王艷雙，姜海瀛，劉美琳，高麗君，李明成, 3，孫麗媛，張麗華，艾金霞, 3*

中藥材鹿心分子鑒定方法及檢測試劑的研究

王艷雙1, 3，姜海瀛2，劉美琳1，高麗君2，李明成2, 3，孫麗媛2，張麗華4，艾金霞2, 3*

1. 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013 2. 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013 3. 北華大學(xué) 吉林省中藥DNA指紋檢測技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林 132013 4. 吉林雷寧食品藥品檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，吉林 吉林 132013

建立中藥材鹿心DNA指紋鑒定方法，研發(fā)鹿心DNA檢測試劑盒。以梅花鹿和馬鹿mtDNA基因作為靶基因，設(shè)計小片段特異性引物，研制鹿心DNA提取及PCR檢測試劑；應(yīng)用分子克隆及測序技術(shù)，克隆鹿心對照藥材；并對試劑的特異性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及靈敏度進行考察；對市售鹿心樣品進行真?zhèn)舞b定。自主研發(fā)的試劑提取鹿心的DNA濃度純度均達到PCR的要求；在退火溫度為63 ℃時引物的特異性最強；克隆測序后的鹿心DNA序列與鹿心mtDNA特異指紋區(qū)段序列一致；自主研發(fā)的試劑重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，靈敏度達到0.5%；對市售30個鹿心樣品進行檢測，偽品率為40%。建立的鹿心DNA指紋鑒定方法特異、準確、可靠，研制的鹿心DNA檢測試劑盒操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定。

鹿心；DNA指紋鑒定；DNA檢測試劑盒；分子克?。粶y序技術(shù)

鹿心為為哺乳綱偶蹄目鹿科鹿屬動物梅花鹿Temminck或馬鹿Linnacus的心臟[1]。鹿心為吉林省的習用藥材，收載在《吉藥管注字》［2000］第132號。傳統(tǒng)中醫(yī)認為鹿心具有養(yǎng)氣補血、安神的功效，以鹿心為主要原料的“心腦康膠囊”（國藥準字號Z20063078），用于冠心病、心絞痛及腦動脈硬化癥療效顯著[2-3]。由于鹿心藥效獨特，療效確切，其市場價格也較高，大量偽品和混淆品（多為性狀相似的豬心、馬心、牛心、羊心等）以假亂真現(xiàn)象嚴重，影響著人們的生命安全。

中藥材傳統(tǒng)的鑒定方法包括基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定，容易受主觀因素及加工炮制的影響[4]，市售鹿心多為炮制過的干燥品，目前，鹿心尚無法定的質(zhì)量標準，亦無明確的功效成分，很難通過傳統(tǒng)方法進行鑒定。中藥材品種的差異性歸根結(jié)底是由物種的遺傳物質(zhì)DNA的不同引起的，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，依據(jù)DNA在不同生物個體的差異來鑒別生物物種的分子鑒定技術(shù)正逐步成為中藥鑒定的主要手段?！吨袊幍洹?020年版一部收錄了川貝母、烏梢蛇、金錢白花蛇以及蘄蛇的分子鑒定方法[5-8]。植物類中藥材如紫蘇、獨活、西洋參、當歸、絞股藍、紅景天、浙貝母等的分子鑒定有相關(guān)文獻報道[9-15]，鹿源類中藥材的分子鑒定如鹿茸、鹿血、鹿鞭、鹿胎的研究也有相關(guān)報道[16-19]，但是鹿心的分子鑒定及檢測試劑的研究未見相關(guān)報道。

因此，本研究利用鹿心、豬心、馬心、牛心、羊心、驢心在DNA水平上的差異，以梅花鹿和馬鹿線粒體DNA細胞色素b（mtDNA）基因為靶基因設(shè)計小片段的特異性引物，采用PCR技術(shù)、分子克隆及測序技術(shù)，建立中藥材鹿心DNA指紋鑒定方法，在此基礎(chǔ)上開發(fā)出鹿心DNA檢測試劑盒，在分子水平上為鹿心真?zhèn)舞b定提供一種標準化、規(guī)范化的檢驗方式。

1 材料與儀器

1.1 材料

鹿心對照藥材、鹿心干燥樣品（梅花鹿鹿心1、2，馬鹿鹿心1、2，60～80 ℃烘烤）均由白城市食品藥品檢驗所提供，豬心、馬心、牛心、羊心、驢心購自吉林市食品市場（60～80 ℃烘烤后備用）。DL100bp Marker、DNA回收試劑盒、pGM-T載體連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、氨芐青霉素（Ampicillin， Amp）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β--半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β--galactoside- gal）、異丙基-β--硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl- β--thiogalactopyranoside，IPTG）、2×Taq PCR Master Mix均購自北京天根生化科技有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成。市售鹿心樣品信息見表1。

