薛麗娜，羅惠娣，周勝花，王 曦，毛楊毅

（山西農業(yè)大學動物科學學院，山西太谷 030032）

動物毛色是由2 種黑色素（真黑素和褐黑素）的比例和分布不同造成并顯示多樣性，其中約有150 個基因通過不同信號通路形成錯綜復雜的網絡調控這一過程[1-2]。目前，對黑色素合成的研究主要集中在α-MSH 誘導信號通路，即促黑色素細胞激素（α-MSH）和腎上腺皮質激素（ACTH）與黑色素細胞膜上的黑素皮質激素受體1（MC1R）結合，激活環(huán)磷酸腺苷（cAMP）系統(tǒng)，經過一系列級聯(lián)反應活化酪氨酸酶（TYR），催化酪氨酸合成真黑素。當TYR 活性弱時，產生褐黑素[3-4]。在該信號通路中，Agouti基因編碼的鼠灰信號蛋白（ASIP）與α-MSH 競爭結合MC1R，抑制cAMP 系統(tǒng)激活，從而導致真黑色素合成減少，褐黑色素相對含量增加[5]。前人已對該信號通路中MC1R、Agouti及TYR基因發(fā)揮的重要作用開展了深入探索，但關于其互作關系的研究鮮有報道。

動物毛色是品種鑒定的重要依據[6]，也是一種重要的經濟性狀，研究毛色機制有助于培育出符合市場需求的新品種[7]。在綿羊中，全黑被毛綿羊較為少見，本實驗以特定雜交模式產生的黑色綿羊為模型，以該群體中白色綿羊為對照，建立qRT-RCR 反應體系，系統(tǒng)分析綿羊MC1R、Agouti及TYR基因mRNA 在不同毛色綿羊皮膚組織的差異表達情況，旨在闡明該雜交模式下黑色綿羊皮膚中黑色素形成的內在調控機理，為更加科學利用綿羊毛色提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 前期關于雜交改良本地綿羊肉品質的研究中[8]，發(fā)現(xiàn)以黑頭杜泊（公）與本地白色綿羊（母）雜交產生的花臉羊為母本，以薩?？藶楦副?，雜交產生的后代中有一小部分是全黑色被毛綿羊，本研究隨機選取黑色綿羊和該群體中白色被毛綿羊各4 只作為供試綿羊（圖1）。

為消除非遺傳因素（年齡、飼喂、季節(jié)）對毛色的影響[9]，實驗于2019 年10 月在山西省廣靈縣同羊農牧有限公司羊場進行，隨機選取同一年齡供試綿羊，背部皮膚凈毛后，用梳齒鑷夾起皮膚同時用手術刀割取長寬約1 cm 皮膚組織，完全浸入無酶管中的RNAwait 樣本保存液，4℃過夜保存，然后從RNAwait 中取出皮膚組織塊，-80℃長期保存，用于RNA 提取實驗。

圖1 不同被毛顏色綿羊

1.2 主要試劑 RNAwait（非凍型組織RNA 保存液）（Solarbio，北京）、Eastep?Super Total RNA Extraction Kit（Promega，上海）、PCR MasterMix （中科瑞泰生物科技有限公司，北京）、50×TAE 緩沖液（Solarbio，北京）、D2000 DNA Ladder（中科瑞泰生物科技有限公司，北京）、GoScriptTMReverse Transcription System（Promega，上海）、QuantiNova SYBR Green PCR Kit（QIAGEN，德國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA 的提取 將-80℃保存的皮膚組織液氮研磨，提取總RNA 的皮膚組織的重量、所加試劑的體積及提取步驟參見Eastep?Super 總RNA 提取試劑盒說明。用核酸蛋白測定儀檢測RNA 的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠在室溫恒壓180 V 電泳 5～10 min，檢測總RNA 的完整性。

