周剛剛，邢 凱，王楚端

（1.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局，北京 100088；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

黃曲霉毒素（Aflatoxins）是天然產(chǎn)生的真菌毒素，是黃曲霉、寄生曲霉和特曲霉等真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]，主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2等20 多種，其中以黃曲霉毒素B1（AFB1）為主，是目前已知的致癌性最強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)。黃曲霉毒素主要污染谷物（如玉米、大豆、小麥等）。根據(jù)FAO 調(diào)查，全球每年谷物的25%會(huì)受到不同程度的霉菌毒素污染[2]。黃曲霉毒素污染谷物后，會(huì)繼續(xù)存在于谷物加工的食品、飼料及各類副產(chǎn)品中，其經(jīng)動(dòng)物體代謝后主要產(chǎn)物為黃曲霉毒素M1（AFM1）。以奶牛為例，其采食被污染的飼料后很容易在乳汁中殘留AFM1，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重危害。目前國(guó)內(nèi)外均對(duì)AFM1的污染做出嚴(yán)格的殘留限量（MRL）要求，其中尤以歐盟最為嚴(yán)格，其規(guī)定牛乳中AFM1的MRL 為50 ng/L[3]。

目前檢測(cè)AFM1的主要方法有酶聯(lián)免疫法[4]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、膠體金免疫層析法[6]等，其中以膠體金層析法最為方便，是奶站、牧場(chǎng)和基層檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛的手段之一。由于AFM1限量要求高，對(duì)檢測(cè)試劑性能要求也高，因此非常有必要對(duì)其性能進(jìn)行充分驗(yàn)證，以確保滿足實(shí)際生產(chǎn)檢測(cè)需求。本研究即根據(jù)歐盟參考實(shí)驗(yàn)室方案CRL Guidelines 2010[6]對(duì)自制的AFM1檢測(cè)試紙條的檢測(cè)精密度、特異性、假陽性率和假陰性率、重復(fù)性、穩(wěn)定性、樣本差異影響、批間差異及試劑盒穩(wěn)定性分別檢測(cè)，并通過膠體金讀數(shù)儀對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 膠體金讀數(shù)儀（TSR100，杭州奧盛儀器有限公司），孵育器（mini 型，杭州奧盛儀器有限公司），移液器（200 μL，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司），牛乳分析儀（保加利亞LactoScan）；AFB1、AFM1及玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、赭曲霉毒素和伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品來自于Sigma，抗生素標(biāo)準(zhǔn)品來自于中監(jiān)所和上海阿拉丁公司。

AFM1檢測(cè)試劑盒（德國(guó)R-biopharM），AFM1檢測(cè)試紙條由本單位自制（檢測(cè)限為50 ng/L，批號(hào)為RB190101、RB190111 和RB190201）。

1.2 樣本檢測(cè) 牛奶樣本由本單位收集，UHT 奶和巴氏殺菌奶采購自本地超市。牛奶樣品不需要前處理。室溫下，將AFM1檢測(cè)試紙條放入奶樣中5 Min 取出。結(jié)果可以通過膠體金讀數(shù)儀定量讀取和顯色定性2 種方法讀取。

1.3 精密度檢測(cè) 將經(jīng)過確認(rèn)沒有AFM1污染的牛奶樣本（AFM1＜5 ng/L，以下簡(jiǎn)稱空白奶樣）用AFM1標(biāo)準(zhǔn)品添加5 個(gè)不同濃度（0、25、50、75、100 ng/L），每個(gè)濃度做20 個(gè)重復(fù)，用AFM1膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)；50 ng/L 做60 個(gè)重復(fù)用膠體金試紙條檢測(cè)，并用膠體金讀數(shù)儀做定量分析，計(jì)算不同濃度檢測(cè)結(jié)果。

1.4 特異性檢測(cè) 根據(jù)歐盟對(duì)不同藥物的MRL 要求，如表1 所示，將不同濃度的交叉反應(yīng)物質(zhì)添加至空白奶樣中，然后用AFM1膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)，并定量分析檢測(cè)結(jié)果。

表1 特異性檢測(cè)物質(zhì)及添加濃度

1.5 假陽性率和假陰性率檢測(cè) 將采集自不同牛場(chǎng)的101 份奶樣和100 份奶站收集的奶樣用自制的AFM1膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)，并用AFM1ELISA 檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，計(jì)算試紙條檢測(cè)的假陽性率和假陰性率。同時(shí)，用SPSS 22.0 計(jì)算2 種結(jié)果的相關(guān)性。

1.6 重復(fù)性檢測(cè) 將空白奶樣用AFM1標(biāo)準(zhǔn)品添加0、25、75、100 ng/L，然后用不同試紙條各檢測(cè)10 次，計(jì)算不同測(cè)定間的變化來判定試紙條檢測(cè)的重復(fù)性；同時(shí)將同一試紙條多次檢測(cè)，以檢測(cè)結(jié)果來評(píng)價(jià)試紙條讀數(shù)儀的重復(fù)性。

