蘆 婷，史 丹，張 榮，陳曉紅，張 前，焦元紅

(湖北理工學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 黃石435003)

0 引言

人血清白蛋白是血漿中最豐富的一種載體蛋白，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)結(jié)構(gòu)構(gòu)造幾乎與人血清白蛋白一樣。因其價廉易得，科學(xué)工作者常常用牛血清白蛋白替代人血清白蛋白研究與藥物小分子的相互作用，為藥物的篩選積累了一定的理論數(shù)據(jù)[1]。在生理條件下，牛血清白蛋白含有 583 個氨基酸，分子量為66 000 左右，因存在特殊氨基酸如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)而具有熒光。

苯并咪唑衍生物具有多種生物學(xué)和藥理活性[2]。本文通過實驗合成一種小分子苯并咪唑衍生物藥物MAB，研究其與牛血清白蛋白的相互作用，并通過多種手段從分子水平上討論其與蛋白之間的作用位點、作用機(jī)理和作用力，分析藥物在生物體的運送、分布及作用機(jī)制，旨在為臨床合理用藥提供重要參考依據(jù)。

1 實驗與方法

1.1 儀器及試劑

實驗用儀器包括：Vario ELⅢ型元素分析儀(德國Ele-mentar公司)；721S722SP723S紫外可見光光譜儀(上海棱光技術(shù)有限公司)；RF-5301PC型分光熒光計(日本Shimadzu 公司)；400型400 MHz核磁共振儀(Varian Mercury 公司，TMS為內(nèi)標(biāo))；Trace EMS 2000質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan)。

將BSA(上海遠(yuǎn)聚生物科技有限公司)溶解在0.1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液中，制得濃度為1.0×10-5mol/L的BSA。將MAB溶于二甲基亞砜(DMSO)中，用Tris-HCl緩沖溶液稀釋至1.0×10-4mol/L，儲存在2～5 ℃冰箱中。實驗用水為雙蒸水。

1.2 化合物的合成及表征

MAB合成反應(yīng)式[3]見式(1)。取5.4 g鄰苯二胺和6.5 g 4-甲酸吡啶放入燒瓶中，加入20 mL磷酸和多聚磷酸的混合物，于170 ℃下回流2～4 h后冷卻至室溫。用濃氨水調(diào)節(jié)其pH=7，有沉淀析出，過濾，用乙醇重結(jié)晶，得到目標(biāo)化合物MAB(分子式為C12H9N3)白色粉末，收率為60%。m.p.223～225 ℃；MS:m/z 195.2,calcd 194.88；1H NMR (300 MHz,DMSO-d6,δppm) δ:7.240～7.612 (m,4H,Ar-H),8.250(d,2H,J=7.4 Hz, Py-H),8.813(d,2H,J=7.4 Hz,Py-H),12.561(s,1H,-NH)。

C，H，N含量用元素分析儀測定，實驗值(%)為：C:74.07;H:4.60;N:21.33。理論計算值(%)為：C:73.85;H:4.61;N:21.54。

(1)

1.3 實驗方法

1.3.1溶液配制

配制pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液和濃度為1×10-5mol/L的BSA溶液。稱取0.033 1 g BSA，溶解在Tris-HCl緩沖溶液中，稀釋定容至50 mL。配制濃度為1×10-2mol/L的MAB溶液。所有溶液均放置在4 ℃冰箱中24 h。

1.3.2熒光光譜

分別測定不同溫度下MAB與BSA體系的熒光發(fā)射譜，選擇激發(fā)波長為295 nm，測量波長范圍為300～450 nm，測量溫度分別為298 K，303 K，308 K。在比色皿中加入1×10-5mol/L的牛血清白蛋白(BSA)，每次加入BSA的體積為1 μL。繪制研究體系的熒光光譜。

1.3.3同步熒光光譜

固定牛血清白蛋白(BSA)的濃度為1×10-5mol/L，逐漸增加MAB的濃度。分別設(shè)置Δλ=15 nm與Δλ=60 nm，測量波長范圍分別為260～325 nm與240～320 nm，繪制牛血清白蛋白(BSA)同步熒光光譜，討論MAB對酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基的影響。

