李雪麗 許雪珠 蘭建平 林妙春 王興斌 鄭雅男

鱗狀細胞癌（SCCs）為皮膚常見惡性腫瘤之一，好發(fā)于曝光部位，特別是顏面部，有一定損容性，易復(fù)發(fā)，病因不明，可能與長期紫外線照射、電離輻射等有關(guān)。核因子E2相關(guān)因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）與體內(nèi)抗氧化反應(yīng)密切有關(guān)，且對紫外線有防護作用。Keleh樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白 1（Keleh-like associated protein 1，Keap1）通過胞質(zhì)內(nèi)泛素化方式負性調(diào)節(jié)Nrf2的表達。病理狀態(tài)下，如氧化應(yīng)激、親電壓力，Keap1作為一個分子傳感器，通過化學(xué)修飾使Nrf2與之解離[1-2]，Nrf2被釋放并快速轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，與谷胱甘肽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等氧化還原Ⅱ相代謝酶基因相關(guān)抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，ARE）結(jié)合誘導(dǎo)下游基因表達，參與體內(nèi)氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)，降低細胞體內(nèi)外氧化損傷。氧化損傷如不能及時修復(fù)，細胞可能發(fā)生癌變?，F(xiàn)已有大量研究表明Nrf2與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥機制密切相關(guān)[3-5]。然而國內(nèi)外對皮膚癌（包括鱗狀細胞癌）與Nrf2的關(guān)系研究較少，本文通過免疫組化技術(shù)分析Nrf2和Keap1蛋白在正常皮膚組織和皮膚鱗狀細胞癌中陽性表達情況，以期探討Nrf2在皮膚鱗狀細胞中的發(fā)病機制，從而為皮膚癌生物靶向治療提供理論依據(jù)，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

試驗組標(biāo)本來自2013年9月-2015年1月在筆者所在醫(yī)院門診手術(shù)切除人顏面部皮膚鱗狀細胞癌組織，共15例，其中男9例，女6例，年齡56～81歲，平均（67.80±9.14）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：確診鱗狀細胞癌并行手術(shù)治療；既往未接受放化療、免疫學(xué)治療；標(biāo)本留取完整并行病理學(xué)檢查；留取標(biāo)本可進行Nrf2及Keap-1免疫組化檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者病歷資料不完整；伴有其他部位惡性腫瘤；伴有免疫系統(tǒng)疾病。對照組標(biāo)本來自同例患者癌旁組織，并經(jīng)病理學(xué)確診。本試驗于2013年9月-2015年8月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬閩東醫(yī)院中心實驗室完成。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑如下：Nrf2和Keap1一抗[艾博抗（Abcam）（上海）貿(mào)易有限公司]、免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）等；主要儀器有：上海精宏電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9023A型）、武漢俊杰生物組織攤烤片機（JK-5型）、德國Leica石蠟切片機輛（RM2245型）等。

1.3 方法

本研究采用隨機對照試驗設(shè)計。免疫組化試驗：手術(shù)切除人顏面部病理學(xué)確診鱗狀細胞癌蠟塊及癌旁組織蠟塊，連續(xù)切片，厚度為5 μm，組織切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，自來水沖洗；石蠟切片脫蠟和水化后，自來水沖洗。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）水煮20 min進行組織抗原修復(fù)，PBS沖洗3次，3～5 min/次，除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，3 min/次，除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl非免疫山羊血清，室溫下孵育10 min，直接甩去表層殘余血清，每張切片加50 μl的第一抗體，室溫下孵育60 min，PBS沖洗 3次，3～5 min/次，除去 PBS液，每張切片加 50 μl即用 型 MaxVisionTM（KIT-5910 MaxVisionTM HRP-Polymer antirabbit/mouse IHC Kit）試劑，室溫下孵育 15 min，PBS 沖洗 3 次，3 min/次，除去PBS液，每張切片加100 μl新鮮配制的DAB顯色液，作用5 min，顯微鏡下觀察。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明后再中性樹膠封固。

1.4 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

Keap1蛋白主要表達于細胞核和細胞質(zhì)、Nrf2蛋白陽性著色表達于細胞核，兩種蛋白陽性染色呈黃色、棕黃色、褐色表達，陰性表達為淡藍色或深藍色的基礎(chǔ)染色，無黃色、棕黃色、褐色表達。觀察Nrf2和Keap1在鱗狀細胞癌和正常組織中的陽性表達率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 15.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Keap1及Nrf2蛋白陽性表達情況比較

試驗組病例中皮膚鱗狀細胞癌共15例，所有患者術(shù)前檢查均未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移，均經(jīng)手術(shù)治療，術(shù)后出現(xiàn)1例復(fù)發(fā)，其余在隨訪期間均無復(fù)發(fā)。免疫組化結(jié)果提示試驗組Nrf2及Keap1蛋白均有7例為弱陽性，占46.67%，對照組均為陽性；試驗組Keap1及Nrf2蛋白陽性表達率均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表1 兩組Keap1及Nrf2蛋白陽性表達情況比較 例（%）

