具有優(yōu)勢。當(dāng)糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由40%升至60%時，B+MAL62的胞內(nèi)甘油可以比市售高糖酵母的平均值高出27.10%、29.90%和28.45%(P<0.05)。因此，高表達(dá)MAL62基因能夠明顯提升出發(fā)菌株的胞內(nèi)甘油含量，并使其高于市售高糖酵母的平均水平。
通過實驗發(fā)現(xiàn)，隨著糖濃度升高，各菌株胞內(nèi)海藻糖及甘油的含量均呈現(xiàn)升高趨勢。其中B+MAL62菌株隨著滲透壓升高，胞內(nèi)甘油提升速率較大，達(dá)到26.04%，其胞內(nèi)海藻糖含量的提升速率也可達(dá)到11.11%。有報道稱，海藻糖合成基因TPS1、TPS2以及甘油合成關(guān)鍵基因GDP1的啟動子上均帶有STREs序列[15-16]，在許多脅迫基因的啟動子上，Msn2p、Msn4p與STREs綁定[17]，且Msn2p、Msn4p是Hog1實現(xiàn)高滲透壓脅迫下控制基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄激活因子[18]。因此，由實驗結(jié)果進(jìn)行推測，MAL62基因的高表達(dá)可能通過影響Hog1、Msn2、Msn4通路，激活了TPS1、TPS2以及GDP1共同的STRE壓力響應(yīng)元件；同時，MAL62基因高表達(dá)引發(fā)了麥芽糖酶水平提高[19]，很可能導(dǎo)致胞內(nèi)葡萄糖等底物水平提高，致使海藻糖和甘油合成前體水平提高[20]，由此提升了菌株胞內(nèi)海藻糖及甘油的含量。后期將進(jìn)一步使用多組學(xué)方法分析并協(xié)通相關(guān)發(fā)酵實驗驗證上述內(nèi)容，相關(guān)實驗正在進(jìn)行中。
圖2 高糖環(huán)境下各菌株的胞內(nèi)甘油含量Fig.2 Contents of intracellular glycerol of the four strains under high sugar stress
2.2 菌株生長性能的比較
由圖3可知，當(dāng)脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%時，B+MAL62菌株的停滯期為6 h，是BY14a的一半，與市售高糖菌株GSJ及GML的平均停滯期相近。當(dāng)脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時，B+MAL62比對照BY14a停滯期減少50%，與市售高糖GML相近。總的來看，隨著糖濃度的增加，各菌株的延滯期也隨之增長，發(fā)酵至55 h后，所有菌株的OD600值均無明顯續(xù)增，甚至還會出現(xiàn)下降。這也許是因為高滲環(huán)境會造成細(xì)胞嚴(yán)重脫水進(jìn)而使細(xì)胞失活[21]，或者由于在高糖脅迫下, 酵母細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生過量的活性氧和活性氮等有害物質(zhì), 促使線粒體產(chǎn)生超氧化物并激活一氧化氮合酶, 形成過氧亞硝基, 致使機體進(jìn)一步被氧化而受損傷，甚至凋亡[22]。在高滲環(huán)境下，酵母會通過合成甘油與海藻糖平衡胞內(nèi)滲透壓以防止細(xì)胞脫水[23-25]。實驗發(fā)現(xiàn)B+MAL62的胞內(nèi)甘油與海藻糖快速增加，說明B+MAL62菌株可以獲得更多的胞內(nèi)保護(hù)物質(zhì)，這可以解釋為何B+MAL62菌株能夠在高糖環(huán)境下比對照菌更早進(jìn)入對數(shù)期。
圖3 高糖環(huán)境下各菌株的生長曲線Fig.3 Growth curve of the four strains under high sugar stress
2.3 菌株細(xì)胞形態(tài)觀察
