羅雪菲，王 偉，趙曉芳，運晨霞，馮秋瑜，駱 飛，高宏君，蘭太進*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桃蓮絞復(fù)方增強全成分腫瘤細胞疫苗抗結(jié)直腸癌作用分子機制

羅雪菲1，王 偉3#，趙曉芳1，運晨霞2，馮秋瑜4，駱 飛2，高宏君1，蘭太進2*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200 3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530012 4. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑤醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討桃蓮絞復(fù)方（Tao-lian-jiao Formula，TLF）增強全成分腫瘤細胞疫苗（Vaccine）抗結(jié)直腸癌作用的分子機制。觀察TLF和全成分腫瘤細胞疫苗單用及聯(lián)合使用對結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠體質(zhì)量和腫瘤質(zhì)量的影響，HE染色觀察腫瘤組織病理變化。通過中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（TCMSP、TCMID），PharmMapper數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫分別收集TLF化學(xué)成分，成分相關(guān)靶點和免疫相關(guān)靶點，對TLF調(diào)控免疫相關(guān)的靶點和通路進行預(yù)測分析。通過實時熒光定量PCR、Western blotting對預(yù)測結(jié)果進行實驗驗證。與模型組比較，TLF組對腫瘤生長無顯著抑制作用，反而表現(xiàn)出促進腫瘤生長的趨勢，抑制率?20.1%；Vaccine組對腫瘤生長亦無顯著抑制作用（＞0.05），但有抑制趨勢，抑制率19.1%；當(dāng)TLF聯(lián)合Vaccine（TLF＋Vaccine）則能顯著抑制腫瘤生長（＜0.05），抑制率達51.4%。通過中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫共收集到TLF所含的57個化學(xué)成分，對應(yīng)570個靶點，同時收集到免疫相關(guān)的168個靶點，比對找到TLF免疫調(diào)節(jié)的潛在作用靶點4個，分子互作后得到24個關(guān)鍵靶點，信號通路（pathway）和基因本體論（Gene Ontology，GO）生物學(xué)過程富集分析結(jié)果提示干擾素γ受體1（interferon gamma receptor 1，IFNGR1）及下游的JAK1/JAK2-STAT1可能是TLF發(fā)揮免疫調(diào)控的關(guān)鍵通路。驗證實驗結(jié)果顯示，與Vaccine組比較，TLF＋Vaccine組腫瘤組織中IFNGR1、磷酸化酪氨酸蛋白激酶-1（phosphorylation of Janus kinase 1，p-JAK1）、磷酸化酪氨酸蛋白激酶-2（phosphorylation of Janus kinase 2，p-JAK2）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，p-STAT1）表達顯著降低（＜0.05），與預(yù)測結(jié)果一致。TLF可增強Vaccine的抗結(jié)直腸癌作用，具有作為一種有效的腫瘤免疫治療佐劑的潛力，其作用機制可能與下調(diào)表達，抑制JAK1/JAK2-STAT1信號通路活性有關(guān)。

桃蓮絞復(fù)方（TLF）；結(jié)直腸癌；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；全成分腫瘤細胞疫苗；IFNGR1-JAK1/JAK2-STAT1信號通路

全成分腫瘤細胞疫苗作為多價抗原，因其豐富的腫瘤蛋白抗原而受到越來越多的關(guān)注。免疫系統(tǒng)可以針對全成分腫瘤細胞疫苗表達的多種腫瘤抗原同時產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而有效避免因腫瘤細胞異質(zhì)性造成的部分腫瘤抗原丟失而引起的免疫治療響應(yīng)率低下問題[1]。雖然全成分腫瘤細胞疫苗可以提供較好的腫瘤抗原來源，但依然存在幾乎所有免疫治療均存在的共性問題，即免疫原性較弱[2]。佐劑是增強疫苗免疫原性的關(guān)鍵，其賦予疫苗若干優(yōu)勢，包括減少所需的抗原數(shù)量，減少正常免疫反應(yīng)所需的免疫次數(shù)，以及誘導(dǎo)更快速、更廣泛和更強的免疫反應(yīng)[3]。目前，多種腫瘤免疫治療佐劑在臨床前期的動物實驗研究中取得了較好的效果[4]?；谠摬呗?，開發(fā)針對全成分腫瘤細胞疫苗的佐劑將為提高其免疫治療效率和增強其抗腫瘤作用起到促進作用。

