孟小虎 黃昌拼 劉永昌 解旭品 張方捷 方 欣

動脈粥樣硬化是一種多因素疾病。高遷移率族1蛋白（High mobility group box 1 protein，HMGB1）是動脈粥樣硬化的關鍵炎癥介質(zhì)，不同氧化還原狀態(tài)的HMGB1 活性不同，完全氧化后會失去原有活性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，外源性HMGB1 可抑制血小板衍生生長因子誘導的多能血管干細胞的增殖及其向血管平滑肌細胞的分化，但是氧化處理后，HMGB1 則失去上述抑制作用[2]。既往研究表明，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）可通過選擇修復模式減輕或加重動脈粥樣硬化[3]，目前尚不清楚氧化還原狀態(tài)的HMGB1 是否以及如何參與動脈粥樣硬化。本研究通過二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）及過氧化氫（H2O2）處理HMGB1，使其處于不同氧化還原狀態(tài)，觀察其對MSC 增殖、遷移及向血管細胞（內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞）分化的作用，以闡明氧化還原狀態(tài)HMGB1介導MSC 血管修復對動脈粥樣硬化的影響。

1 材料與方法

1.1 細 胞 F344 大鼠骨髓MSC（美國Cyagen Biosciences 公司，RAFMX-01001）。

1.2 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco，批號11995065）、0.25%胰酶（美國Gibco，批號25200056）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Gibco，批號12484028）、細胞凍存液（美國Cyagen Biosciences，批號GUXMX-07021）、CCK-8 試劑盒（中國Beyotime Biotech，批號C0038）、Transwell 小室（中國corning，批號3422）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidine-2-phenylindole，DAPI）（美國BioLegend，批號422801）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（以色列ProSpec，批號CYT-116）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF-BB）（以色列ProSpec，批號CYT-501）、小鼠抗CD31 IgG 抗體（美國Abcam，批號ab212711）、小鼠抗α-平滑肌抗原（α-SMA）IgG 抗體（美國Abcam，批號ab119952）、藻紅蛋白（PE）偶聯(lián)的抗α-SMA 抗體（美國Biodesign，批號hz-0189RPE）、Alexa Fluor 647 偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG 抗體（中國FCMACS，批號FMS-Msaf64701）、PE 偶聯(lián)的抗CD31 抗體（中國Miltenyi Biosciences，批號130-105-878）、重組HMGB1 細胞因子（美國Sigma-Aldrich，批號H4652）、H2O2（美國Sigma-Aldrich，批號18304）、DTT（美國Sigma-Aldrich，批號D0632）。

1.3 方 法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將MSC 置于含10% FBS 及1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，放入5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用0.25%胰酶消化進行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 氧化還原HMGB1 制備 室溫下分別使用濃度梯度0.005mmol/L[HMGB1（0.005mM H2O2）組]、0.01mmol/L[HMGB1（0.01mM H2O2）組]、0.02mmol/L[HMGB1（0.02mM H2O2）組]H2O2和5mmol/L[HMGB1（5mM DTT）組]DTT 處理HMGB1 2h[4-5]使其處于氧化及還原狀態(tài)，未處理的HMGB1 為陰性對照（HMGB1 組），然后分別使用100μg/L 濃度上述處理后的HMGB1 處理MSC 24h[2]，不做處理的MSC 為空白組（MSC 組）。

1.3.3 細胞增殖力測定 將MSC 組、HMGB1 組、HMGB1（0.005mmol/L H2O2）組、HMGB1（0.01mmol/L H2O2） 組、HMGB1（0.02mmol/L H2O2） 組、HMGB1（5mmol/L DTT）組細胞以每孔4×103個細胞密度接種到96 孔板中，每組5 個復孔。溫育24h 后，更換含有10%CCK-8 溶液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后，測定450nm 波長處吸光度（OD）值，重復3 次，每次取5孔平均值。

1.3.4 細胞遷移能力測定 8-μm 孔的Transwell 小室插入24 孔板中，將其腔室分成上室和下室。然后，將MSC 組、HMGB1 組、HMGB1（0.005mmol/L H2O2）組、HMGB1（0.01mmol/L H2O2）組、HMGB1（0.02mmol/L H2O2）組、HMGB1（5mmol/L DTT）組用融合度為80%的細胞消化并以每孔8×104個細胞接種于上室，溫育24h。其中上室加入無血清培養(yǎng)基500μL，在下室中加入含15% FBS 的培養(yǎng)基750μL 以誘導細胞遷移。繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，將遷移到膜下側(cè)的細胞使用甲醇固定15min，使用0.1%結(jié)晶紫溶液染色，用相差顯微鏡觀察（200×）并隨機選取5 個視野計數(shù)。重復實驗5 次。