由圖4-a和圖4-d可知， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%糖脅迫時，市售高糖酵母GSJ與GML的細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的凹陷(箭頭處)，BY14a菌株(圖4-g)細(xì)胞表面出現(xiàn)部分褶皺，B+MAL62菌株(圖4-j)細(xì)胞呈橢球形，表面光滑，均勻，個體獨立。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%糖脅迫時，GSJ和GML(圖4-b和4-e)的細(xì)胞表面已經(jīng)出現(xiàn)大量凹陷甚至部分塌陷(箭頭處)，BY14a(圖4-h)也呈現(xiàn)出結(jié)構(gòu)塌陷(箭頭處)，B+MAL62(圖4-k)失去平滑的外觀，出現(xiàn)凹凸不平(箭頭處)。
a-GSJ 40%;b-GSJ 50%;c-GSJ 60%;d-GML 40%;e-GML 50%; f-GML 60%;g-BY14a 40%;h-BY14a 50%;i-BY14a 60%; j-B+MAL62 40%;k-B+MAL62 50%;l-B+MAL62 60%圖4 高糖環(huán)境下各菌株的細(xì)胞形貌Fig.4 Cell morphology of the four strains under high sugar stress
隨著脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至60%， GSJ和GML(圖4-c與4-f)的菌體嚴(yán)重坍塌，細(xì)胞壁破損，出現(xiàn)破碎組織；BY14a(圖4-i)的菌體也呈現(xiàn)塌陷與空洞(箭頭處)，B+MAL62(圖4-l)則皺縮嚴(yán)重，出現(xiàn)細(xì)胞黏連及部分塌陷(箭頭處)。據(jù)報道，高滲環(huán)境會影響面包酵母的糖酵解，糖異生、脂肪酸合成、細(xì)胞膜內(nèi)的酶活性，這些代謝反應(yīng)變化與面包酵母形態(tài)的改變有關(guān)[26]。此外，高滲環(huán)境下HOG途徑所涉及的壓力響應(yīng)途徑與細(xì)胞壁完整性途徑存在協(xié)作關(guān)系，細(xì)胞壁損傷會同時激活上述2個途徑，使之一同調(diào)控酵母細(xì)胞壁有關(guān)葡聚糖形成的基因轉(zhuǎn)錄[27]。由于B+MAL62菌株胞內(nèi)甘油含量提升，因此我們推測也許MAL62基因高表達(dá)會通過上述途徑增強細(xì)胞壁的穩(wěn)定性，進(jìn)而減少高糖環(huán)境下B+MAL62菌株的破碎死亡率。
2.4 菌株產(chǎn)氣性能比較
由圖5可見， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%與50%糖脅迫時，GSJ與GML菌株直至發(fā)酵18 h時杜氏產(chǎn)氣等級仍大多處于2級(50%糖的GML菌株除外)；相比之下，B+MAL62菌株在糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%與50%時發(fā)酵12 h即可達(dá)到杜氏產(chǎn)氣3級，說明40%～50%糖環(huán)境下B+MAL62菌株的起始產(chǎn)氣能力大于GSJ、GML以及BY14a菌株。但是，當(dāng)糖脅迫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升至60%時，B+MAL62菌株的快速產(chǎn)氣能力受到抑制，各階段產(chǎn)氣量與GSJ與GML菌株近似，失去了產(chǎn)氣速度的優(yōu)勢。
圖5 高糖環(huán)境下各菌株的杜氏小管產(chǎn)氣Fig.5 Gas production of the four strains in Durham’s fermentation tube under high sugar stress
為了進(jìn)一步對比各菌株的實際產(chǎn)氣能力，采用量筒法檢測了4種酵母在實際含糖面團(tuán)中的發(fā)酵力，結(jié)果如圖6所示。幾個時間點內(nèi)，B+MAL62菌株的產(chǎn)氣量幾乎均為最大，在發(fā)酵末期可達(dá)到84 mL，分別高出GSJ、GML與BY14a 35.48%、6.33%和21.74%。從產(chǎn)氣速度來看，3 h內(nèi) B+MAL62菌株增長了66 mL，可分別高出其他菌株50.00%(GSJ)，4.76%(GML)與34.69%(BY14a)。
圖6 高糖環(huán)境下各菌株的實際面團(tuán)產(chǎn)氣Fig.6 Gas production of the four strains in high sugar dough
