鄭增光 王鵬雁

惡性黑色素瘤是一種惡性程度極高的皮膚/黏膜惡性腫瘤，常起病隱匿，不易引起重視，確診時(shí)多有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)后放化療不僅毒副作用大，且五年生存率僅16%[1-2]。小檗堿（berberine hydrochloride）是中藥黃連的主要活性成分之一，具有抗菌消炎、抗病毒、降血糖血脂及抗抑郁等廣泛的生物學(xué)作用[3-5]。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明，小檗堿具有較好的抗腫瘤作用[6-7]。本研究以TLR4 為靶點(diǎn)，觀察鹽酸小檗堿對(duì)黑色素瘤A375 細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人黑素瘤A375 細(xì)胞株（上海中科院細(xì)胞庫，批號(hào)SCCP-533）。

1.2 藥 物 鹽酸小檗堿（selleck 生物科技公司，批號(hào)S904601，分子量336.36），青霉素-鏈霉素溶液（美國Gibco 公司，批號(hào)15070063）。

1.3 試劑及儀器 CCK8 試劑盒（日本同仁生物公司，批號(hào)010417170406）；胎牛血清（美國Gibco 公司，批號(hào)10099141）、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號(hào)1801040206）；Transwell 遷移室（德國Greiner 公司，批號(hào)DM-0079）；膜聯(lián)蛋白V/碘化丙錠（Annexin.V/PI）凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司，批號(hào)6301518）；Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司，批號(hào)IK5013）、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（日本Takara 公司，批號(hào)15596026）；抗體TLR4（美國Cell signling 公司，批號(hào)14358）和βactin（美國Cell signling 公司，批號(hào)4970）；HRP 偶聯(lián)的二抗（美國Cell signling 公司，批號(hào)CS1123）；流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；熒光定量PCR 儀（Thermo公司）；GBOXHR 型全自動(dòng)圖像分析儀（基因有限公司）。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列：TLR4-F：5'-CAGAAGCTGGTGGCTGTG -3'；TLR4-R：5'-ATGTAGAACCCGCAAGTC-3'；β-actin-F：5'-AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCA-3'；β-actin-R：5'-GGCGGGCACGTTGAAGGTCT-3'。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A375 細(xì)胞株選為研究對(duì)象，用含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL 青霉素和100μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在5%CO2，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%時(shí)按1∶2～1∶4 的密度傳代，每2～3 天傳代1 次，取其對(duì)數(shù)生長期用于實(shí)驗(yàn)。其中空白對(duì)照組細(xì)胞僅接受10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。而低、中、高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入鹽酸小檗堿，分別調(diào)整藥物濃度為40、80、120μmol/L。

2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 制備細(xì)胞懸液，將計(jì)數(shù)細(xì)胞接種到96 孔板中，待測細(xì)胞調(diào)密度至鋪滿孔底70%左右，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。將96 孔平底板置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入10μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，形成Formazan。使用酶標(biāo)儀在用450nm 波長檢測吸光度（A）值。細(xì)胞存活率（%）=（A 實(shí)驗(yàn)組-A 凋零組）/（A 空白對(duì)照組-A 凋零組）×100%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期A375 細(xì)胞，按以上分組處理24h，用胰酶消化后用預(yù)冷的PBS 洗滌；再用去離子水按1:3 稀釋結(jié)合緩沖液，1X 結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞；取100μL 的細(xì)胞懸液于5mL 流式管中，加入5μL Annexin V/FITC 混勻后于室溫避光孵育5min；然后再加入10μL 20μg/mL 碘化丙錠溶液（PI），并加400μL 的PBS，立刻進(jìn)行流式檢測，記錄各組細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)并分析。

2.4 Transwell 法檢測細(xì)胞遷移能力 將300μL 無血清培養(yǎng)基加入到小室上層，在其下層加入800μL培養(yǎng)基，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置2h，將饑餓處理24h 的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用無血清的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為1×105/mL。去除活化時(shí)所用培養(yǎng)基，分別在小室下層加入800μL 10% FBS 的培養(yǎng)液，而小室的上層則加入300μL 細(xì)胞懸液。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24h后，使用4%甲醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定20min，然后進(jìn)行結(jié)晶紫染色。顯微鏡下拍照（40×），隨機(jī)選取3～5 個(gè)以上視野計(jì)數(shù)。