1.7 穩(wěn)健性檢測(cè) 為了進(jìn)一步確認(rèn)試紙條的檢測(cè)性能，通過變化樣本來檢測(cè)添加濃度為50 ng/L AFM1標(biāo)準(zhǔn)品的空白奶樣，具體如下：對(duì)加樣體積做適當(dāng)調(diào)整（±10%），即由200 μL 調(diào)整至180、220 μL；對(duì)奶樣的溫度做出變化，測(cè)定冷藏后的4℃以及室溫20℃；將牛奶離心脫脂后繼續(xù)檢測(cè)。通過3 種調(diào)整對(duì)比試紙條對(duì)樣本條件變化的適應(yīng)性。

1.8 樣本差異影響 牛奶由于牛個(gè)體差異呈現(xiàn)出脂肪、蛋白、體細(xì)胞數(shù)等的差異，并且隨著泌乳階段的不同，其乳成分含量也會(huì)不同。通過乳成分分析儀對(duì)收集的奶樣本分類，對(duì)比檢測(cè)脂肪含量（＜2 g/100mL，＞6 g/100 mL），蛋白含量（＜3 g/100 mL，＞4 g/100 mL），pH（pH 6.0，pH 7.5）對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，將上述不同樣本添加50 ng/L AFM1標(biāo)準(zhǔn)品，以膠體金試紙條檢測(cè)，分析檢測(cè)結(jié)果。

1.9 試劑穩(wěn)定性 將檢測(cè)試紙條保存于37℃加速老化，分別于第1、2、3、5、7、15、30、60 天抽取檢測(cè)添加濃度為50 ng/L AFM1標(biāo)準(zhǔn)品的空白奶樣，根據(jù)結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)性能 由表2 可知，奶樣添加濃度小于歐盟MRL 50 ng/L 時(shí)，檢測(cè)結(jié)果均小于50 ng/L，即試紙條可在歐盟MRL 水平準(zhǔn)確檢測(cè)奶樣中的AFM1是否超標(biāo)；添加AFM1濃度為50 ng/L 時(shí)，檢測(cè)結(jié)果范圍為36.3～68.2 ng/L，即定量檢測(cè)時(shí)，超過36.3 ng/L 即可認(rèn)為是陽性，需要進(jìn)一步用儀器法確認(rèn)。

對(duì)不同濃度的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析可知，試紙條檢測(cè)空白奶樣（0 ng/L）AFM1時(shí)，平均值為5.969 ng/L，標(biāo)準(zhǔn)差為5.205 ng/L，根據(jù)CRL 2010 要求計(jì)算其定性檢出限（Mean +3×SD）為21.58 ng/L，定量檢出限（Mean+10×SD）為58.01 ng/L。

表2 不同添加濃度檢測(cè)結(jié)果

2.2 特異性 如圖1 所示，黃曲霉毒素M2添加濃度為50 ng/L 時(shí)，檢出為平均值為43.1 ng/L，交叉反應(yīng)為0.86%，其他藥物交叉反應(yīng)均小于0.5%。

圖1 AFM1 試紙條特異性檢測(cè)結(jié)果

2.3 假陽性率和假陰性率 以試紙條方法檢出限（21.58 ng/L）為判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)101 份奶樣檢測(cè)出陽性2 份，試劑盒檢測(cè)為全部陰性，假陽性率為1.98%；100 份奶站收集的樣本經(jīng)檢測(cè)其中有2 份陽性值大于檢出限，試劑盒檢測(cè)為全部陰性，假陽性率為2%；綜合考慮試紙條的假陽性率為2%，假陰性率為0。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，2 種方法的檢測(cè)結(jié)果呈高度的正相關(guān)（R2=0.95，P＜0.05）。

2.4 重復(fù)性 由表3 可知，檢出濃度為1～100 ng/L 時(shí)，檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)為6.18%～16.81%。

表3 膠體金試紙條重復(fù)性的檢測(cè)結(jié)果

如表4 所示，膠體金讀數(shù)儀的重復(fù)性CV 在1.327%～11.556%。

表4 膠體金讀數(shù)儀的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

綜合判定，試紙條檢測(cè)結(jié)果的CV 小于20%，可滿足實(shí)際檢測(cè)需求。

2.5 穩(wěn)健性 對(duì)加樣體積做±10%調(diào)整后的檢測(cè)結(jié)果如表5 所示，加樣量變化對(duì)空白樣本的檢測(cè)結(jié)果影響不大，對(duì)添加AFM150 ng/L 的樣本，當(dāng)加樣量較大（超過220 μL）時(shí)，檢測(cè)結(jié)果由部分樣本變化較大，由此可推測(cè)過大加樣量可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

表5 不同加樣體積的檢測(cè)結(jié)果

如表6 所示，其中4℃的奶樣檢測(cè)結(jié)果稍微偏低，20℃結(jié)果正常，表明試紙條試劑檢測(cè)的奶樣溫度最好控制在20℃左右。

表6 不同奶樣溫度的檢測(cè)結(jié)果

添加50 ng/L AFM1的全脂牛奶經(jīng)2 600 g× 4℃離心10 min 前后檢測(cè)，結(jié)果如表7 所示，脫脂前檢測(cè)結(jié)果正常，而脫脂后檢測(cè)結(jié)果偏高，表明脂肪含量變化對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定影響。