研究證實，許多補益類中藥如黃芪、人參、冬蟲夏草等具有調(diào)節(jié)免疫功能，在不同疫苗策略下能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞和體液免疫應(yīng)答，發(fā)揮著免疫佐劑活性，可輔助增強抗腫瘤作用[5-6]。隨著對民族醫(yī)藥的發(fā)掘整理，很多民族藥被發(fā)現(xiàn)跟某些中藥有著相同或相似的功效，如壯藥五指毛桃就俗稱為“土黃芪”等。從民族藥這個待開發(fā)的資源庫中挖掘出具有較好效果且作用機制明確的腫瘤免疫治療佐劑值得深入探索和研究。

桃蓮絞復(fù)方（Tao-lian-jiao Formula，TLF）源于廣西壯族民間驗方，由五指毛桃、絞股藍、旱墨蓮、夏枯草4味壯藥材組成，其中五指毛桃、絞股藍益氣補血、健脾護胃為主藥；母藥以旱蓮草滋陰潤燥、滋養(yǎng)龍路；幫藥夏枯草軟堅散結(jié)以助主藥之力。如此主母幫帶配伍，全方共奏提升正氣，調(diào)理“三道兩路”之功，可用于腫瘤患者免疫功能的提高。TLF為壯族民間驗方，能否成為一種全成分腫瘤細胞疫苗佐劑尚待深入研究。為了科學(xué)探討這個問題，本研究采用動物實驗并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究TLF增強全成分腫瘤細胞疫苗抗結(jié)直腸癌作用的效果及其分子機制（實驗流程見圖1），為其后續(xù)開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 TLF增強全成分腫瘤細胞疫苗抗結(jié)直腸癌效果觀察

1.1.1 材料與儀器

（1）儀器：7500型實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems）；Tanon-5200型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；PowerPac Universal型通用電泳儀（美國Bio-Rad）；SCQ-6201型超聲波清洗儀（上海聲彥超聲波儀器有限公司）；BSA224S型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；YRDC-0515型低溫恒溫槽（上海亞榮公司）；DHG-9203A型電熱恒溫干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；HWS-24型水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；UPK-II-20L型優(yōu)普純水制造機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；Centrifuge 5418型臺式離心機（德國Eppendorf）；ST16R型臺式高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher）。

（2）實驗動物及細胞：BALB/c雄性小鼠，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004；小鼠CT26結(jié)腸癌細胞系，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。所有動物實驗遵循相關(guān)動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

（3）藥物及試劑：4味藥材均購自廣西金秀藥材市場，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室滕建北教授鑒定。五指毛桃經(jīng)為桑科植物粗葉榕Vahl.的干燥根，墨旱蓮為菊科植物鱧腸L.的干燥地上部分，絞股藍為葫蘆科植物絞股藍(Thunb.) Makino的干燥全草，夏枯草為唇形科植物夏枯草L.的干燥果穗。絲裂霉素C（MMC，批號A1400）購自上海士鋒生物科技有限公司；總RNA試劑盒（批號EK0411）、Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（EK0411）、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強版（批號EK0411）購自天根生化科技（北京）有限公司；p-JAK1 Rabbit mAb（批號74129）、p-STAT1 Rabbit mAb（批號9167）、p-JAK2 Rabbit mAb（批號3771）、β-Actin Rabbit mAb（批號4970）、Goat anti-rabbit IgG-HRP（批號7074）、Signal Fire? ECL Reagent （批號6883）購自美國CST公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 TLF的制備及劑量設(shè)置 稱取五指毛桃、墨旱蓮、絞股藍、夏枯草（圖2-A）適量，加10倍量水，室溫浸泡0.5 h，武火煮沸后文火繼續(xù)煎煮1 h，提取3次，合并3次濾液，得到TLF藥液，減壓濃縮至每克浸膏生藥量2.0 g，置4 ℃冰箱保存待用。

TLF臨床每日給藥劑量為50 g生藥（按成人體質(zhì)量60 kg計算），即0.833 g生藥/kg。根據(jù)體表面積折算動物等效劑量[7]，設(shè)定小鼠給藥量為臨床日用劑量（0.833 g生藥/kg）的10倍，即8.33 g生藥/kg。實驗時用蒸餾水配制成所需濃度藥液供動物ig給藥，ig容積為20 mL/kg。