2.5 RT-PCR 檢測A375 TLR4 mRNA 表達(dá)水平取A375 細(xì)胞接種于6cm 的培養(yǎng)皿中，給予鹽酸小檗堿干預(yù)24h 后，按照RNA 試劑盒說明書操作，提取RNA。檢測其完整性，并將其置于-80℃低溫冰箱保存，用于下一步逆轉(zhuǎn)錄。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，取5μL PCR 產(chǎn)物和5μL PCR marker 進(jìn)行瓊脂糖電泳。電泳結(jié)束后，采用GBOXHR型全自動(dòng)圖像分析儀對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

2.6 Western blot 檢測A375 TLR4 蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)期生長的A375 細(xì)胞培養(yǎng)24h，加入相應(yīng)濃度鹽酸小檗堿，繼續(xù)培養(yǎng)48h，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，然后離心，吸取上清。用二喹啉甲酸（BCA）法檢測細(xì)胞蛋白濃度。在十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠上每組取20μg 蛋白上樣，200V 恒壓電泳至溴酚藍(lán)遷移至分離膠下緣時(shí)，時(shí)間大約為40min，關(guān)掉電源，停止電泳。然后經(jīng)過轉(zhuǎn)膜/封閉，再依此加入TLR4 一抗，孵育過夜，洗膜，使用二抗孵育2h（Abeam 公司），化學(xué)光敏模式曝光顯影。照片以TIFF 格式導(dǎo)出后在Image J軟件下分析各條帶光密度，計(jì)算TLR4 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)A375 細(xì)胞存活率、凋亡率及細(xì)胞遷移力的影響（）

表1 不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)A375 細(xì)胞存活率、凋亡率及細(xì)胞遷移力的影響（）

注：空白對(duì)照組給予鹽酸小檗堿0μmol/L；低劑量組給予鹽酸小檗堿40μmol/L；中劑量組給予鹽酸小檗堿80μmol/L；高劑量組給予鹽酸小檗堿120μmol/L；與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 鹽酸小檗堿對(duì)A375 細(xì)胞增殖存活率的影響各組細(xì)胞培養(yǎng)24h 后，空白對(duì)照組與鹽酸小檗堿低、中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=298.778，P<0.01）；細(xì)胞存活率隨鹽酸小檗堿濃度的增加而降低，低劑量組存活率顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），中劑量組顯著低于空白對(duì)照組及低劑量組（P 均<0.05），高劑量組顯著低于空白對(duì)照組、低、中劑量組（P 均<0.05），見表1。

3.2 鹽酸小檗堿對(duì)A375 細(xì)胞凋亡率的影響 AnnexinV/PI 雙染法結(jié)果顯示，空白對(duì)照組A375 細(xì)胞凋亡率與鹽酸小檗堿低、中、高劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=101.764，P<0.01）；細(xì)胞凋亡率隨鹽酸小檗堿濃度的增加而升高，低劑量組凋亡率顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），中劑量組顯著高于空白對(duì)照組及低劑量組（P 均<0.05），高劑量組顯著高于空白對(duì)照組及低、中劑量組（P 均<0.05），見表1。

3.3 鹽酸小檗堿對(duì)A375 細(xì)胞遷移力的影響 空白對(duì)照組與鹽酸小檗堿低、中、高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=510.805，P<0.01）；穿膜數(shù)隨鹽酸小檗堿濃度的增加而降低，低劑量組穿膜數(shù)顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），中劑量組顯著低于空白對(duì)照組及低劑量組（P 均<0.05），高劑量組顯著低于空白對(duì)照組和低、中劑量組（P 均<0.05），見表1。