1.2 儀器

D3024R型高速冷凍離心機（SCILOGEX公司，美國）；D1008E型掌上離心機（大龍創(chuàng)興實驗儀器有限公司）；T100型PCR儀（美國BIORAD公司）；電泳儀、電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；UV WHITE-2020D型紫外凝膠成像分析儀（美國BIORAD公司）；微量核酸蛋白分析儀：美國Quawell（6000＋）；千分之一的電子天平、萬分之一的電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；ZKW-C型恒溫水浴鍋（上海樹立儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 鹿心DNA提取檢測試劑盒的設(shè)計

試劑盒為20次用量，由7部分組成，包括DNA提取和PCR擴增（表1）。

表1 自主研發(fā)DNA提取及PCR檢測試劑盒的組成及特征

2.2 基因組DNA的提取及質(zhì)量鑒定

2.2.1 自主研發(fā)的試劑盒法提取的基因組DNA取供試樣品5 g，置乳缽中，充分研磨使成粉末，取樣品粉末100 mg置1.5 mL離心管中；加入P1細胞裂解液500 μL［1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）1 mL，0.5 mol/L EDTA 2 mL，NaCl 0.58 g，10% SDS 10 mL，20 mg/mL蛋白酶K 1 mL，加雙蒸水定容至100 mL；RNA 酶 5 μL］，充分混勻，在55 ℃水浴保溫1 h；加到DNA純化柱中，10 000 r/min離心3 min，棄去過濾液，加入P2洗脫液600 μL［5 mol/L KAc 26 μL，l mol/L Tris-HCI（pH 7.5）18 μL，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）3 μL，無水乙醇 480 μL，無菌雙蒸水73 μL］，10 000 r/min離心1 min；棄去過濾液，反重復(fù)洗脫2次，棄去過濾液，再離心2 min；將DNA純化柱轉(zhuǎn)移入另一離心管中，加入P3無菌雙蒸水100 μL，室溫放置10～20 min后，10 000 r/min離心2 min；離心液即供試品DNA溶液，置?20 ℃保存?zhèn)溆?。另取鹿心陽性對照藥?00 mg，同法制成陽性對照藥材模板DNA溶液。

2.2.2 基因組DNA濃度及純度的測定 將上述提取的模板DNA原溶液1 μL，加樣到微量核酸蛋白分析儀的加樣孔上，使用計算機分析軟件自動呈現(xiàn)出260 nm和280 nm的吸光度（）值、核酸的純度（260/280）值以及核酸濃度值（260×50 ng/μL）。

2.3 PCR擴增對鹿心引物特異性的檢測

以“2.1”項提取的DNA為模板，利用鹿心基因特異性鑒別引物F：5’-TCATCGCAGCAC- TCGCTATAGTACACT-3’，R：5’-ATCTCCAAGC- AGGTCTGGTGCGAATAA-3’，擴增片段長度為194 bp，利用自主研發(fā)的試劑盒進行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包括23 μL反應(yīng)體系（PCR反應(yīng)管內(nèi)包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，Primer F（12.5 μmol/L）1 μL，Primer R（12.5 μmol/L）1 μL，ddH2O：8.5 μL）和DNA模板2 μL。利用梯度PCR儀，反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性 5 min，循環(huán)反應(yīng)30次（94 ℃、30 s，55～65 ℃、30 s，72 ℃、30 s），延伸72 ℃、5 min。另取無菌ddH2O，作為空白對照。并同時利用基因通用引物[14]正向：5’-TACCATGAGGAC- AAATTACATTCTG-3’，反向：5’-CCTCCTAGTT- TGTTAGGGATTGATCG-3’，進行PCR擴增，擴增片段長度約500 bp。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5min，循環(huán)反應(yīng)34次（94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、30 s），延伸72 ℃、5 min。PCR擴增結(jié)束后，使用1.5%瓊脂糖凝膠檢測PCR結(jié)果。

2.4 鹿心對照藥材的克隆及測序

取50 μL鹿心對照藥材的特異性PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收純化目的基因；將目的基因與pGM-T載體連接，16 ℃過夜，組成重組子；碎冰上將重組子轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，增殖4 h后取菌液30 μL涂布于含Amp、-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜，進行藍-白斑篩選陽性重組子；挑選白色菌落，放入含Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h，次日提取質(zhì)粒DNA進行PCR擴增驗證為陽性重組體，送至上海生工進行測序。樣品均采用正、反2個引物雙向測序，測序結(jié)果分別與每一個樣品靶基因進行比對分析。擴增區(qū)域DNA序列與靶基因特異性指紋區(qū)段DNA序列同源性為100%，確定為鹿心DNA陽性標準對照液。