1.3.5 誘導體外培養(yǎng)的MSC 向血管細胞分化 將MSC 組、HMGB1 組、HMGB1（0.02mmol/L H2O2）組、HMGB1（5mmol/L DTT）組細胞放在含有5% FBS 和25μg/L PDGF-BB 的DMEM 中培養(yǎng)7 天以誘導其向血管平滑肌細胞（vessel smooth muscle cell，VSMC）分化。用25μg/L 的VEGF 代替PDGF-BB 誘導MSC 向血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell，VEC）分化。通過流式細胞術和細胞免疫熒光實驗檢測CD31 和α-SMA的表達，分別鑒定分化成VEC 和VSMC 的細胞。

1.3.6 細胞免疫熒光實驗 免疫熒光檢測上述誘導分化后MSC 組、HMGB1 組、HMGB1（0.02mmol/L H2O2）組、HMGB1（5mmol/L DTT）組培養(yǎng)細胞中CD31、α-SMA 表達。用冷丙酮將上述誘導分化后的培養(yǎng)細胞冷凍切片固定并用10%山羊血清封閉；再用特定的一級抗體探測靶蛋白，然后通過與相應的熒光蛋白標記的二級抗體孵育顯現(xiàn)；最后，使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidine-2-phenylindole，DAPI）復染細胞核。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 流式細胞術 流式細胞技術檢測上述誘導分化后MSC 組、HMGB1 組、HMGB1（0.02mmol/L H2O2）組、HMGB1（5mmol/L DTT）組細胞表面CD31 和α-SMA。將上述各組細胞轉(zhuǎn)移至5μL 流式管中并在4℃下避光與PE 偶聯(lián)的流式抗體溫育30min，然后洗滌細胞并使用磷酸鹽緩沖液重懸。最后使用BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀定量熒光。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用Graph-Pad Prism 6.0 統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用Mann-Whitney 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖情況比較 與MSC 組比較，HMGB1組顯著抑制MSC 增殖（P<0.05），HMGB1（5mmol/L DTT）組促進MSC 增殖（P<0.05）；與HMGB1 組比較，HMGB1（0.005mmol/L H2O2）組、HMGB1（0.01mmol/L H2O2）組、HMGB1（0.02mmol/L H2O2）組對MSC 增殖的抑制作用減弱甚至消失（P 均<0.05）。見表1。

2.2 細胞遷移能力比較 與MSC 組比較，HMGB1組促進MSC 遷移（P<0.05）；與HMGB1 組比較，HMGB1（5mmol/L DTT）組對MSC 遷移的促進作用增強（P<0.05），HMGB1（0.005mmol/L H2O2）組、HMGB1（0.01mmol/L H2O2）組、HMGB1（0.02mmol/L H2O2）組對MSC 遷移的促進作用減弱甚至消失（P 均<0.05）。見表1、圖1。

表1 各組細胞增殖及遷移能力比較（）

表1 各組細胞增殖及遷移能力比較（）

注：MSC 組為未經(jīng)處理的MSC；HMGB1 組為未經(jīng)H2O2、DTT 處理的HMGB1；HMGB1（5mmol/L DTT）組為5mmol/L DTT 還原后HMGB1處理的MSC；HMGB1（0.005mmol/L、0.01mmol/L、0.02mmol/L H2O2）組為0.005mmol/L、0.01mmol/L、0.02mmol/L H2O2 氧化后HMGB1 處理的MSC；MSC 為間充質(zhì)干細胞；HMGB1 為高遷移率族1 蛋白；DTT 為二硫蘇糖醇；H2O2 為過氧化氫；與MSC 組比較，aP<0.05；與HMGB1 組比較，bP<0.05；與HMGB1（5mmol/L DTT）組比較，cP<0.05；與HMGB1（0.005mmol/L H2O2）組比較，dP<0.05；與HMGB1（0.01mmol/L H2O2）組比較，eP<0.05

2.3 各組MSC 細胞向血管內(nèi)皮細胞分化比較 與MSC 組比較，HMGB1 組CD31 陽性細胞表達增加（P<0.05）；與HMGB1 組比較，HMGB1（5mmol/L DTT）組可增強VEGF 誘導MSC 向CD31 陽性細胞分化的能力（P<0.05），HMGB1（0.02mmol/L H2O2）組上述能力減弱甚至消失（P<0.05）。見表2、圖2。

2.4 各組MSC 細胞向血管平滑肌細胞分化比較與MSC 組比較，HMGB1 組抑制α-SMA 陽性細胞表達（P<0.05）；與HMGB1 組比較，HMGB1（5mmol/L DTT）組α-SMA 陽性細胞表達明顯降低（P<0.05），HMGB1（0.02mM H2O2）組升高（P<0.05）。見表2、圖3。

2.5 氧化還原狀態(tài)HMGB1 在動脈粥樣硬化中的作用機制 HMGB1 抑制MSC 的增殖及其向血管平滑肌細胞分化，并促進MSC 向血管內(nèi)皮細胞分化。在動脈粥樣硬化的微環(huán)境中，氧化應激產(chǎn)生大量活性氧，使HMGB1 易被氧化而失活。根據(jù)上述研究結(jié)果，我們推論氧化還原狀態(tài)的HMGB1 在動脈粥樣硬化中的作用機制，見圖4。