有報道認(rèn)為，酵母菌自身的甘油合成能力以及胞內(nèi)海藻糖含量與菌株發(fā)酵力具有明顯的相關(guān)性[25, 28]，此外，實際面團(tuán)發(fā)酵初期，菌體的抗壓反應(yīng)機制會被迅速激活，HOG途徑相關(guān)的基因表達(dá)會劇烈變化[29]，由于HOG途徑與甘油等相關(guān)保護(hù)性物質(zhì)關(guān)系密切，這意味著較高的胞內(nèi)甘油含量可以更好地抵御實際面團(tuán)發(fā)酵初期的各種脅迫，此外，胞內(nèi)甘油還能夠明顯促進(jìn)面團(tuán)的持氣能力[24]。因此，具有較多胞內(nèi)甘油和海藻糖的B+MAL62菌株可以更好地應(yīng)對高糖面團(tuán)發(fā)酵開始階段的低水活壓力，并最終在實際面團(tuán)產(chǎn)氣方面體現(xiàn)出優(yōu)勢。
3 結(jié)論
基于前期研究基礎(chǔ)，本課題針對高表達(dá)麥芽糖酶基因MAL62的耐冷凍突變株B+MAL62進(jìn)行了抗高糖方面的研究。發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%～60%的糖脅迫下，MAL62高表達(dá)能夠?qū)⒔湍赴麅?nèi)海藻糖與甘油的含量分別提升23.42%～30.78%與0.88～0.96倍；并可以在高糖環(huán)境下更好地保持細(xì)胞形態(tài)的穩(wěn)定性。通過對B+MAL62菌株進(jìn)行產(chǎn)氣測試發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下其產(chǎn)氣速度及最終產(chǎn)氣量均優(yōu)于出發(fā)菌株，甚至優(yōu)于市售高糖酵母。本研究為進(jìn)一步探究酵母的多抗性提供了重要技術(shù)參考。
孫溪，劉海晴，張軍，范志華，黃亮
1(天津農(nóng)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，天津, 300384)2(天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津, 300384) 3(天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津, 300384)
面包工業(yè)中常常使用含糖面團(tuán)來制作甜面包，但高濃度的糖分會引發(fā)高滲脅迫，導(dǎo)致胞內(nèi)水分外遷，擾亂并破壞細(xì)胞質(zhì)膜上的離子梯度和細(xì)胞抵御能力，并最終使細(xì)胞破裂死亡[1]。為應(yīng)對此種情況，酵母細(xì)胞通常會富集甘油、海藻糖、氨基酸等物質(zhì)來抵御高滲脅迫引起的細(xì)胞損傷，提高菌株抗性[2]。
酵母菌能夠利用麥芽糖與MAL基因座(MAL1～4和MAL6)有關(guān)，每個MAL基因座均包含編碼麥芽糖運輸?shù)鞍椎腗ALx1(又名MALxT)，x代表基因座位置，編碼麥芽糖酶的MALx2(又名MALxS)，以及編碼正調(diào)節(jié)蛋白的MALx3(又名MALxR)，其中麥芽糖酶是麥芽糖水解的關(guān)鍵酶[3]。在之前的試驗中發(fā)現(xiàn)，工業(yè)酵母BY14a中高表達(dá)麥芽糖酶編碼基因MAL62，會提高突變株B+MAL62的胞內(nèi)海藻糖含量，增強突變株耐冷凍能力[4]。海藻糖是一種非還原性的葡二聚糖，隨著外界生存壓力的增強，其在胞內(nèi)的含量會隨之上升[5]。BELL等[6]發(fā)現(xiàn)，酵母在面臨滲透壓脅迫時，野生菌株比無法合成海藻糖的突變株(TPS1Δ、TPS2Δ)生存率更高。STAMBUK等[7]和JULES等[8]等研究發(fā)現(xiàn)，酵母從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運海藻糖時，菌株自身的麥芽糖代謝狀態(tài)會對這個過程有所影響，只有組成型表達(dá)的MAL基因座才能夠開啟Agt1p的海藻糖轉(zhuǎn)運功能。