1.3.2 cDNA 的合成 將所提取的RNA 濃度均稀釋成10 μL 總體積含1 μg RNA。按 照GoScriptTMReverse Transcription System 說明建立反轉錄體系20 μL：gDNA GoScriptTMReaction Buffer Oligo(dT) （0.5 μg/reaction） 4 μL、Nuclease-Free Water 4 μL、GoScriptTMEnzyme Mix 2 μL、上述 RNA 稀釋液10 μL，混勻后置于PCR 儀中，反應條件：退火25℃ 5 min；延伸42℃6 min；失活70℃ 15 min。cDNA 在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 引物設計與合成 根據NCBI 查找的MC1R、Agouti、TYR及GAPDH基因mRNA 序列，參照孟浩浩[9]和李洪濤[10]等用Primer5.0 軟件設計引物，所有引物退火溫度均為60℃，由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息如表1 所示。

1.3.4 熒光定量PCR 引物特異性驗證 以cDNA 為模板，根據2×Taq PCR MasterMix 的說明，建立50 μL 的反應體系：上下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，2×MasterMix 25 μL，cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 21 μL。反應條件：94℃ 5 min（預變性階段）；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，共35 個循環(huán)（PCR 反應階段）；72℃ 5 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠在室溫恒壓120 V 電泳 30 min。

1.3.5 qRT-PCR 檢測 以cDNA 為模板，根據QuantiNova SYBR Green PCR Kit 試劑盒說明，建立20 μL 的反應體系：擴增基因的上下游引物（10 μmol/μL）各0.4 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA 模板2 μL，RNase-Free water 7.2 μL。反應條 件：95 ℃ 3 min（預變性階段）；95℃ 5 s，60℃ 20 s，共35 個循環(huán)（PCR反應階段）；熔解階段溫度從50℃至95℃，每5 s 升高1℃。

1.4 統(tǒng)計分析 qRT-PCR 實驗為每組4 個樣本，每個樣本重復3 次，所得CT 值經GAPDH 校正，按照2-ΔΔCT的計算方法算出目的基因mRNA 的相對表達量，所有數據均以平均數±標準差表示。采用單因素方差分析和顯著性檢驗的方法，利用SPSS 18.0 軟件對數據進行分析，運用GraphPad Prism 8 軟件繪制柱形圖。P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結果

2.1 總RNA 質量檢測 核酸蛋白濃度儀檢測結果顯示，樣本總RNA 濃度均大于100 ng/μL，A260/A280都是1.9～2.1，說明提取RNA 濃度和純度較高。提取產物經電泳檢測，從圖2 可以看出8 個樣本提取RNA 質量較好，符合后續(xù)實驗要求。

2.2 熒光定量PCR 引物特異性驗證凝膠電泳檢測 由圖3可知，MC1R、Agouti、TYR、GAPDH基因在退火溫度60℃條件下，擴增效果良好，沒有非特異性擴增，可進行后續(xù)實時熒光定量PCR 實驗。

表1 熒光定量PCR 引物序列

圖2 綿羊皮膚組織總RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 4 個基因PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3MC1R、Agouti、TYR及內參基因GAPDH的qRTPCR 擴增曲線及熔解曲線 采用qRT-PCR 對MC1R、Agouti、TYR及GAPDH基因進行擴增，熔解及擴增曲線如圖4 所示，所有熔解曲線溶解溫度在80～90℃且均為單一峰，表明引物特異性較好，無引物二聚體和非特異擴增。各引物的擴增曲線拐點平滑，擴增效果良好，說明本實驗結果可靠。

圖4 4 個基因熔解曲線圖及擴增曲線圖

2.4 不同毛色綿羊皮膚中MC1R、Agouti、TYR基因相對表達量 qRT-PCR 結果表明，不同毛色綿羊皮膚中MC1R、Agouti及TYR基因mRNA 均有表達（圖5）。MC1R基因mRNA 在黑色綿羊皮膚中表達量高于白色綿羊（P＞0.05）。Agouti基因mRNA 在白色綿羊皮膚中的表達量顯著高于黑色綿羊皮膚（P＜0.05）。TYR基因mRNA 在黑色綿羊皮膚中表達量是白色綿羊皮膚的34 倍（P＜0.01）。