1.3.4紫外可見吸收光譜

測定MAB加入前和加入后的牛血清白蛋白(BSA)的紫外可見吸收光譜，以及MAB的吸收光譜，通過紫外差譜得到相互作用機(jī)制。兩者濃度均為1×10-5mol/L。

2 實驗結(jié)果討論

2.1 MAB與BSA的相互作用及機(jī)理

2.1.1熒光光譜分析

在λex=295 nm的條件下，將不同濃度的MAB滴定到固定濃度為1×10-5mol/L的BSA中，得到MAB對BSA的熒光猝滅如圖1所示。由圖1可以看出，BSA的熒光強(qiáng)度隨著MAB濃度增加而有規(guī)律地下降，說明MAB在不改變節(jié)點環(huán)境的情況下能猝滅BSA的固有熒光強(qiáng)度。

圖1 MAB對BSA的熒光猝滅

猝滅分靜態(tài)和動態(tài)猝滅2種。靜態(tài)猝滅是指形成熒光物質(zhì)-猝滅劑復(fù)合物，使熒光團(tuán)熒光猝滅； 動態(tài)猝滅是指在激發(fā)態(tài)期間猝滅劑與熒光物質(zhì)發(fā)生碰撞使其返回基態(tài)而不發(fā)射光子。

根據(jù)Stern-Volmer方程討論猝滅機(jī)理：

(2)

式(2)中，F(xiàn)0為不存在猝滅劑時的穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度；F為存在猝滅劑時的穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度；kq，KSV為熒光分子的猝滅速率常數(shù)；τ0為熒光分子平均壽命，不含猝滅劑的熒光分子的平均壽命[4]τ0= 10-8s；[Q]為猝滅劑的濃度。對于動態(tài)猝滅，各種猝滅劑與熒光分子最大碰撞猝滅常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s)，如果kq遠(yuǎn)大于此值，則可以得出熒光猝滅不是由動態(tài)猝滅導(dǎo)致的，可能是由于生成復(fù)合物而導(dǎo)致靜態(tài)猝滅[5]。

為了進(jìn)一步研究猝滅機(jī)理，我們進(jìn)行了熒光變溫滴定實驗。因為溫度變化對靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅的影響是不同的。隨著溫度升高，靜態(tài)猝滅熒光猝滅常數(shù)是減小的，而動態(tài)猝滅則與之相反[6]。不同溫度下MAB使BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線如圖2所示，不同溫度下MAB與BSA作用的猝滅常數(shù)見表1。由圖2和表1可以看出，kq的值大于2.0×1010L/(mol·s)，隨著溫度升高，熒光猝滅常數(shù)是減小的，表明熒光猝滅主要是由生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅機(jī)制控制[7]。

圖2 不同溫度下MAB使BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

表1 不同溫度下MAB與BSA作用的猝滅常數(shù)

為了再次確認(rèn)MAB對BSA的靜態(tài)熒光猝滅機(jī)理，根據(jù)Lineweaver-Burk方程(改進(jìn)的Stern-Volmer雙倒數(shù)方程)再次分析熒光猝滅的數(shù)據(jù)。Lineweaver-Burk方程為：

(3)

式(3)中，F(xiàn)0和F分別為不存在和存在猝滅劑時的熒光強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑的濃度；Ka為蛋白質(zhì)和猝滅劑的結(jié)合常數(shù)；fa為初始熒光的分?jǐn)?shù)[8]。

不同溫度下MAB使BSA熒光淬滅的修正Stern-Volmer曲線如圖3所示。由圖3可以看出，F(xiàn)0/ΔF與1/[Q]呈線性關(guān)系，進(jìn)一步驗證了MAB對 BSA的熒光猝滅機(jī)制主要是靜態(tài)猝滅[9]。