目前有關(guān)菌體耐脅迫受麥芽糖代謝調(diào)控的相關(guān)研究僅集中在完整的MAL基因座上，針對單獨的麥芽糖酶與胞內(nèi)海藻糖含量以及酵母耐高滲能力之間的聯(lián)系并無報道。由于海藻糖具有保護(hù)胞內(nèi)可溶性酶和細(xì)胞膜穩(wěn)定性的功能[9]，因此，猜測MAL62基因的高表達(dá)可能會使突變株在耐冷凍以外獲得一定程度的耐高滲能力。鑒于此，本課題計劃探究麥芽糖酶編碼基因MAL62高表達(dá)對菌株的生長特性、形態(tài)特征、胞內(nèi)應(yīng)激物質(zhì)積累及產(chǎn)氣在不同糖濃度環(huán)境下所帶來的影響，并與市售高糖酵母進(jìn)行對比，初步探索相關(guān)現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因，為挖掘面包酵母麥芽糖酶多抗性奠定良好基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 菌種及培養(yǎng)基
釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY14a，天津科技大學(xué)張翠英教授惠贈；突變株B+MAL62及市售高糖活性干酵母GSJ與GML，保存于天津農(nóng)學(xué)院發(fā)酵與釀造食品實驗室。
酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YEPD)培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，固體YEPD添加瓊脂2%。LSMLD培養(yǎng)基：液體模擬面團(tuán)培養(yǎng)基,其配方參考文獻(xiàn)[10]。高糖培養(yǎng)基：在LSMLD培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，將葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)替換為40%、50%與60%。培養(yǎng)基均需121 ℃滅菌20 min。
1.2 主要試劑與設(shè)備
葡萄糖、酵母浸粉和瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蛋白胨，天津市英博生化試劑有限公司；海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品(分析純99%)，Sigma公司；丙三醇(分析純)，天津試劑廠；甘油檢測試劑盒，Megazyme公司；高筋小麥粉，五得利金富強；其他未注明試劑均為分析純，國藥化學(xué)試劑公司。
恒溫培養(yǎng)箱(DHP-420BS)，天津市中環(huán)電爐有限公司；立式搖床(HNY-2102C)，天津歐諾儀器股份有限公司；移液器(Research plus)，Effendorf公司；高速冷凍離心機(gL20A)，中科院生物物理所技術(shù)服務(wù)公司；離子濺射儀(SD-3000)，北京博遠(yuǎn)微納科技有限公司；臺式掃描電子顯微鏡(Phenom pro)，荷蘭飛納公司。
1.3 實驗方法
1.3.1 菌種培養(yǎng)條件
挑取1環(huán)菌泥接入5 mL YEPD培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩24 h，以1%接種量轉(zhuǎn)入高糖LSMLD培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)相應(yīng)時間。
1.3.2 海藻糖與甘油檢測方法
取適量菌體，雙蒸水洗滌2次。胞內(nèi)海藻糖測定采用硫酸蒽酮法[11]，甘油含量的測定采用Megazyme甘油檢測試劑盒[12]，實驗重復(fù)3次取平均值。
李離說：“昔年須菩提大師找孫悟空，弘忍大師找惠能，都是這么干的啊，米熟久矣，猶欠篩哉，提醒我們幾個，三更天等您回來?。∫俏覀儧]有認(rèn)出您的花間游跟翡翠鐲子，聽吳耕的話，也騎驢子走了，您這半個月做掌柜的工夫豈不是白瞎了？”
1.3.3 生長性能測定
菌體在高糖培養(yǎng)基中30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)64 h，每隔2 h取樣，雙蒸水洗滌2次后測定OD600，以空白培養(yǎng)基作為對照，繪制生長曲線，實驗重復(fù)3次取平均值。
1.3.4 細(xì)胞形態(tài)觀察
菌體在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，雙蒸水洗滌菌體2次，立即涂布于導(dǎo)電膠，真空噴金，臺式掃描電鏡觀察。