表7 奶樣脫脂處理的檢測(cè)結(jié)果

2.6 樣本差異影響 由圖2 和圖3 可知，不同類型的樣本，空白樣本檢出值均小試紙條的理論檢出限（21.58 ng/L），均為陰性；添加50 ng/L AFM1的樣本，不同樣本檢出結(jié)果平均值也接近于50 ng/L，樣本間差異較小，即試紙條的樣本適應(yīng)性良好。

2.7 試劑穩(wěn)定性 檢測(cè)試劑盒于37℃加速老化，分別于第1、2、3、5、7、15、30、60 天抽取檢測(cè)添加濃度為50 ng/L AFM1標(biāo)準(zhǔn)品的空白奶樣結(jié)果如圖4 所示，隨保存期限的增加試紙條檢測(cè)值逐漸降低。在第15 天時(shí)，檢測(cè)平均值降低至48.235 ng/L；保存至第30 天時(shí)，檢測(cè)值為39.43 ng/L；以50 ng/L 的定性檢出限來判定，試紙條在37℃至少可保存15 d。

圖2 不同類型的空白樣本檢測(cè)結(jié)果匯總

圖3 添加50 ng/L 的不同樣本檢測(cè)結(jié)果匯總

圖4 37℃保存期檢測(cè)結(jié)果匯總

3 討 論

膠體金是一種具有一定尺寸，可以保持穩(wěn)定膠體狀態(tài)的貴金屬納米粒子[7]。膠體金試紙條方法是一種以膠體金為示蹤物的快速免疫分析技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)勢(shì)，能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求[8]。膠體金試紙條檢測(cè)方法作為目前牧場(chǎng)、奶站及乳品加工企業(yè)應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)手段，因其成本低、操作方便備受歡迎。歐盟、美國(guó)均對(duì)檢測(cè)試紙條的標(biāo)準(zhǔn)及應(yīng)用做出相應(yīng)的規(guī)定。以歐盟為例，CRL Guidelines 2010[6]標(biāo)題全稱為“獸藥殘留快速篩選方法驗(yàn)證指南”，其主要是針對(duì)快速篩選方法的性能指標(biāo)的評(píng)定和驗(yàn)證做出全面的規(guī)定，而具有ISO/IEC17025 資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室可以進(jìn)一步據(jù)此指南對(duì)方法做出評(píng)價(jià)，如法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)AFNOR 就依此推出了NF Validation，聯(lián)合其成員實(shí)驗(yàn)室對(duì)快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)。本研究中，采用歐盟標(biāo)準(zhǔn)下的標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證本試紙條的可靠性，檢測(cè)能力滿足歐盟MRL（50 ng/L）要求。

AFM1含量是奶制品檢測(cè)中重要的檢測(cè)項(xiàng)目，其結(jié)果直接關(guān)系到奶制品的質(zhì)量安全。目前，酶聯(lián)免疫吸附法（ELLSA）、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等方法是檢測(cè)AFM1的主要方法[9]。ELLSA 方法是將抗體抗原反應(yīng)的特異性和酶與底物顯色反應(yīng)的高效催化作用有機(jī)結(jié)合而成的分析技術(shù)，其檢測(cè)成功的關(guān)鍵是獲得特異性較高的高活性抗體。但是目前報(bào)道抗體在其特異性、敏感性以及穩(wěn)定性上都有一定缺陷[10]。同時(shí)，由于牛奶中的組成比較復(fù)雜，包括糖類、脂肪、蛋白質(zhì)等，容易影響ELLSA 方法中酶和抗體的活性。因此在使用不同來源ELLSA 試劑盒時(shí)候要進(jìn)行科學(xué)的評(píng)價(jià)。高效液相色譜法（HPLC）法是目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)AFM1的重要方法，具有高效、靈敏、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11]。但是該方法在樣品前處理過程中方法較為復(fù)雜，不適合大批量樣品的檢測(cè)。同時(shí)檢測(cè)過程中用到較多的有機(jī)溶劑，其對(duì)環(huán)境及操作者有一定的傷害可能性。鑒于膠體金試紙條方法具有操作簡(jiǎn)單、不添加任何其他試劑、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，十分適合牧場(chǎng)、奶站等地方奶樣的快速檢測(cè)，為AFM1檢測(cè)提供了新的方法。

4 結(jié) 論

通過對(duì)自制的AFM1快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)性能、試劑穩(wěn)定性及樣本適應(yīng)性等方面的研究，結(jié)果表明該試紙條檢測(cè)性能良好，可對(duì)牛奶中的AFM1檢測(cè)。本研究初步確定了試紙條滿足了牛奶測(cè)定的基本要求，同時(shí)可也為相關(guān)研究提供一定參考。