1.1.3 CT26全成分腫瘤細胞疫苗的制備 取對數(shù)生長期的CT26細胞，加入MMC至質(zhì)量濃度為100 μg/mL，37 ℃孵育2 h，PBS洗3遍，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為5×105/mL。

sc-皮下注射 ig-灌胃 MMC-絲裂霉素C 與模型組比較：*P＜0.05；與Vaccine組比較：#P＜0.05

1.1.4 荷瘤小鼠動物模型制備、給藥處理及指標(biāo)檢測 將16只小鼠隨機分為4組，每組4只，分別為模型組、TLF組、全成分腫瘤細胞疫苗（Vaccine）組、TLF聯(lián)合全成分腫瘤細胞疫苗（TLF＋Vaccine）組。將MMC處理的CT26細胞注射到不同組小鼠右前肢后方皮下（1×105/只），進行全成分腫瘤細胞疫苗接種，共接種2次，2次接種間隔7 d。第2次全成分腫瘤細胞疫苗接種7 d后，所有小鼠左前肢腋下均sc處于對數(shù)生長期的CT26細胞（1×106/只），建立荷瘤小鼠模型。模型建立后，TLF組和TLF＋Vaccine組給予TLF，8.33 g生藥/kg，連續(xù)14 d。末次給藥后1 h，稱定小鼠體質(zhì)量并通過公式計算體質(zhì)量增長率，異氟烷麻醉小鼠后迅速取出腫瘤組織稱定質(zhì)量，然后將其分成2部分，一部分經(jīng)甲醛固定后進行HE染色用于病理學(xué)觀察，余下部分經(jīng)液氮速凍后用于相關(guān)基因和蛋白分子表達情況的檢測，通過公式計算體質(zhì)量增長率。造模及給藥過程見圖2-B。

體質(zhì)量增長率=(給藥后體質(zhì)量－給藥前體質(zhì)量)/給藥前體質(zhì)量

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫及軟件 TCMID數(shù)據(jù)庫（http//www.megabionet.org/tcmid）；PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）；TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；Pharmmapper數(shù)據(jù)庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）；Pubmed 基因數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）；OMIM數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org/）；DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape3.7.1軟件；Microsoft Excel 2010軟件。

1.2.2 TLF化學(xué)成分的收集 將TLF的五指毛桃、絞股藍、墨旱蓮、夏枯草4味藥材分別錄入TCMID數(shù)據(jù)庫和TCMSP數(shù)據(jù)庫收集TLF的主要化學(xué)成分，以類藥性（drug-like，DL）值≥0.17為化學(xué)成分篩選標(biāo)準(zhǔn)。另外，“補骨脂素（Psoralen）”DL值為0.10，因其含量較高，且作為藥材五指毛桃含量測定成分，同時亦具有多種藥理作用，故在篩選TLF化學(xué)成分時將其納入分析。

1.2.3 TLF組成成分-靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將TLF所含化學(xué)成分Smile數(shù)據(jù)輸入PharmMapper數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘，獲得與TLF各成分直接相關(guān)的靶點，通過Cytoscape構(gòu)建成分-靶點關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 免疫相關(guān)靶點收集 以“Immunity”為關(guān)鍵詞，在OMIM數(shù)據(jù)庫（http://omim.org/）檢索得到免疫相關(guān)靶點，通過Cytoscape構(gòu)建免疫相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 TLF與免疫共有靶點的篩查 對比TLF相關(guān)靶點與免疫相關(guān)靶點發(fā)現(xiàn)二者共有靶點，即是TLF增強全成分腫瘤細胞疫苗抗結(jié)直腸癌作用的可能靶點。

1.2.6 共有靶點PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析 將TLF和免疫共有靶點導(dǎo)入Cytoscape，應(yīng)用插件GeneMANIA進行共有靶點PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析。

1.2.7 共有靶點互作網(wǎng)絡(luò)的信號通路（Pathway）和基因本體論（Gene Ontology，GO）生物學(xué)過程富集 通過DAVID（https://david. ncifcrf.gov/）對TLF與免疫共有靶點互作網(wǎng)絡(luò)進行Pathway和GO生物學(xué)過程富集分析。