1.3.5 產(chǎn)氣性能測定
杜氏產(chǎn)氣：每5 mL高糖培養(yǎng)基中接入1 mL種子液，30 ℃，間隔12 h觀察杜氏小管中產(chǎn)氣量。分為0～5等級：0級，管內(nèi)無氣體；1級至5級分別為管內(nèi)1/8、1/4、1/2、3/4及滿氣。結(jié)果取3次實驗平均值。
實際產(chǎn)氣實驗：采用量筒法進(jìn)行實際產(chǎn)氣實驗[13]，含糖面團(tuán)[14]于30 ℃條件下間隔30 min記錄體積，結(jié)果取3次實驗平均值。
1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法
2 結(jié)果與分析
2.1 胞內(nèi)物質(zhì)含量
各菌株胞內(nèi)海藻糖含量如圖1所示，40%糖脅迫環(huán)境下，B+MAL62胞內(nèi)海藻糖含量為51.15 mg/g，比BY14a高出64.27%(P<0.05)；當(dāng)糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由50%升至60%時，B+MAL62的胞內(nèi)海藻糖則可分別比BY14a提高55.03%與59.06%(P<0.05)。但與市售高糖菌株相比，B+MAL62的優(yōu)勢則不明顯，當(dāng)脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由40%提至60%時，B+MAL62的胞內(nèi)海藻糖僅僅比市售高糖酵母的平均值高出12.26%、12.44%和12.74%。因此，盡管高表達(dá)MAL62基因能夠明顯提升出發(fā)菌株的胞內(nèi)海藻糖含量，但僅能夠達(dá)到與市售高糖酵母相近的水平。
圖1 高糖環(huán)境下各菌株的胞內(nèi)海藻糖含量Fig.1 Contents of intracellular trehalose of the four strains under high sugar stress
各菌株胞內(nèi)甘油含量如圖2所示，當(dāng)脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%時，B+MAL62的胞內(nèi)甘油含量為17.41 μg/mg，為BY14a時的2.30倍；當(dāng)糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升至50%與60%時，則分別為2.20與2.24倍(P<0.01)。與市售高糖菌株相比，B+MAL62的胞內(nèi)甘油水平亦具有優(yōu)勢。當(dāng)糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由40%升至60%時，B+MAL62的胞內(nèi)甘油可以比市售高糖酵母的平均值高出27.10%、29.90%和28.45%(P<0.05)。因此，高表達(dá)MAL62基因能夠明顯提升出發(fā)菌株的胞內(nèi)甘油含量，并使其高于市售高糖酵母的平均水平。
通過實驗發(fā)現(xiàn)，隨著糖濃度升高，各菌株胞內(nèi)海藻糖及甘油的含量均呈現(xiàn)升高趨勢。其中B+MAL62菌株隨著滲透壓升高，胞內(nèi)甘油提升速率較大，達(dá)到26.04%，其胞內(nèi)海藻糖含量的提升速率也可達(dá)到11.11%。有報道稱，海藻糖合成基因TPS1、TPS2以及甘油合成關(guān)鍵基因GDP1的啟動子上均帶有STREs序列[15-16]，在許多脅迫基因的啟動子上，Msn2p、Msn4p與STREs綁定[17]，且Msn2p、Msn4p是Hog1實現(xiàn)高滲透壓脅迫下控制基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄激活因子[18]。因此，由實驗結(jié)果進(jìn)行推測，MAL62基因的高表達(dá)可能通過影響Hog1、Msn2、Msn4通路，激活了TPS1、TPS2以及GDP1共同的STRE壓力響應(yīng)元件；同時，MAL62基因高表達(dá)引發(fā)了麥芽糖酶水平提高[19]，很可能導(dǎo)致胞內(nèi)葡萄糖等底物水平提高，致使海藻糖和甘油合成前體水平提高[20]，由此提升了菌株胞內(nèi)海藻糖及甘油的含量。后期將進(jìn)一步使用多組學(xué)方法分析并協(xié)通相關(guān)發(fā)酵實驗驗證上述內(nèi)容，相關(guān)實驗正在進(jìn)行中。
