石永倩 張?zhí)觳?/p>

【摘 要】為了驗證采用分光光度法測定嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿含量方法的準(zhǔn)確性與可靠性，判斷測定結(jié)果是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求，文章采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》中的方法測定乳品中左旋肉堿的含量，并根據(jù)《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》中的相關(guān)規(guī)定對其線性、線性范圍、檢出限、定量限、精密度、回收率6個參數(shù)進(jìn)行驗證。

【關(guān)鍵詞】左旋肉堿;脂肪代謝;方法驗證;適用性

【中圖分類號】TS252.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1674-0688（2021）12-0025-03

左旋肉堿，別名L-肉堿或維生素BT，分子式C7H15NO3，是一種白色晶體或者白色透明粉末，易溶于水、酒精和堿性溶液，200 ℃以上熔化分解。左旋肉堿是由俄國科學(xué)家Gulewitsch和Krimberg在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的。左旋肉堿是參與生物體新陳代謝的重要物質(zhì)，具有多種生理功能。奶粉中的左旋肉堿是促進(jìn)奶粉中的脂肪分解、代謝和供能的重要營養(yǎng)素，同時能促進(jìn)體內(nèi)的脂肪轉(zhuǎn)化為能量，屬于一種類氨基酸類的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。人體內(nèi)的左旋肉堿主要來源于羊肉、牛肉、豬肉等紅色肉類，奶粉中適量添加左旋肉堿對人體無害，可以促進(jìn)體內(nèi)脂肪代謝和利用。嬰幼兒飲食結(jié)構(gòu)比較單一，主要飲食來源為各種乳制品，主要的能量來源為乳制品中的脂肪，寶寶體內(nèi)缺乏左旋肉堿，導(dǎo)致脂肪的利用率下降，不利于寶寶體格發(fā)育，添加左旋肉堿可以提高寶寶對奶粉中脂肪的利用率[2]。

本文研究的目的在于通過對方法的線性、線性范圍、檢出限、定量限、精密度、回收率6個指標(biāo)進(jìn)行驗證，證明采用這種檢測方法測定嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的可行性[3]。

1 試驗方法——《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定》（GB 29989—2013）

1.1 原理概述

將樣品中的蛋白質(zhì)用高氯酸溶液沉淀，過濾后的濾液用氫氧化鉀溶液皂化，使左旋肉堿游離。在乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，游離的左旋肉堿和乙酰輔酶A反應(yīng)生成乙酰肉堿和游離的輔酶A。輔酶A和顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，可從工作曲線上查得相應(yīng)的質(zhì)量濃度，據(jù)此計算樣品中左旋肉堿的含量。

1.2 試驗用品

1.2.1 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品

13%的高氯酸溶液（HClO4）;4 mol/L的氫氧化鉀溶液（KOH）;10 mol/L的氫氧化鈉溶液（NaOH）;2-硝基苯甲酸;N-2-羥乙基哌嗪-2-乙烷磺酸;乙二胺四乙酸二鈉;乙酰輔酶A（CoA）;乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶（CAT）。其中，乙酰輔酶A（CoA）和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶（CAT）需要在2～8 ℃的環(huán)境中保存。試驗用水均為三級水，所用試劑均為分析純。左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品（C7H15NO3）：純度≥98%。

1.2.2 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

配制濃度為80 g/mL的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液：將左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品在（102±2）℃的烘箱中烘干2 h后冷卻至室溫，稱取20 mg（精確至0.1 mg）放入小燒杯中，用三級水溶解放入250 mL容量瓶中并定容搖勻。

配制左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液放入25 mL的容量瓶中，用三級水定容混勻。注意現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 儀器和設(shè)備

分析天平（型號：AL207-IC）：購于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，感量為0.1 mg;pH計（型號：PB-10）：購于賽多利儀器（北京）有限公司，精度為0.01;離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥1 500 r/min;恒溫水浴鍋：溫度可控制在（40±2）℃;分光光度計（型號：TU-1901）。

1.4 分析過程

1.4.1 樣品預(yù)處理

在小燒杯中稱取5 g（精確至0.1 mg）奶粉樣品，用30 mL、40 ℃的水溶解至100 mL的容量瓶中。高氯酸溶液加10 mL后，上下混合均勻，靜置20 min。用三級水定容后混勻，用定量濾紙過濾至100 mL的三角瓶中。

吸取20 mL濾液于50 mL的小燒杯中，用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)濾液的pH值，當(dāng)pH值達(dá)到12.5～13.0，放入40 ℃水浴鍋中60 min。經(jīng)冷卻后，用高氯酸調(diào)節(jié)pH達(dá)到7.0～7.5。小心地轉(zhuǎn)入50 mL的容量瓶中，定容混勻，放入4 ℃的冰箱過夜。用時取出放置至室溫后，用注射器吸取上清液用濾膜過濾待用。

1.4.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

在2個1 cm的比色皿中分別吸取2.0 mL的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別加入0.8 mL的顯色工作液和100μL的CoA溶液混勻，放入分光光度儀中，在412 nm的波長下5 min后進(jìn)行歸零。在外槽的比色皿中加入100μL的CAT溶液混勻，反應(yīng)10 min后比色。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值[4]。

1.4.3 測定樣品

按照步驟“1.4.2”測定處理好的樣液的吸光值，查得樣液濃度。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理