2.2 Keap1及Nrf2免疫組化結(jié)果分析

免疫組化結(jié)果：Keap1-對照組標(biāo)本可見表皮中陽性表達，真皮中表達陰性（圖1A、B、C）；而試驗組即鱗狀細胞癌標(biāo)本中，低分化標(biāo)本（1例）、中-低分化標(biāo)本（2例）、中分化標(biāo)本（2例）、高-中分化標(biāo)本（3例）表皮、真皮中Keap1表達均為陰性（圖1D、E、F），高分化標(biāo)本（7例）表皮中表達部分為弱陽性，真皮中表達為陰性。Nrf2-對照組中表皮均為陽性表達，真皮表達陰性（圖1G、H、I），而試驗組即鱗狀細胞癌標(biāo)本中，高分化標(biāo)本（7例）表皮中可見少量弱陽性表達，真皮表達陰性，除高分化標(biāo)本以外，表皮、真皮中Nrf2表達均為陰性（圖1J、K、L）。

圖1 鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中Keap1和Nrf2免疫組化表達結(jié)果

3 討論

根據(jù)本研究結(jié)果，筆者認為，與正常皮膚組織相比，Nrf2及Keap1在皮膚鱗狀細胞癌中陽性低表達或無表達，提示其可能與皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)生有關(guān)，且腫瘤的分化程度也對其有一定的影響，高分化、惡性程度較低的腫瘤中可見Nrf2及Keap1弱陽性表達；分化程度低、惡性程度高的腫瘤中未見Nrf2及Keap1表達，說明Nrf2及Keap1表達下調(diào)與腫瘤的分化程度有關(guān)。

皮膚長期暴露于外界刺激（如紫外線、環(huán)境污染、毒素等）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和親電壓力，導(dǎo)致皮膚DNA和蛋白損傷，Nrf2可對抗這些細胞毒性作用，對疾病有化學(xué)保護作用。國內(nèi)外許多研究表明Nrf2對腫瘤有抑制作用。比如說，Nrf2缺失小鼠更易發(fā)生致癌作用[6-7]，Nrf2丟失與癌癥轉(zhuǎn)移增加有關(guān)[8-9]。然而，新近研究表明Nrf2在惡性腫瘤（如胃癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤等）細胞核中高表達并出現(xiàn)基因突變、丟失[10-13]。Nrf2通過上調(diào)ll相解毒酶、抗氧化蛋白等蛋白質(zhì)的表達，從而改變體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)。在正常情況下，Keap1與Nrf2結(jié)合導(dǎo)致Nrf2降解；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Keap1蛋白不能泛素化降解Nrf2，Nrf2積累進入細胞核，與ARE結(jié)合，啟動一系列抗氧化基因和二相解毒酶基因的表達使得DNA、生物大分子免受損傷[14-15]。

當(dāng)細胞受到氧化應(yīng)激及高親電壓力時，Nrf2從細胞質(zhì)解離，可通過Keap1依賴途徑及非Keap1依賴途徑進入細胞核內(nèi)，但本文Keap1核內(nèi)表達陰性，說明Nrf2可能是通過非Keap1依賴途徑進入細胞核內(nèi)。盡管Nrf2在氧化應(yīng)激方面有卓越作用，但亦可通過影響細胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)平衡來參與細胞的增殖和分化，而染色體分析表明參與細胞增殖和分化的基因和氧化應(yīng)激的基因并非完全一致，Nrf2多功能性提示Nrf2是一種誘導(dǎo)型的轉(zhuǎn)錄因子[16]。

本研究免疫組化結(jié)果示Nrf2在皮膚鱗狀細胞癌陽性表達減少或無表達，與Chang等[17]研究結(jié)果一致，與Stacy等[18]研究中頭頸部鱗狀細胞癌中91.5%伴有Nrf2高表達的結(jié)果相反。在本組病例中，分化程度高的鱗狀細胞癌標(biāo)本中見到弱陽性表達的Nrf2及Keap1，而到高-中分化及其他分化程度低的標(biāo)本中均未見陽性表達，考慮可能與皮膚長期紫外線等外界刺激、ROS聚集、親電壓力增加，導(dǎo)致Nrf2化學(xué)保護功能異常，同時影響負性調(diào)節(jié)因子Keap1過度降解Nrf2，導(dǎo)致Nrf2低表達或無表達，使其失去對腫瘤的抑制作用，且腫瘤的分化程度也對其有一定的影響，惡性程度高的腫瘤中未見Nrf2表達，說明Nrf2表達下調(diào)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。但具體機制仍未十分清晰，需要更多研究進一步明確Nrf2及Keap1在皮膚惡性腫瘤中的作用機制。盡管如此，Nrf2及Keap1在腫瘤靶向治療的研究中仍具有廣闊前景。