圖2 高糖環(huán)境下各菌株的胞內(nèi)甘油含量Fig.2 Contents of intracellular glycerol of the four strains under high sugar stress
2.2 菌株生長性能的比較
由圖3可知，當(dāng)脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%時，B+MAL62菌株的停滯期為6 h，是BY14a的一半，與市售高糖菌株GSJ及GML的平均停滯期相近。當(dāng)脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%時，B+MAL62比對照BY14a停滯期減少50%，與市售高糖GML相近。總的來看，隨著糖濃度的增加，各菌株的延滯期也隨之增長，發(fā)酵至55 h后，所有菌株的OD600值均無明顯續(xù)增，甚至還會出現(xiàn)下降。這也許是因為高滲環(huán)境會造成細(xì)胞嚴(yán)重脫水進(jìn)而使細(xì)胞失活[21]，或者由于在高糖脅迫下, 酵母細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生過量的活性氧和活性氮等有害物質(zhì), 促使線粒體產(chǎn)生超氧化物并激活一氧化氮合酶, 形成過氧亞硝基, 致使機體進(jìn)一步被氧化而受損傷，甚至凋亡[22]。在高滲環(huán)境下，酵母會通過合成甘油與海藻糖平衡胞內(nèi)滲透壓以防止細(xì)胞脫水[23-25]。實驗發(fā)現(xiàn)B+MAL62的胞內(nèi)甘油與海藻糖快速增加，說明B+MAL62菌株可以獲得更多的胞內(nèi)保護(hù)物質(zhì)，這可以解釋為何B+MAL62菌株能夠在高糖環(huán)境下比對照菌更早進(jìn)入對數(shù)期。
圖3 高糖環(huán)境下各菌株的生長曲線Fig.3 Growth curve of the four strains under high sugar stress
2.3 菌株細(xì)胞形態(tài)觀察
由圖4-a和圖4-d可知， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%糖脅迫時，市售高糖酵母GSJ與GML的細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的凹陷(箭頭處)，BY14a菌株(圖4-g)細(xì)胞表面出現(xiàn)部分褶皺，B+MAL62菌株(圖4-j)細(xì)胞呈橢球形，表面光滑，均勻，個體獨立。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%糖脅迫時，GSJ和GML(圖4-b和4-e)的細(xì)胞表面已經(jīng)出現(xiàn)大量凹陷甚至部分塌陷(箭頭處)，BY14a(圖4-h)也呈現(xiàn)出結(jié)構(gòu)塌陷(箭頭處)，B+MAL62(圖4-k)失去平滑的外觀，出現(xiàn)凹凸不平(箭頭處)。
a-GSJ 40%;b-GSJ 50%;c-GSJ 60%;d-GML 40%;e-GML 50%; f-GML 60%;g-BY14a 40%;h-BY14a 50%;i-BY14a 60%; j-B+MAL62 40%;k-B+MAL62 50%;l-B+MAL62 60%圖4 高糖環(huán)境下各菌株的細(xì)胞形貌Fig.4 Cell morphology of the four strains under high sugar stress
隨著脅迫糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至60%， GSJ和GML(圖4-c與4-f)的菌體嚴(yán)重坍塌，細(xì)胞壁破損，出現(xiàn)破碎組織；BY14a(圖4-i)的菌體也呈現(xiàn)塌陷與空洞(箭頭處)，B+MAL62(圖4-l)則皺縮嚴(yán)重，出現(xiàn)細(xì)胞黏連及部分塌陷(箭頭處)。據(jù)報道，高滲環(huán)境會影響面包酵母的糖酵解，糖異生、脂肪酸合成、細(xì)胞膜內(nèi)的酶活性，這些代謝反應(yīng)變化與面包酵母形態(tài)的改變有關(guān)[26]。此外，高滲環(huán)境下HOG途徑所涉及的壓力響應(yīng)途徑與細(xì)胞壁完整性途徑存在協(xié)作關(guān)系，細(xì)胞壁損傷會同時激活上述2個途徑，使之一同調(diào)控酵母細(xì)胞壁有關(guān)葡聚糖形成的基因轉(zhuǎn)錄[27]。由于B+MAL62菌株胞內(nèi)甘油含量提升，因此我們推測也許MAL62基因高表達(dá)會通過上述途徑增強細(xì)胞壁的穩(wěn)定性，進(jìn)而減少高糖環(huán)境下B+MAL62菌株的破碎死亡率。
