肖 蓉,張春芬,鄧 舒

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所,山西 太原 030031)

生產(chǎn)中大棚草莓種植每年都要換新苗,因此重茬在所難免。連作障害是制約草莓發(fā)展的最大因素,據(jù)調(diào)查,連作4年草莓能減產(chǎn)40%以上[1]。目前,大家公認(rèn)的連作障害的形成機理主要包括連作土壤中病原微生物積累[2]、土壤營養(yǎng)元素失衡[3]、化感作用[4-6]3個方面。而土壤微生態(tài)失衡是研究者所公認(rèn)的連作障害發(fā)生的根本。其中微生物因素在整個連作障礙發(fā)生發(fā)展過程中一直扮演著關(guān)鍵角色。

在土壤這個黑匣子中到底有多少微生物,以及他們之間的結(jié)構(gòu)信息、群體相互作用、與植物重茬障礙之間的關(guān)系等等吸引著人們持續(xù)而深入的研究。由于目前土壤中可培養(yǎng)的微生物僅占土壤微生物總數(shù)的1%左右,因此依賴于平板培養(yǎng)技術(shù)來研究土壤微生物生態(tài)顯然是不夠的[7]。近些年來,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和基因組學(xué)的蓬勃發(fā)展,以土壤中全部微生物基因組DNA序列為依據(jù)的微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法正日益成為大家普遍接受的方法[8]。

本研究以同一個農(nóng)業(yè)園區(qū)新茬草莓大棚和連作3年的重茬草莓大棚土壤為研究對象,直接提取草莓根際土壤總DNA,通過Illumina Miseq測序平臺對新茬土壤及重茬土壤細(xì)菌和真菌結(jié)構(gòu)及功能多樣性進行比較分析,旨在找到重茬土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌和真菌類群,從微生物生態(tài)學(xué)角度研究草莓重茬障害發(fā)作時的生物學(xué)病因,為草莓重茬障礙防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土樣

土壤樣品采自山西省太原市陽曲縣同一個農(nóng)業(yè)園區(qū)新茬草莓大棚和連作3年的重茬草莓大棚,于6月草莓剛收獲結(jié)束后采樣。每個大棚內(nèi)按“S”形于大棚中間隨機挑選草莓植株4株,整株挖出置于冰盒中用無菌袋帶回實驗室,抖掉根部多余的土后用無菌毛刷刷取根際土,4個土樣混合成1個樣置于無菌離心管中,新茬土壤樣品命名為XJS1,重茬土壤樣品命名為CJS1。各類型選取4座大棚為采樣地,共獲得XJS1和CJS1樣本各4個,視為4次重復(fù)。

1.2 土壤微生物總DNA提取及測序

土壤微生物總DNA提取方法參考本課題組前期方法[9]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性后用Nanodrop 2000分光光度計測定其濃度,DNA合格樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司完成后續(xù)多樣性測序工作。細(xì)菌多樣性測序選取V3-V4區(qū)作為靶向擴增區(qū)域,真菌多樣性測序選取ITS1-ITS2區(qū)作為靶向擴增區(qū)域。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel軟件對各樣本豐富度進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 多樣性指標(biāo)

原始測序數(shù)據(jù)通過質(zhì)控后,新茬大棚土壤(XJS1)中共獲得33 198條序列,分歸于24 968個OTUs;3年重茬大棚土壤(CJS1)中共獲得29 399條序列,分歸于23 307個OTUs。表1展示了兩種大棚土壤的細(xì)菌多樣性,可見,新茬大棚土壤的Shannon指數(shù)為8.092 6,Simpson指數(shù)為0.001 6,Chao-1指數(shù)為24 863;重茬大棚土壤的這3個多樣性指數(shù)分別為7.583 1、0.008 7和23 415。Shannon指數(shù)常用來綜合體現(xiàn)物種豐富度和均勻度;Simpson指數(shù)被用來評估環(huán)境中微生物多樣性,其數(shù)值越大代表樣本群落多樣性越低;Chao-1指數(shù)在生態(tài)學(xué)中也是估計物種種數(shù)的常用指標(biāo)。根據(jù)OTUs數(shù)目及多樣性指標(biāo)可以看出,重茬3年后土壤中細(xì)菌物種多樣性及豐富度降低。

表1 土壤中細(xì)菌的多樣性指數(shù)

2.1.2 門水平上豐富度差異分析

經(jīng)過軟件RDP classifier處理后,對所有序列進行細(xì)菌群落分類。新茬土壤中共涉及到29個門,重茬土壤中共涉及到25個門。圖1和圖2是兩種土壤類型中的優(yōu)勢細(xì)菌在門水平的豐度占比分布圖?？芍?未分類的細(xì)菌群(Unclassified),在兩種生境中均占比很大,分別占17.04%和24.48%,說明土壤中還有許多未可培養(yǎng)的細(xì)菌。除了這類細(xì)菌外,變形菌門(Proteobacteria)在兩種生境中均是豐度第一的優(yōu)勢細(xì)菌,在新茬土壤中與重茬土壤中豐度分別占51.39%和50.44%;其次是擬桿菌門(Bacteroidetes),分別占17.09%和13.21%;另外,疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)在兩種生境中的豐度值均高于1%。新茬土壤中豐度值高于1%的還有酸桿菌門(Acidobacteria,2.23%)和綠彎菌門(Chloroflexi,1.21%)。其余各類群所占比例較少。