2.5 DNA提取試劑的性能評價

2.5.1 重現(xiàn)性試驗 選取鹿心正品和同一批次的提取DNA試劑，分別在3個實驗室，由3位技術(shù)人員提取基因組DNA，每人重復(fù)5次，對DNA的完整性、濃度及純度進行分析，觀察DNA提取試劑的重現(xiàn)性。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 利用SPSS17.0分析軟件，對重現(xiàn)性分析所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，并計算RSD，觀察DNA提取試劑的穩(wěn)定性。

2.6 PCR檢測試劑的性能評價

2.6.1 特異性試驗 對鹿心正品及其易混品基因組DNA進行PCR特異性擴增，觀察引物的特異性。

2.6.2 重現(xiàn)性試驗 對鹿心正品及其易混品分別在3個實驗室，由3位技術(shù)人員檢測相同樣品，觀察試劑的重現(xiàn)性。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 隨機挑選1個試劑盒分別在試劑配制的第3、6、9、12個月，對鹿心正品基因組DNA進行PCR特異性擴增，觀察試劑的穩(wěn)定性。

2.6.4 靈敏性試驗 鹿心對照藥材初始樣本量分別為100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mg，提取基因組DNA，進行PCR擴增，檢測瓊脂糖凝膠電泳分析試劑的靈敏度。

2.7 自主研發(fā)的試劑盒檢測市售鹿心樣品

使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測試劑盒，對市售30個鹿心樣品進行真?zhèn)蔚蔫b定，并與白城市食品藥品檢驗所鑒定結(jié)果進行比對。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組DNA的提取及質(zhì)量鑒定結(jié)果

自主研發(fā)試劑提取出鹿心基因組DNA，通過紫外分光光度法測定260/280值在1.7～1.9，計算出的質(zhì)量濃度為120～150 ng/μL，達到PCR實驗的要求（表2）。

表2 鹿心正品及其偽品DNA純度及濃度檢測結(jié)果

3.2 PCR擴增對鹿心引物特異性的檢測

利用特異性引物進行PCR擴增后，鹿心對照藥材和鹿心正品均在194 bp處有1條特異性擴增條帶，偽品及空白對照均無條帶；利用通用引物進行PCR擴增后，大約在500 bp所有的樣品均出現(xiàn)1條條帶，空白對照無條帶（圖1）。

3.3 鹿心標準對照液的克隆及測序結(jié)果

經(jīng)過分子克隆藍-白斑篩選，氨芐陽性平皿出現(xiàn)藍-白菌落（圖2）。挑區(qū)白色菌落培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)特異性引物PCR擴增驗證條帶的位置（圖3）。將鹿心質(zhì)粒DNA送至上海生工進行測序，比對分析結(jié)果顯示，特異性引物擴增區(qū)域DNA序列與梅花鹿基因特異性指紋區(qū)段DNA序列完全一致，同源性為100%，與馬鹿基因特異性指紋區(qū)段DNA序列同源性為96%，與其他偽品序列比對結(jié)果均顯示沒有發(fā)現(xiàn)明顯的相似性。因此將梅花鹿鹿心DNA克隆液確定為鹿心DNA陽性對照液（圖4），裝入鹿心DNA指紋檢測試劑盒中。

圖2 鹿心DNA分子克隆藍--白斑篩選圖

3.4 DNA提取試劑的性能評價

3.4.1 重現(xiàn)性試驗 紫外分光光度法檢測提取的基因組DNA，純度在1.7～1.9，質(zhì)量濃度在130～150 ng/μL。表明自主研發(fā)的鹿心DNA提取試劑重現(xiàn)性良好。

3.4.2 穩(wěn)定性試驗 （1）組內(nèi)分析：第1組基因組DNA的純度（1.789±0.029），RSD為1.60%，DNA的質(zhì)量濃度（148.190±2.219）ng/μL，RSD為1.49%；第2組基因組DNA的純度（1.778±0.040），RSD為2.28%，DNA的質(zhì)量濃度（141.070±2.837）ng/μL，RSD為2.01%；第3組基因組DNA的純度（1.809±0.031），RSD為1.74%，DNA的質(zhì)量濃度（147.78±3.930）ng/μL，RSD為2.66%。（2）組間分析：基因組DNA的純度（1.792±0.035），RSD為1.96%，DNA的質(zhì)量濃度（145.68±4.510）ng/μL，RSD為3.10%?？梢姛o論組內(nèi)和組間的標準差和RSD都很小，表明各組數(shù)據(jù)非常接近，離散度非常低。證實自主研發(fā)的鹿心DNA提取試劑穩(wěn)定性良好。