樣品中左旋肉堿含量為X，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)mg/100 g表示，按照如下公式計算：

? ? ?X=×100

上式中：c為查得的樣液濃度，單位為μg/mL;V為濾液體積，單位為mL;m為樣品質(zhì)量，單位為g。

2 方法驗證參數(shù)

2.1 線性和線性范圍

左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度為80μg/mL。吸取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、5 mL的左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液定容到25 mL，經(jīng)過計算，該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中左旋肉堿的質(zhì)量濃度分別為1.6μg/mL、3.2μg/mL、6.4μg/mL、9.6μg/mL、16μg/mL。以左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程結(jié)果見表1。

2.2 檢出限和定量限

左旋肉堿的檢出限采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法評估，即通過分析大量（n≥10）樣品空白確定檢出限（LOD）。本次實驗通過10次樣品空白獨立測試，計算出檢測結(jié)果的算數(shù)平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）確定檢出限（LOD）。計算公式如下：

LOD=X+3S

上式中：LOD為方法檢出限（mg/100 g）;X為10次獨立空白平均值;S為10次獨立空白標(biāo)準(zhǔn)偏差。

定量限（LOQ）的確定主要是從其可信性考慮，為了增加數(shù)據(jù)的可信性，將10倍的檢出限作為本檢驗方法的定量限。實驗結(jié)果見表2。

當(dāng)樣品稱樣量為5.000 0 g時，該方法的檢出限為0.187 mg/100 g，定量限為1.87 mg/100 g。

2.3 精密度

本實驗進(jìn)行精密度驗證，選取1個嬰幼兒配方奶粉樣品進(jìn)行7次重復(fù)性測定，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明：經(jīng)重復(fù)性實驗得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.77%，符合（GB/T 27417—2017）的要求。

2.4 回收率

本實驗的回收率驗證是通過將已知濃度的分析物加入樣品中，使加標(biāo)后樣品中的左旋肉堿濃度分別處于標(biāo)準(zhǔn)曲線的低、中、高3個濃度，按照預(yù)定的分析方法進(jìn)行檢測，計算左旋肉堿的回收率[5]，但嬰幼兒配方奶粉中左旋肉堿含量比較高，無法達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)曲線低濃度范圍，故加標(biāo)樣A將已知濃度的分析物加到空白中，加標(biāo)樣B、C加入同一樣品中，其結(jié)果見表4。

3 評價與結(jié)論

3.1 評價

3.1.1 曲線線性范圍評價

本方法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.055 92×C+0.000 73，線性范圍為0～16μg/mL，相關(guān)系數(shù)R為1.000 0，方程擬合度好。符合“對于準(zhǔn)確定量的方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99”的規(guī)范要求[6-7]。

3.1.2 檢出限和定量限評價

采用本檢測方法檢測嬰幼兒食品和乳品中的左旋肉堿，當(dāng)稱樣量為5.000 0 g時，檢出限為0.187 mg/100 g，定量限為1.87 mg/100 g，低于國標(biāo)GB 29989—2013中的檢出限，即2 mg/100 g，符合要求[6，8]。

3.1.3 精密度評價

本實驗通過對同一樣品進(jìn)行7次測定，得到重復(fù)性實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.77%，符合GB/T 27417—2017的要求。

3.1.4 回收率評價

通過對樣品的加標(biāo)實驗，測得加標(biāo)平均回收率分別為96.4%、94.95%、98.3%。符合GB/T 27417—2017附錄A中方法回收率偏差范圍要求[9]。

3.2 結(jié)論

此次方法驗證中，儀器設(shè)備均經(jīng)過檢定并在有效期內(nèi)，檢測方法有效，實驗過程未受到其他干擾，檢測結(jié)果真實準(zhǔn)確。通過對左旋肉堿方法的驗證，各項指標(biāo)均符合實驗需求，故本試驗方法能準(zhǔn)確測定嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的含量。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]高澤岳，張雨桐，王璐，等.左旋肉堿在食品檢測中的研究新進(jìn)展[J].吉林農(nóng)業(yè)，2019，42（5）：83-88.

[2]劉瑛，唐延彬，秦虹.嬰兒配方奶粉中左旋肉堿添加量的研究進(jìn)展[J].母嬰世界，2019，5（10）：292-294.

[3]向忠權(quán)，蒲國榮，韋志明，等.左旋肉堿的合成與應(yīng)用[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2017，42（2）：15-21.

[4]GB 29989—2013，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的測定[S].

[5]黃玲珠，龐恩，李庚.保健品中鉻測定的方法學(xué)驗證[J].食品安全導(dǎo)刊，2018（133）：174-176.

[6]王丹.嬰幼兒食品中肉堿對映體的含量分析與評價[D].青島：青島大學(xué)，2017.

[7]何玉芳.UPLC-MS/MS法測定嬰幼兒乳粉中左旋肉堿含量的研究[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[8]王冬梅，楊明，邱肖依，等.分光光度法和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測奶粉中的左旋肉堿[J].食品工業(yè)，2020，42（3）：45-49.

[9]張海紅，田洪蕓，王文特，等.分光光度法檢測特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方乳粉中的左旋肉堿[J].中國乳品工業(yè)，2020，42（9）：189-195.