圖1 新茬土門水平細(xì)菌豐度占比分布圖

圖2 重茬土門水平細(xì)菌豐度占比分布圖

2.1.3 屬水平上上豐富度差異分析

從屬水平看,新茬土壤中共涉及到831個屬,豐度值高于1%的屬有17個。重茬土壤中共涉及到817個屬,豐度值高于1%的屬有15個。說明新茬土中細(xì)菌多樣性高于重茬土。圖3展示了新茬土壤與重茬土壤優(yōu)勢細(xì)菌類群豐度分布?？梢?在各屬上,兩種生境中豐富度含量也有差異:在新茬土中,豐度最高的前3位是鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、根瘤菌(Rhizobium)、假單胞菌(Pseudomonas),豐度值分別占6.16%、5.28%、4.91%;在重茬土中,豐度最高的前3位是節(jié)桿菌(Arthrobacter)、Olivibacter、根瘤菌,豐度值分別占16.22%、8.20%、6.14%。與新茬土相比,重茬土中鞘氨醇單胞菌、地桿菌(Pedobacter)和Skermanella豐度顯著降低,分別由6.16%、4.78%和4.26%降低為2.33%、0.09%和0.66%;重茬土中節(jié)桿菌和腸桿菌(Enterobacter)豐度顯著升高,分別由4.78%、1.34%升高為16.22%、5.86%。

圖3 新茬土壤(XJS1)與重茬土壤(CJS1)優(yōu)勢細(xì)菌類群屬水平豐度分布圖注:XJS1指新茬大棚土壤;CJS1指重茬大棚土壤。

2.2 真菌多樣性分析

2.2.1 多樣性指標(biāo)

新茬大棚土壤中共獲得23 377條序列,分歸于795個OTUs;3年重茬大棚土壤中共獲得22 484條序列,分歸于881個OTUs。表2展示了兩種大棚土壤的真菌多樣性指數(shù),可見,重茬3年后土壤中真菌類群OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)均升高,Simpson指數(shù)降低,表明重茬3年后土壤中真菌物種多樣性增大。

表2 土壤中真菌的多樣性指數(shù)

2.2.2 門水平上豐富度差異分析

從門水平上看,新茬土壤與重茬土壤中分別檢測到26.87%和5.69%的unclassified和unclassified-Fungi,說明兩種生境中均含有較多的未知菌,但相對而言,重茬土壤中未知菌較少。除此之外,子囊菌門(Ascomycota)為兩種生境中的第一優(yōu)勢菌,新茬土壤中與重茬土壤中豐度分別占61.14%和72.60%;新茬土壤中豐度排名第二的為擔(dān)子菌門(Basidiomycota),占11.36%,該菌在重茬土壤中豐度占比下降為8.57%;兩組差異較大的菌為接合菌門(Zygomycota),該菌在新茬土壤中含量很低,豐度僅占0.54%,但重茬3年后的土壤中該菌豐度快速增長至13.08%。

圖4 新茬土壤(XJS1)與重茬土壤(CJS1)優(yōu)勢真菌類群門水平豐度分布圖注:XJS1指新茬大棚土壤;CJS1指重茬大棚土壤。

2.2.3 屬水平上上豐富度差異分析

圖5是新茬土壤與重茬土壤真菌在屬水平上的聚類條形圖,可以看出兩種生境中的各個樣本各自聚為一類,真菌組成和豐度有明顯的差異。具體來看,新茬土壤中真菌共檢測到94個屬,重茬土壤中真菌共檢測到101個屬。新茬土壤中豐度值高于1%的屬只有8種,而重茬土壤中有14種。說明經(jīng)過3年重茬種植草莓后,土壤中真菌總的多樣性增多,且某些類群真菌大量增加。另外,新茬土壤中unclassified和unclassified_Fungi類群豐度比例總共占65.96%,重茬土壤中這兩大類群占48.72%,二者差異顯著,說明在新茬土中非培養(yǎng)真菌或未被人類分離獲得的真菌比例較高,重茬3年后,土壤中這類真菌比例降低,而人們所熟悉的、已獲得純培養(yǎng)物的真菌種類豐度增高。

圖5 新茬土壤(XJS1)與重茬土壤(CJS1)真菌在屬水平上的聚類圖注:XJS1指新茬大棚土壤;CJS1指重茬大棚土壤。

圖6是新茬土壤與重茬土壤中屬水平上豐度值比例大于1%的優(yōu)勢真菌類群分布圖?？梢?在新茬土壤中占優(yōu)勢的Cadophora、鏈格孢屬(Alternaria)、莖點霉屬(Phoma)、柄孢殼菌屬(Podospora)和Athelia屬真菌在重茬土壤中均不再占優(yōu)勢,Athelia屬在重茬土中沒有被檢測到。取而代之,在重茬土壤中占優(yōu)勢的真菌為青霉菌屬(Penicillium)、被孢霉屬(Mortierella)、枝頂孢屬(Acremonium)、枝孢屬(Cladosporium)、Plectosphaerella、unclassified-Ascomycota、鐮刀菌屬(Fusarium)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、輪枝菌屬(Verticillium)和赤霉菌屬(Gibberella)等。兩種生境中的真菌菌群呈現(xiàn)明顯差異。