2.4 菌株產(chǎn)氣性能比較
由圖5可見， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%與50%糖脅迫時，GSJ與GML菌株直至發(fā)酵18 h時杜氏產(chǎn)氣等級仍大多處于2級(50%糖的GML菌株除外)；相比之下，B+MAL62菌株在糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%與50%時發(fā)酵12 h即可達(dá)到杜氏產(chǎn)氣3級，說明40%～50%糖環(huán)境下B+MAL62菌株的起始產(chǎn)氣能力大于GSJ、GML以及BY14a菌株。但是，當(dāng)糖脅迫的質(zhì)量分?jǐn)?shù)升至60%時，B+MAL62菌株的快速產(chǎn)氣能力受到抑制，各階段產(chǎn)氣量與GSJ與GML菌株近似，失去了產(chǎn)氣速度的優(yōu)勢。
圖5 高糖環(huán)境下各菌株的杜氏小管產(chǎn)氣Fig.5 Gas production of the four strains in Durham’s fermentation tube under high sugar stress
為了進(jìn)一步對比各菌株的實際產(chǎn)氣能力，采用量筒法檢測了4種酵母在實際含糖面團(tuán)中的發(fā)酵力，結(jié)果如圖6所示。幾個時間點內(nèi)，B+MAL62菌株的產(chǎn)氣量幾乎均為最大，在發(fā)酵末期可達(dá)到84 mL，分別高出GSJ、GML與BY14a 35.48%、6.33%和21.74%。從產(chǎn)氣速度來看，3 h內(nèi) B+MAL62菌株增長了66 mL，可分別高出其他菌株50.00%(GSJ)，4.76%(GML)與34.69%(BY14a)。
圖6 高糖環(huán)境下各菌株的實際面團(tuán)產(chǎn)氣Fig.6 Gas production of the four strains in high sugar dough
有報道認(rèn)為，酵母菌自身的甘油合成能力以及胞內(nèi)海藻糖含量與菌株發(fā)酵力具有明顯的相關(guān)性[25, 28]，此外，實際面團(tuán)發(fā)酵初期，菌體的抗壓反應(yīng)機制會被迅速激活，HOG途徑相關(guān)的基因表達(dá)會劇烈變化[29]，由于HOG途徑與甘油等相關(guān)保護(hù)性物質(zhì)關(guān)系密切，這意味著較高的胞內(nèi)甘油含量可以更好地抵御實際面團(tuán)發(fā)酵初期的各種脅迫，此外，胞內(nèi)甘油還能夠明顯促進(jìn)面團(tuán)的持氣能力[24]。因此，具有較多胞內(nèi)甘油和海藻糖的B+MAL62菌株可以更好地應(yīng)對高糖面團(tuán)發(fā)酵開始階段的低水活壓力，并最終在實際面團(tuán)產(chǎn)氣方面體現(xiàn)出優(yōu)勢。
3 結(jié)論
基于前期研究基礎(chǔ)，本課題針對高表達(dá)麥芽糖酶基因MAL62的耐冷凍突變株B+MAL62進(jìn)行了抗高糖方面的研究。發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%～60%的糖脅迫下，MAL62高表達(dá)能夠?qū)⒔湍赴麅?nèi)海藻糖與甘油的含量分別提升23.42%～30.78%與0.88～0.96倍；并可以在高糖環(huán)境下更好地保持細(xì)胞形態(tài)的穩(wěn)定性。通過對B+MAL62菌株進(jìn)行產(chǎn)氣測試發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下其產(chǎn)氣速度及最終產(chǎn)氣量均優(yōu)于出發(fā)菌株，甚至優(yōu)于市售高糖酵母。本研究為進(jìn)一步探究酵母的多抗性提供了重要技術(shù)參考。