圖3 不同溫度下MAB使BSA熒光猝滅的修正Stern-Volmer曲線

2.1.2紫外吸收光譜分析

UV-vis吸收測量是一種非常簡單的方法，適用于探索結(jié)構(gòu)變化和復(fù)雜化合物的形成[10]。動態(tài)猝滅只影響淬滅分子的激發(fā)態(tài)，對淬滅物質(zhì)的吸收光譜沒有影響。為了進(jìn)一步確認(rèn)靜態(tài)猝滅機(jī)理，測量得到了BSA，MAB和BSA-MAB體系的紫外可見吸收光譜(如圖4所示)。由圖4可以看出，BSA-MAB體系紫外差譜與空白的牛血清白蛋白(BSA)的紫外吸收譜不能重疊，在實驗誤差范圍內(nèi)。這再次驗證了BSA與MAB猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅[11]。

圖4 BSA，MAB和BSA-MAB體系的紫外可見吸收光譜

2.2 MAB和BSA間的相互作用力

小分子化合物與牛血清白蛋白發(fā)生結(jié)合時有4種非共價鍵力作用，即分子間氫鍵、范德華力、靜電、分子疏水作用力，這些作用使化合物與BSA結(jié)合更穩(wěn)定?；瘜W(xué)結(jié)合反應(yīng)過程中相關(guān)數(shù)據(jù)可以根據(jù)Van't Hoff方程計算：

(4)

式(4)中，K為對應(yīng)溫度下的結(jié)合速率常數(shù)；R為普適氣體常數(shù)；ΔH為反應(yīng)焓變，可以根據(jù)lnK對1/T的曲線圖進(jìn)行計算；ΔS為反應(yīng)熵變；T為反應(yīng)溫度。

ΔG為吉布斯自由能，可以根據(jù)式(5)求出：

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

(5)

Leckband和Ross[12]對特殊化學(xué)結(jié)合反應(yīng)過程中相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)值進(jìn)行了研究，如果ΔH和ΔS的值均大于0，則說明化合物與BSA結(jié)合時產(chǎn)生的是疏水作用力；如果ΔH和ΔS的值均小于0，則表明化合物與BSA結(jié)合時產(chǎn)生的是范德華力和氫鍵作用力；而當(dāng)ΔH的值是比較小的正值或負(fù)值，ΔS為正值時，說明化合物與BSA結(jié)合時是以靜電相互作用的[13]。

MAB-BSA體系的Van't Hoff曲線如圖5所示，MAB-BSA體系的熱力學(xué)參數(shù)見表2。

圖5 MAB-BSA體系的Van't Hoff曲線

表2 MAB-BSA體系的熱力學(xué)參數(shù)

由圖5和表2可以看出，ΔG均為負(fù)值，表明反應(yīng)過程都是自發(fā)的。ΔH和ΔS均為正值，表示MAB-BSA復(fù)合物的形成是疏水作用[14]。

2.3 構(gòu)象改變研究

同步熒光光譜可以提供發(fā)射熒光分子附近微環(huán)境的有用信息，最大發(fā)射波長位置的位移對應(yīng)于熒光分子周圍極性的變化。當(dāng)激發(fā)和發(fā)射之間的波長差Δλ=15 nm時，同步熒光光譜產(chǎn)生關(guān)于酪氨酸殘基的特征信息[15-16]；當(dāng)Δλ=60 nm時，同步熒光光譜產(chǎn)生色氨酸殘基的特征信息。BSA和MAB之間相互作用的同步熒光光譜如圖6所示。由圖6可以看出，當(dāng)Δλ=15 nm時，酪氨酸殘基熒光光譜峰發(fā)生藍(lán)移，表明藥物對酪氨酸(Tyr)殘基所處的環(huán)境有一定影響；當(dāng)Δλ=60 nm時，色氨酸殘基熒光光譜峰沒發(fā)生偏移，表明藥物對色氨酸(Trp)殘基沒有影響[17-18]。

(a) Δλ= 15 nm

(b) Δλ= 60 nm

3 結(jié)論

在模擬生理條件下使用熒光光譜法研究了MAB與BSA的相互作用。實驗結(jié)果表明BSA與MAB猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅，MAB可以與BSA分子結(jié)合形成復(fù)合物。熱力學(xué)參數(shù)ΔH和ΔS表明MAB-BSA復(fù)合物主要通過疏水作用穩(wěn)定。此外，同步熒光數(shù)據(jù)顯示，BSA在與MAB結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化，MAB在酪氨酸殘基處與BSA結(jié)合。