圖4 鹿心質(zhì)粒DNA測序與梅花鹿mtDNA Cytb基因比對結(jié)果

3.5 PCR檢測試劑的性能評價

3.5.1 特異性試驗 使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測試劑盒進行試驗，鹿心對照液（A）、鹿心對照藥材（B）和鹿心樣品均在194 bp處有1條特異性擴增條帶，而豬心、牛心、馬心、羊心、驢心及空白對照均未出現(xiàn)擴增條帶。

3.5.2 重現(xiàn)性試驗 使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測試劑盒，由3個實驗室的3個技術(shù)人員進行試驗，鹿心對照液、鹿心對照藥材和鹿心樣品均在194 bp處有一條特異性擴增條帶，而豬心、牛心、馬心、羊心、驢心樣品及空白對照均未出現(xiàn)擴增條帶。

3.5.3 穩(wěn)定性試驗 使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測試劑盒進行試驗，試劑配制后的3、6、9、12個月鹿心對照液、鹿心對照藥材和鹿心樣品均在194 bp處有1條特異性擴增條帶，而空白對照未出現(xiàn)擴增條帶。

3.5.4 靈敏度試驗 使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測試劑盒進行試驗，隨著樣品取樣量的減少，PCR產(chǎn)物條帶的亮度逐漸降低，取樣量為0.5 mg時，PCR產(chǎn)物條帶清晰可見，取樣量低于0.5 mg時，PCR產(chǎn)物條帶均隱約可見模糊不清。因此，自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測試劑盒檢測的靈敏度為0.5%。

3.6 自主研發(fā)的試劑盒檢測市售鹿心樣品檢測結(jié)果

使用自主研發(fā)的鹿心DNA指紋檢測試劑盒進行檢測，市售30個鹿心樣品，18個是正品（有特異條帶），12個是偽品（無特異條帶），偽品率為40%。與白城市食品藥品檢驗所鑒定結(jié)果一致（圖5）。

M-Marker P-鹿心陽性對照液 1～30-同表1樣品編號 N-空白對照

4 討論

中藥材基原真?zhèn)舞b別是中藥學(xué)研究領(lǐng)域中的重要研究方向和首要問題，中藥材是否“正本清源”直接影響到用藥安全。對中藥材基原鑒別可以從源頭上控制中藥的質(zhì)量，對保障中藥生產(chǎn)和中藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展起到舉足輕重的作用[20]。

線粒體DNA作為細胞核外遺傳信息載體，具有結(jié)構(gòu)簡單、不含間隔區(qū)、不含內(nèi)含子、無重復(fù)序列、母系遺傳、進化速度快等特點，是研究物種群體分子分類、遺傳結(jié)構(gòu)、分子系統(tǒng)發(fā)育的理想分子標記[21-22]。Cytb是線粒體DNA唯一參與線粒體呼吸鏈電子傳遞的細胞色素，Cytb進化速度適中，含有豐富的SNP位點，結(jié)構(gòu)相對保守，適用于動物種屬間差異和進化關(guān)系的研究分析[23-26]。作為有效的分子遺傳學(xué)標記是目前研究的熱點，極大地彌補了傳統(tǒng)鑒定的不足。

本研究考慮干燥鹿心樣品是經(jīng)高溫烘烤而成，會導(dǎo)致DNA降解嚴重，同時根據(jù)各樣品基因SNP位點的差異，設(shè)計小片段194 bp的特異性引物進行PCR擴增，在退火溫度為63 ℃時引物特異性最強，引物只與鹿心的基因的指紋區(qū)段特異性結(jié)合，擴增出大量的產(chǎn)物，在194 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶；但是，在此溫度時，引物不會與其他偽品的指紋區(qū)段結(jié)合，因此偽品與空白對照均無條帶。利用鹿心基因特異性引物，只要優(yōu)化好引物的退火溫度，就可以準確地鑒定出鹿心的真?zhèn)?。而如果是通用引物進行擴增，正品與偽品均會出現(xiàn)一樣的條帶，無法區(qū)分，就必須進行聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，RCP-RFLP）。如果就是用來區(qū)分鹿心與不同種屬的偽品，本研究建立的鑒定方法簡單易行，結(jié)果準確可靠，完全可以區(qū)分。但是如果區(qū)分同種屬的樣本如梅花鹿鹿心與馬鹿鹿心，那么RCP-RFLP還是很有優(yōu)勢的，如王鳳霞等[16]對鹿血的PCR-RFLP鑒定研究。因為本研究樣品鹿心指的就是梅花鹿與馬鹿的心臟，所以不用細分，因此本研究建立的鹿心DNA指紋鑒定方法只要與不同種屬的偽品區(qū)分開來即可。