1.3 實驗驗證

1.3.1 材料 實驗用儀器和試劑見“1.1.1”項。

1.3.2、、和mRNA表達水平的檢測 各組腫瘤組織勻漿，采用總RNA提取試劑盒提取得到腫瘤勻漿組織總RNA，F(xiàn)ast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，配制反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，////正向引物（10 μmol/L）0.6 μL，////反向引物（10 μmol/L）0.6 μL，cDNA模板1 μL，50×RO×Reference Dye 1 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中進行擴增，采用2?△△Ct分析方法，每個標(biāo)本重復(fù)3次，t值取平均值，、、、為目的基因，為內(nèi)參基因，Vaccine組作為對照組，△t值＝目的基因t值－內(nèi)參基因t值，△△t值＝TLF＋Vaccine組△t值－Vaccine組△t平均值。以Vaccine組目的基因表達量為1，2?△△Ct即為TLF＋Vaccine組相對Vaccine組目的基因表達的倍數(shù)。所用引物見表1。

1.3.3 p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1蛋白表達水平的檢測 Western blotting檢測腫瘤組織中p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1的表達。腫瘤樣品在液氮中研磨，裂解緩沖液中溶解，輔以磷酸酶和蛋白酶抑制劑。用BCA蛋白檢測試劑盒定量測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣品（30 μg）在10% SDS-polyacrylamide凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。5%脫脂乳封閉膜1 h，4 ℃孵育過夜，抗p-JAK1（1∶500）、p-JAK2（1∶500）和p-STAT1（1∶500）抗體。沖洗后，用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶500）在室溫下孵育1 h，使用Tanon-5200型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行化學(xué)發(fā)光觀察，拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TLF增強全成分腫瘤細胞疫苗抗結(jié)直腸癌作用

與模型組比較，TLF＋Vaccine組能顯著抑制腫瘤生長（＜0.05，圖2-C、D），腫瘤抑制率達51.4%，而TLF組和Vaccine組對腫瘤生長均無顯著抑制作用（＞0.05，圖2-C、D），腫瘤抑制率分別為?20.1%和19.1%。從腫瘤抑制率結(jié)果可以看出，單獨采用TLF不僅不能抑制腫瘤生長，反而有促進生長的趨勢；而單獨采用全成分腫瘤細胞疫苗雖然具有抑制腫瘤生長的趨勢，但作用不強。體質(zhì)量增長率指標(biāo)顯示，各組小鼠體質(zhì)量增長無顯著差異（＞0.05，圖2-E）。上述結(jié)果表明，TLF可增強全成分腫瘤細胞疫苗的抗結(jié)直腸癌作用，其作用機制可能與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。

石蠟切片染色結(jié)果（圖2-F）顯示，模型組和TLF組腫瘤細胞排列致密，未見細胞變形，形態(tài)呈球形，體積不等，彌散，染色深。Vaccine組部分腫瘤細胞體積縮小，細胞核染色較淺，觀察到有壞死細胞，腫瘤細胞生長受到一定的抑制。TLF＋Vaccine組腫瘤細胞壞死大、核碎裂、核固縮，說明細胞生長受到嚴(yán)重抑制。石蠟切片染色的病理觀察結(jié)果與腫瘤質(zhì)量比較結(jié)果一致。

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 TLF免疫調(diào)節(jié)靶點預(yù)測結(jié)果 從TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫中收集到TLF所含主要化學(xué)成分57個（表2），其中五指毛桃15個、墨旱蓮16個、夏枯草13個、絞股藍13個、墨旱蓮與五指毛桃共有成分2個，墨旱蓮與夏枯草共有成分2個，絞股藍與夏枯草共有成分1個，3味藥材共有化學(xué)成分1個（圖3-A）；從PharmMapper數(shù)據(jù)庫中收集到50個成分對應(yīng)靶點570個（圖3-B）；通過OMIM數(shù)據(jù)庫收集到168個與免疫相關(guān)靶點（圖3-C）；將收集到的TLF相關(guān)靶點與免疫相關(guān)靶點進行比對，篩選出4個TLF發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的潛在作用靶點（圖3-D）。2.2.2 Pathway和GO生物學(xué)過程富集分析結(jié)果 使用Cytoscape插件GeneMANIA對共有靶點進行互相作用分析，構(gòu)建包含24個靶點的互作網(wǎng)絡(luò)（圖4-A）。通過DAVID數(shù)據(jù)庫，對互作網(wǎng)絡(luò)進行Pathway信號通路富集，預(yù)測得到16條通路（圖4-B），其中前3條分別為inflammatory bowel disease （IBD）、leishmaniasis、JAK-STAT signaling pathway。GO生物學(xué)過程富集，預(yù)測得到19個生物學(xué)過程（圖4-C），其中前3個分別為regulation of interferon- gamma-mediated signaling pathway、interferon-gamma- mediated signaling pathway、positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter。分析結(jié)果提示，TLF可能通過IFNGR1-JAK1/ JAK2-STAT1信號通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而增強全成分腫瘤細胞疫苗抗結(jié)直腸癌作用。