3.4 鹽酸小檗堿對(duì)A375 細(xì)胞TLR4 mRNA 及蛋白表達(dá)的影響 空白對(duì)照組與鹽酸小檗堿低、中、高劑量組TLR4 mRNA 及蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=428.200、2590.195，P 均<0.01）；TLR4 mRNA 及蛋白表達(dá)隨鹽酸小檗堿濃度的增加而逐漸降低，低劑量組顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05），中劑量組顯著低于空白對(duì)照組及低劑量組（P 均<0.05），高劑量組顯著低于空白對(duì)照組和低、中劑量組（P 均<0.05），見表2、圖1。

表2 不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)A375 細(xì)胞TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)（）

表2 不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)A375 細(xì)胞TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)（）

注：空白對(duì)照組給予鹽酸小檗堿0μmol/L；低劑量組給予鹽酸小檗堿40μmol/L；中劑量組給予鹽酸小檗堿80μmol/L；高劑量組給予鹽酸小檗堿120μmol/L；TLR4 為Toll 樣受體-4；β-actin mRNA 為內(nèi)參基因；β-actin 蛋白為內(nèi)參蛋白；與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05

圖1 不同濃度鹽酸小檗堿作用后A375 細(xì)胞TLR4 蛋白表達(dá)

4 討論

鹽酸小檗堿作為抗菌消炎藥在臨床應(yīng)用多年，近年發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對(duì)多種類型實(shí)體腫瘤具有顯著抗癌活性，如肝癌、宮頸癌、肺癌等[8-10]。有關(guān)鹽酸小檗堿在惡性黑色素瘤的作用相關(guān)報(bào)道較少[11]，對(duì)其增殖凋亡、遷移的影響及調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，3 種不同濃度鹽酸小檗堿實(shí)驗(yàn)組對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375 的增殖具有顯著的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，A375 細(xì)胞的細(xì)胞存活率逐漸下降（P<0.05），具有劑量依賴關(guān)系，由此推斷鹽酸小檗堿可以在體外有效抑制A375 細(xì)胞的增殖，且濃度越高，細(xì)胞存活率越低；流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)：隨藥物濃度的增加，A375 細(xì)胞的凋亡率逐漸升高（P<0.05），呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。惡性黑色素瘤的治療難點(diǎn)在于容易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，本研究通過Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿對(duì)A375 細(xì)胞株的遷移能力具有顯著的抑制作用，且隨著濃度的增加，細(xì)胞株的遷移能力逐漸下降（P<0.05）。

Toll 樣受體（Toll like receptors，TLRs）是一類天然免疫受體，是機(jī)體介導(dǎo)天然免疫轉(zhuǎn)向獲得性免疫的橋梁。TLR4 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLR，屬于細(xì)胞膜I 型跨膜糖蛋白受體，不但識(shí)別外源性的病原體（如LPS），還可識(shí)別內(nèi)源性物質(zhì)及其降解產(chǎn)物[12]。研究表明，TLR4 可在多種腫瘤細(xì)胞表達(dá)[10，13]，通過配體（LPS）的激活釋放腫瘤生長因子和細(xì)胞生長因子形成腫瘤生長微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，逃避腫瘤的免疫反應(yīng)[9，13]。TLR4 的激活可促進(jìn)下游NF-κB 的磷酸化活化，從而激活釋放腫瘤生長因子和細(xì)胞生長因子如IL-10、TNF-α 等[9，13]，參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境。

本研究通過RT-PCR 及Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿可以有效抑制黑素瘤A375 細(xì)胞TLR4 mRNA 及蛋白表達(dá)。并且鹽酸小檗堿對(duì)TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)量的影響作用會(huì)隨著藥物濃度的升高而顯著降低（P<0.05）。由此推斷鹽酸小檗堿可能通過阻斷TLR4 信號(hào)通路影響腫瘤生長免疫微環(huán)境而發(fā)揮抗腫瘤作用；但其確切信號(hào)途徑及其對(duì)下游腫瘤生長因子及細(xì)胞因子的影響尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，鹽酸小檗堿可以促進(jìn)黑素瘤A375 細(xì)胞凋亡，抑制A375 細(xì)胞的增殖和遷移能力，且這種作用具有劑量依賴關(guān)系。同時(shí)其抗腫瘤機(jī)制可能與抑制TLR4 信號(hào)通路有關(guān)。