運用DNA序列分析對比法對未知樣品是否屬于某一特定物種是最可靠的，最令信服的鑒定方法[27-28]。為了驗證引物的特異性以及擴增的特異性基因片段序列的正確性，對鹿心對照藥材特異性PCR擴增片段進行克隆和基因序列測定，比對結(jié)果與梅花鹿特異的指紋區(qū)段DNA序列完全一致，同源性為100%；與馬鹿特異的指紋區(qū)段DNA序列同源性高達96%，有8個堿基存在差異，表明在種的水平上該指紋區(qū)段進化是保守的；而與其他偽品序列比對均顯示沒有明顯的相似性。表明本研究建立的鹿心DNA指紋鑒定方法具有特異性、可行性和可靠性，并且驗證了如果是同種屬樣本的鑒定RCP-RFLP的優(yōu)勢。因此將梅花鹿鹿心克隆液作為鹿心對照液裝進試劑盒中。

本研究根據(jù)建立了鹿心DNA指紋鑒定方法，進而研制出鹿心DNA指紋檢測試劑盒，從特異性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及靈敏度4個方面進行評價，性能良好。并且對市售30個鹿心樣品進行檢測，結(jié)果18個正品，12個偽品，偽品率為40%，實用性強。本試劑盒，包括DNA提取試劑、PCR檢測試劑和陽性對照藥材DNA克隆液，只需按照操作流程約4 h就可以快速、準確地完成鹿心真?zhèn)蔚蔫b定，實現(xiàn)了鹿心分子鑒定的標準化和規(guī)范化，達到可以推廣的條件。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on molecular identification method and detection reagent of Chinese medicinal materials deer heart

WANG Yan-shuang1,3, JIANG Hai-ying2, LIU Mei-lin1, GAO Li-jun2, LI Ming-cheng2,3, SUN Li-yuan2, ZHANG Li-hua4, AI Jin-xia2,3

1. Medical College, Beihua University, Jilin 132013,China 2. School ofMedical Technology, Beihua University, Jilin 132013,China 3. Chinese Medicine DNA Fingerprint Detection Technology Innovation Center, Beihua University, Jilin 132013, China 4. Jilin Leining Food and Drug Testing Technology Service Co., Ltd., Jilin 132013, China

To establish a DNA fingerprint identification method for Chinese medicinal materials deer heart and develop DNA detection kit for deer heart.Using the mtDNAgene ofandas the target gene, small fragment specific primers were designed and used to develop the deer heart DNA extraction reagent and PCR detection reagent. Using molecular cloning and the sequencing technology,standard materials to deer heart was cloned. And then the specificity, reproducibility, stability and sensitivity of the reagent was investigated. Finally the authenticity of the commercial deer heart samples was verified.The concentration and purity of DNA extracted by the self-developed reagent reached the requirement of PCR. The specificity of the primer was the strongest when the annealing temperature was 63 ℃. The DNA sequence of deer heart after cloning was consistent with the specific fingerprint section of sika deer heart mtDNAgene. Self-developed reagent had good reproducibility, stability and sensitivity up to 0.5%. Thirty baked deer heart samples for sale were tested and the rate of counterfeitwas 40%.The DNA fingerprint identification method of deer heart established in this study is specific, accurate and reliable. The DNA detection kit for deer heart which developed in this study is simple to use and the result is stable.

deer heart; DNA fingerprint identification method; DNA detection kit; molecular cloning; sequencing technology

R282.2

A

0253 - 2670(2021)02 - 0544 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.028

2020-06-09

吉林省發(fā)改委項目（2018C048-2）；吉林省科技發(fā)展計劃項目（20180201023YY，20190303093SF，20190301014NY，20200404152YY，20200403047SF）；吉林省科技創(chuàng)新中心建設(shè)項目（20190902018TC）

王艷雙，女，博士，副教授，研究方向為食品及藥品DNA指紋技術(shù)研究與應(yīng)用。E-mal: wangys5521@163.com

艾金霞，女，碩士，教授，研究方向為食品及藥品DNA指紋技術(shù)研究與應(yīng)用。E-mal: 1047085280@qq.com

[責任編輯 時圣明]