表2 TLF中四味藥材所含化學(xué)成分信息

續(xù)表2

編號成分DL值藥材 27vitamin kDL0.66P. vulgaris L. 28daucosterolDL0.63E. prostrata L. 29daucosterolDL0.63F. hirta Vahl 30ruvosideDL0.63G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 31lacceroic acidDL0.49E. prostrata L. 32wedelolactoneDL0.48E. prostrata L. 33hentriacontanolDL0.46E. prostrata L. 34pentatriacontaneDL0.42F. hirta Vahl 35oleanolic acid-28-O-beta-D- glucopyranosideDL0.41P. vulgaris L. 36methyl chlorogenateDL0.36F. hirta Vahl 37sericosideDL0.35P. vulgaris L. 38rosmarinic acidDL0.35P. vulgaris L. 39tricinDL0.34F. hirta Vahl 40ecliptasaponin dDL0.34E. prostrata L. 41ombuinDL0.34G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 42quercetinDL0.28F. hirta Vahl 43quercetinDL0.28G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 44physcioneDL0.27F. hirta Vahl 45eriodictyol 3'-methyl etherDL0.27G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 46luteolinDL0.25E. prostrata L. 47luteolinDL0.25F. hirta Vahl 48luteolinDL0.25G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 49gypenoside xxviiiDL0.25G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 50kaempferolDL0.24F. hirta Vahl 51emodinDL0.24F. hirta Vahl 52acacetinDL0.24F. hirta Vahl 53gypenoside lDL0.22G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 54apigeninDL0.21E. prostrata L. 55meranzin hydrateDL0.17F. hirta Vahl 56toddaculineDL0.17G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 57psoralenDL0.10F. hirta Vahl

2.3 實驗驗證結(jié)果

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果，對、、、的mRNA表達水平進行了檢測。PCR結(jié)果顯示，與Vaccine組比較，TLF＋Vaccine組的mRNA表達水平顯著降低（＜0.05，圖5-A）；兩組、和mRNA表達水平不具有顯著性差異（圖5-A）。

根據(jù)PCR實驗結(jié)果，得到具有顯著性變化的基因，而可通過磷酸化JAK1/JAK2- STAT1信號通路發(fā)揮作用。因此，采用Western blotting方法對磷酸化蛋白p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1進行了檢測。結(jié)果顯示，與Vaccine組比較，TLF＋Vaccine組p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1蛋白表達水平顯著降低（＜0.05，圖5-B）。

實驗驗證結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果一致。

3 討論

本研究以CT26結(jié)腸癌荷瘤小鼠為模型，考察了TLF單用和聯(lián)合全成分腫瘤細胞疫苗對腫瘤生長的影響。結(jié)果顯示，TLF單獨使用無抗腫瘤作用，相反還有促進腫瘤生長的趨勢；全成分腫瘤細胞疫苗雖然能一定程度上延遲模型小鼠的腫瘤生長，但作用強度較弱。而當(dāng)TLF和全成分腫瘤細胞疫苗聯(lián)合使用時，模型小鼠腫瘤生長受到了顯著抑制。結(jié)果表明，TLF可增強全成分腫瘤細胞疫苗的抗結(jié)直腸癌作用，有潛力作為一種有效的腫瘤免疫治療佐劑。

A-IFNGR1、JAK1、JAK2、STAT1 mRNA表達水平的檢測 B-p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1 蛋白表達水平的檢測，與Vaccine組比較：*P＜0.05