3 討論

圖1 Transwell 試驗檢測MSC 遷移能力（結(jié)晶紫染色×200）

動脈粥樣硬化是心、腦血管疾病和周圍血管疾病的主要原因，其特征是內(nèi)皮下積聚大量脂肪物質(zhì)、巨噬細胞和平滑肌細胞，導致慢性閉塞性血管病[6]。受累的動脈會逐漸形成充滿血管平滑肌細胞和細胞外基質(zhì)的增生性內(nèi)膜層，該過程被稱為內(nèi)膜增生或新生內(nèi)膜形成，并最終引起受累動脈狹窄[7]。MSC 增殖、遷移以修復血管損傷是目前研究熱點，在臨床研究中已取得滿意的結(jié)果[8]。MSC 可在動員后進入血液循環(huán)及血管損傷位點并分化成內(nèi)皮細胞加速再內(nèi)皮化，維持血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)（EC）[9]。研究表明，MSC 移植對治療動脈硬化有效[10]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，MSC 向血管細胞的分化受HMGB1 的影響，激活高遷移率族1 蛋白/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（HMGB1/RAGE）信號通路能夠促進MSC 分化為血管內(nèi)皮細胞并抑制血管內(nèi)膜過度增生，抑制炎癥細胞在移植動脈內(nèi)膜中的浸潤，從而抑制動脈硬化的發(fā)生[3]。HMGB1 是動脈粥樣硬化的關鍵炎癥介質(zhì)。HMGB1 的許多胞內(nèi)和胞外功能依賴于蛋白的氧化還原敏感半胱氨酸殘基[11]。氧化應激與動脈粥樣硬化的形成有關，氧化應激狀態(tài)下活性氧（ROS）水平較高，主要是內(nèi)源性促氧化酶活性與有利于活性氧的抗氧化酶活性失衡所致，過多的ROS 產(chǎn)生會誘導信號級聯(lián)反應，導致促炎基因的表達、SMC 的生長和遷移[12-13]。HMGB1能夠通過促進血管平滑肌細胞泡沫細胞的形成，促進動脈硬化發(fā)生發(fā)展[14]。在低氧的組織微環(huán)境中（如局部受損及缺血的血管組織），HMGB1 抑制多能血管干細胞向平滑肌細胞分化的能力會受到顯著影響[2]。本研究通過使用DTT 及H2O2處理HMGB1，使其處于不同氧化還原狀態(tài)，然后使用上述氧化還原狀態(tài)HMGB1 處理體外培養(yǎng)MSC，還原狀態(tài)HMGB1 能夠促進MSC 增殖，并增強其對MSC 遷移的促進作用，而氧化狀態(tài)的HMGB1 對MSC 增殖、遷移的影響減弱甚至消失。CD31 和α-SMA 分別為VEC 及VSMC細胞特異性標記分子，可通過檢測CD31 和α-SMA的表達水平分析MSC 向VEC 及VSMC 分化情況[3]。

本研究結(jié)果顯示，還原狀態(tài)HMGB1 可增強其協(xié)調(diào)VEGF 誘導MSC 向CD31 陽性細胞分化的能力，并增強其對PDGF 誘導的MSC 向VSMC 分化的抑制作用；而氧化狀態(tài)HMGB1 對MSC 向CD31 及α-SMA 陽性細胞分化的影響減弱甚至消失（P<0.05）。

表2 各組CD31 陽性細胞及α-SMA 陽性細胞比較（%，）

表2 各組CD31 陽性細胞及α-SMA 陽性細胞比較（%，）

注：MSC 組為未經(jīng)處理的MSC；HMGB1 為未經(jīng)H2O2、DTT 處理的HMGB1；HMGB1（5mmol/L DTT）組為5mmol/L DTT 還原后HMGB1處理的MSC；HMGB1（0.02mmol/L H2O2）組為0.02mmol/L H2O2 氧化后HMGB1 處理的MSC；MSC 為間充質(zhì)干細胞；HMGB1 為高遷移率族1 蛋白；DTT 為二硫蘇糖醇；H2O2 為過氧化氫；與MSC 組比較，aP<0.05；與HMGB1 組比較，bP<0.05；與HMGB1（5mmol/L DTT）組比較，cP<0.05

圖2 免疫熒光試驗檢測CD31 陽性細胞

圖3 免疫熒光試驗檢測α-SMA 陽性細胞（細胞免疫熒光染色×400）

圖4 氧化還原狀態(tài)的HMGB1 在動脈粥樣硬化中的作用機制

綜上所述,還原狀態(tài)HMGB1 能夠促進MSC增殖，增強其對MSC 遷移及向VEC 分化的促進作用，并且增強其對MSC 向VSMC 分化的抑制作用，進而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展；而氧化狀態(tài)HMGB1 對MSC 增殖、遷移及向上述血管細胞分化的影響減弱甚至消失，進而促進動脈粥樣硬化。