圖5 MC1R、Agouti 及TYR 基因mRNA 在不同毛色綿羊皮膚中的相對表達量

3 討 論

綿羊毛色是一個重要的生產性狀[11]。綿羊毛色主要有白色、黑色、褐色和斑塊狀雜色[12]。在白色羊毛中不含或含少量褐黑素，褐色和黑色羊毛則含有黑色素或2 種色素的混合，完全黑色的綿羊較為少見。山西地方品種綿羊一般為白色，前期研究發(fā)現(xiàn)在與外來品種雜交后部分為黑色[8]。

MC1R基因編碼的蛋白屬于G 蛋白耦合受體家族，多表達于黑色素細胞膜上。大多數動物MC1RR基因的差異表達能夠引起毛色改變，如雞、牦牛、兔、羊駝和山羊等[13-17]。前人在綿羊及哈薩克羊中的研究也顯示，MC1R基因在黑羊皮膚中表達量極顯著高于白羊皮膚[18,10]，其機制可能是MC1R 能激活TYR 而保持較高活性，最終合成更多的真黑素，產生深色被毛[19]。曹俊婷等[20]在略陽雞皮膚組織中發(fā)現(xiàn)，MC1RR基因差異表達與白色和烏色不相關，而韓吉龍[11]認為藏羊皮膚中MC1RR基因在白色被毛皮膚中表達量顯著高于純黑被毛皮膚。本研究發(fā)現(xiàn)MC1RR基因在黑色綿羊中表達量略高于白羊，但與毛色不相關，這與曹俊婷等[19]的研究結果一致，說明MC1RR基因不是調控毛色的基因。綜上所述，在不同物種及不同品種中調控毛色的基因可能有所不同。

Agouti基因2、3、4 外顯子編碼的ASIP 蛋白為分泌蛋白，可通過競爭性結合黑色素細胞膜上MC1R 受體而使其合成更多的褐黑素，使動物表現(xiàn)為淺色被毛[21]。張?zhí)斓萚22]研究表明，山羊Agouti基因在白色毛色皮膚中表達量最高。Royo 等[23]研究認為白色被毛西班牙Xalda 綿羊皮膚Agouti基因表達量顯著高于黑色被毛。本研究發(fā)現(xiàn)，Agouti基因在白色綿羊中的表達量顯著高于黑色綿羊，說明Agouti為調控毛色的基因，這與前人研究結果一致。

TYR 為色素合成過程中的限速酶，與黑色素合成相關[11]。當MC1R 功能喪失或MC1R 受到與其拮抗的ASIP 抑制時，TYR 不能被激活而保持較低活性，使得真黑素含量下降，動物表現(xiàn)為淺色被毛[24]。這在越背花毛蒙古馬[25]、斑嘴野鴨[26]中得到了證實。本研究中，TYR基因mRNA 在黑色綿羊皮膚中表達量極顯著高于白色綿羊，這與前人研究結果一致。結合其上游基因Agouti的表達情況推測，造成綿羊黑色毛色性狀可能是由于在黑色綿羊中Agouti基因的低表達，而使TYR 被激活而有較高活性，導致真黑素含量較高。同時本研究發(fā)現(xiàn)2 種綿羊毛色中TYR基因表達量相差34 倍，而黑線倉鼠皮膚中的TYR基因相對表達量僅為白化突變系皮膚組織中的2.5 倍[27]，這說明可能還有其他因素導致TYR基因表達上調。黑色素合成是一個復雜而精密的調節(jié)過程，有多種基因參與其中，而每個基因又會受到DNA 堿基突變、轉錄因子、非編碼RNA、表觀遺傳調節(jié)因子等作用[28-30]，因此，造成TYR基因表達量相差如此之大的具體分子機制還有待后續(xù)研究。

4 結 論

本研究結果顯示，MC1R基因在黑色綿羊皮膚中表達量高于白色綿羊，Agouti基因在白色綿羊皮膚組織中的表達量顯著高于黑色綿羊，TYR基因在黑色綿羊皮膚中表達量極顯著高于白色綿羊。結合這3 個基因的相互關系推測，特定雜交模式下產生的黑色綿羊可能是由于Agouti基因表達量低而使α-MSH 誘導信號通路處于激活狀態(tài)，上調了TYR基因表達量，導致真黑素含量上升，出現(xiàn)黑色毛色性狀。