為考察TLF作為佐劑的分子機制，本研究引入了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，初步確定，TLF可能是通過IFNGR1-JAK1/ JAK2-STAT1信號通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而增強全成分腫瘤細胞疫苗抗結(jié)直腸癌作用。IFNGR1是一種膜分子，為IFN-γ的受體，定位于6號染色體，幾乎表達于所有細胞表面[8]。JAK1和JAK2均為JAK家族成員，屬酪氨酸激酶蛋白，對II型干擾素（IFN-γ）傳遞信號起著重要作用[9]。當(dāng)IFN-γ與IFNGR1結(jié)合后，下游信號組件JAK1和JAK2相繼發(fā)生磷酸化，繼而導(dǎo)致STAT1活化形成復(fù)合物，誘導(dǎo)多種免疫分子的表達，如程序性死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）[10]。PDL-1是PD-1免疫抑制檢查點的配體，是腫瘤誘導(dǎo)免疫耐受的主要原因[11]。在全成分腫瘤細胞疫苗激活免疫應(yīng)答的情況下，TLF能通過降低表達，抑制JAK1/JAK2-STAT1信號通路活性，減少免疫抑制檢查點配體PDL-1的表達（圖6），從而促進細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T cell，CTL）對腫瘤細胞的清除。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Molecular mechanism of Tao-lian-jiao Formula (TLF) to enhance anti-colorectal tumor activity of whole tumor cell vaccine based on network pharmacology

LUO Xue-fei1, WANG Wei3, ZHAO Xiao-fang1, YUN Chen-xia2, FENG Qiu-yu4, LUO Fei2, GAO Hong-jun1, LAN Tai-jin2

1. Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, China 2. School of Basic Medical Science, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 3. The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530012, China 4. College of Yao Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China

To explore the molecular mechanism of Tao-lian-jiao Formula (TLF, 桃蓮絞復(fù)方) in enhancing anti-colorectal tumor activity of whole tumor cell vaccine by using network pharmacology.To observe the effects of TLF and whole tumor cell vaccine alone or in combination on the body weight and tumor weight of CT26-bearing mice, and the pathological changes of tumor tissues were detected by H&E staining. The chemical ingredients of TLF, ingredients related targets and immune related targets were collected from traditional Chinese medicine (TCM) databases (TCMSP, TCMID), PharmMapper database and OMIM database, respectively. The targets and pathways related with TLF for regulating immunity were predicted and analyzed. The predicted results were verified by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting.Compared with model group, TLF group had no significant inhibitory effect on tumor growth (＞ 0.05), while showed a tendency to promote tumor growth, with an inhibition rate of ?20.1%; Whole tumor cell vaccine group (Vaccine group) also had no significant inhibitory effect on tumor growth (＞ 0.05), but there was a inhibition rate of 19.1%; And the combination of TLF and whole tumor cell vaccine (TLF＋Vaccine group) could significantly inhibit tumor growth (＜0.05), and the inhibition rate was 51.4%. Through the public databases, 57 ingredients of TLF which corresponding to 570 targets and 168 immune related targets were collected. After comparison, four potential targets of TLF regulating immunity were found, and 24 key targets were obtained after PPI interaction. Pathway signaling and GO biological processes enrichment analysis suggested thatinterferon gamma receptor 1 (IFNGR1) and its downstream JAK1/JAK2-STAT1 may be the key pathways for TLF to regulate immunity. Verification experiment results showed that the expressions of IFNGR1, phosphorylation of Janus kinase 1 (p-JAK1), phosphorylation of Janus kinase 2 (p-JAK2) and signal transducer and activator of transcription 1 (p-STAT1) in tumor tissue of TLF＋Vaccine group were significantly lower than that of vaccine group (＜ 0.05), which was consistent with the predicted results.TLF can enhance the anti-colorectal tumor activity of whole tumor cell vaccine, and has the potential to be an effective adjuvant for tumor immunotherapy. Its mechanism may be related to down-regulating the expression of IFNGR1 and inhibiting the activity of JAK1/JAK2-STAT1 signaling pathway.

Tao-lian-jiao Formula (TLF); colorectal tumor; network pharmacology; whole tumor cell vaccine; IFNGR1-JAK1/JAK2- STAT1 pathway

R285

A

0253 - 2670(2021)02 - 0459 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.020

2020-05-25

廣西中醫(yī)藥民族醫(yī)藥傳承創(chuàng)新專項課題（GZLC16-26）；廣西自然科學(xué)基金項目（2020GXNSFAA238024）；廣西區(qū)教育廳中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目（2017KY0320）

羅雪菲，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事免疫相關(guān)科研、臨床和教學(xué)工作。E-mail: fayluo@163.com。

蘭太進，男，副教授，研究方向為中藥免疫藥理及中藥產(chǎn)品開發(fā)研究。E-mail: lanbo130406@gmail.com。

#并列第一作者：王 偉，男，副主任醫(yī)師。E-mail: wangweizx@163.com。

[責(zé)任編輯 王文倩]