圖6 新茬土壤(XJS1)與重茬土壤(CJS1)優(yōu)勢真菌類群屬水平豐度分布圖注:XJS1指新茬大棚土壤;CJS1指重茬大棚土壤。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明,重茬3年后土壤中細(xì)菌數(shù)量減少、真菌數(shù)量上升,這與前人的研究結(jié)果相似。甄文超等研究指出,連續(xù)種植草莓的農(nóng)田土壤微生態(tài)環(huán)境有利于真菌的增殖而不利于細(xì)菌和放線菌,草莓根際和根表微生物真菌種群數(shù)量上升、細(xì)菌和放線菌的增殖減少,最終導(dǎo)致連作障礙發(fā)生[10]。薛超指出重茬土壤微生物從細(xì)菌主導(dǎo)型向真菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)化[11]。

本研究結(jié)果表明,重茬3年后,新茬土壤中豐度最高的鞘氨醇單胞菌被節(jié)桿菌屬取代,腸桿菌屬豐度顯著升高。王志剛從植物根際獲得一株鞘氨醇單胞菌,能高效解磷和分泌IAA,促進連作西瓜生長[12]。另外,很多文獻都指出鞘氨醇單胞菌和節(jié)桿菌與多環(huán)芳烴、苯酚、菲等芳香族污染物的降解有關(guān)[13-15]。而腸桿菌具有緩解鎘-砷富集對植物的脅迫[16]、降解植物的次生代謝產(chǎn)物縮合單寧(原花青素)[17]、降解除草劑阿特拉津的功能[18, 19]。因此,這可能暗示該園區(qū)土壤中有有機物污染。

本研究發(fā)現(xiàn),重茬3年后的土壤真菌優(yōu)勢菌與新茬土壤大相徑庭。原來在新茬土壤中占優(yōu)勢的真菌豐度值大幅下降,而新崛起的豐度值增高的真菌大多與植物病害發(fā)生相關(guān)。比如重茬土壤中占優(yōu)勢的絲核菌能引起多種植物(包括草莓)的黑根病、立枯病、葉腐病、莖腐等病害,是植物真菌病害防治的主要對象,也是草莓產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的病害之一[20];輪枝菌屬導(dǎo)致黃萎病[21];鐮刀菌屬可危害多種植物,破壞植物的維管束系統(tǒng),引起植物萎蔫死亡和器官腐爛,是生產(chǎn)上防治最艱難的土傳病害之一,在草莓上可引起枯萎病[22]。另一類占據(jù)優(yōu)勢地位的菌是營腐生生活的菌屬,比如青霉菌和接合菌,這類菌常生長在腐爛的蔬菜、水果、肉類和各種潮濕的有機物上。由此可以推測:重茬3年的草莓地土壤中積累了相當(dāng)數(shù)量的植物病原菌,殘枝敗葉的積累養(yǎng)育著一批腐生菌,土壤真菌環(huán)境不容樂觀。另外,值得注意的是,該園區(qū)新茬土壤中檢測到優(yōu)勢菌鏈格孢菌和莖點霉屬細(xì)菌,鏈格孢菌能夠引起植物黑斑病、腐爛病等,也能引起草莓采后黑腐病[23];莖點霉菌寄主廣泛,能夠引起多種植物葉斑病、莖枯病等,其中部分種是檢疫性植物病原菌[24],提示該地塊雖然是第1年栽種草莓,但前茬作物留下的病原菌也不容忽視。

綜上所述,對于細(xì)菌來講,重茬3年后土壤中細(xì)菌物種多樣性及豐富度降低;變形菌門和擬桿菌門是兩種生境中的優(yōu)勢細(xì)菌;在屬水平上,新茬土中,豐度最高的前3位是鞘氨醇單胞菌、根瘤菌和假單胞菌,而在重茬土中,豐度最高的前3位是節(jié)桿菌、Olivibacter和根瘤菌;與新茬土相比,重茬土中鞘氨醇單胞菌、地桿菌和Skermanella豐度顯著降低,而節(jié)桿菌和腸桿菌豐度顯著升高。對于真菌來講,重茬3年后土壤中真菌物種多樣性增大;在門水平上,子囊菌門為兩種生境中的第一優(yōu)勢菌;接合菌門在新茬土壤中含量很低,但重茬3年后的土壤中該菌豐度快速增長;在屬水平上,新茬土壤中含有植物病原菌鏈格孢菌和莖點霉菌,重茬3年后枝頂孢屬、被孢霉屬、鐮刀菌屬等病原菌大量積累。因此,重茬土壤中細(xì)菌多樣性降低、真菌多樣性增高,病原真菌積累是引起草莓連作障礙的主要原因。