王馨培，王子玉，傅 強(qiáng), 3*，杜 超，鞏傳勇，王 兵

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和多中心臨床數(shù)據(jù)的清肺承氣湯治療腹腔感染所致急性呼吸窘迫綜合征的作用機(jī)制研究

王馨培1，王子玉2，傅 強(qiáng)1, 3*，杜 超4，鞏傳勇5，王 兵6

1. 天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070 2. 湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430015 3. 天津市第四中心醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300140 4. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 急癥部，天津 300193 5. 天津市南開(kāi)醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300102 6. 天津市第一中心醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，天津 300190

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和多中心臨床數(shù)據(jù)探討清肺承氣湯治療腹腔感染所致急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的作用機(jī)制。通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索清肺承氣湯的化學(xué)成分和靶點(diǎn)。采用Cytoscape 3.7.1軟件建立“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)間的蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。從3所醫(yī)院選取27例腹腔感染所致ARDS患者，隨機(jī)分為13例對(duì)照組和14例清肺承氣湯組，分別于治療前后3 d取肺泡灌洗液，微球檢測(cè)法檢測(cè)患者肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素-4（interleukin 4，IL-4）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、白細(xì)胞介素-10（interleukin 10，IL-10）水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡情況。篩選得到清肺承氣湯中78種活性成分，對(duì)應(yīng)63個(gè)潛在靶點(diǎn)；“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)度值靠前的靶點(diǎn)為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、IL-6、IL-10、γ干擾素（interferon-gamma，INFG），化合物為槲皮素和木犀草素；潛在靶點(diǎn)的KEGG通路排序靠前的炎癥相關(guān)通路為核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（interleukin 17，IL-17）通路、T細(xì)胞受體通路等信號(hào)通路。與對(duì)照組比較，清肺承氣湯組患者肺泡灌洗液中IL-6水平顯著升高（＜0.05），IL-10水平顯著降低（＜0.05），肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡面積顯著降低（＜0.001）。清肺承氣湯中的有效成分可以通過(guò)IL-6、Bcl-2、IL-10、趨化因子配體2（CXC chemokine ligand 2，CXCL2）等靶點(diǎn)參與調(diào)控多條信號(hào)通路來(lái)影響IL-4、IL-6、IL-10分泌和細(xì)胞凋亡，從而治療ARDS。

清肺承氣湯；腹腔感染；急性呼吸窘迫綜合征；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；槲皮素；木犀草素；白細(xì)胞介素；凋亡

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）為重癥監(jiān)護(hù)室的常見(jiàn)病種，死亡率達(dá)到20%～50%[1]。創(chuàng)傷、感染、藥物等均可誘發(fā)ARDS，而對(duì)于外科重癥監(jiān)護(hù)病房中的ARDS患者，嚴(yán)重腹腔感染是最常見(jiàn)的誘因[2-3]。研究表明，ARDS的發(fā)病機(jī)制為肺部促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失衡，造成肺部炎癥紊亂。目前ARDS以基礎(chǔ)治療和支持治療為主，對(duì)肺部炎癥進(jìn)展治療欠佳，因此尋找有效的藥物對(duì)治療ARDS有重要意義。

清肺承氣湯由小承氣湯與小陷胸湯組成，首見(jiàn)于張仲景所著的《傷寒雜病論》。小承氣湯由大黃、枳實(shí)、厚樸組成，3味同煎，枳實(shí)、厚樸減少用量，瀉熱攻下之力較輕，適用于陽(yáng)明熱盛、燥屎初結(jié)、痞滿而實(shí)、燥堅(jiān)不甚之腑實(shí)證[4]。小陷胸湯主治痰熱互結(jié)之結(jié)胸證，方中黃連清熱瀉火，半夏化痰開(kāi)結(jié)，2藥合用，辛開(kāi)苦降、善治痰熱內(nèi)阻；以栝樓實(shí)蕩熱滌痰、寬胸散結(jié)，3藥共奏清熱化痰、寬胸散結(jié)之功[5]。兩方合用可輕下熱結(jié)、清熱化痰，在中醫(yī)理論上吻合腹腔感染、陽(yáng)明熱結(jié)所致肺損傷痰多喘息之證。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，清肺承氣湯對(duì)于ARDS患者有明確的治療效果，但其具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確[6-7]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)清肺承氣湯治療ARDS的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過(guò)對(duì)臨床患者的數(shù)據(jù)分析，探討清肺承氣湯對(duì)細(xì)胞因子和肺巨噬細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)材料

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP，http://lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php），GeneCards知識(shí)庫(kù)（https:// www.genecards.org/），Cytoscape 3.7.1軟件（https:// cytoscape.org/），OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/），STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）、DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）。

1.2 臨床研究的一般資料

選自2016年6月—2018年3月于天津市南開(kāi)醫(yī)院、天津市第一中心醫(yī)院、天津市第四中心醫(yī)院重癥加強(qiáng)治療病房（ICU）收治的嚴(yán)重腹腔感染所致ARDS患者為研究對(duì)象，所有患者均簽署知情同意書(shū)，并通過(guò)天津市第四中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（倫理批件號(hào)SZXLL-2015-030）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1周內(nèi)起病、新發(fā)或惡化的呼吸癥狀；雙肺模糊影不能完全由滲出、肺塌陷或結(jié)節(jié)來(lái)解釋；不能完全由心力衰竭或容量過(guò)負(fù)荷解釋的呼吸衰竭；沒(méi)有發(fā)現(xiàn)危險(xiǎn)因素時(shí)可行超聲心動(dòng)圖等檢查排除血流源性肺水腫，呼氣末正壓通氣（positive end-expiratory pressure，PEEP）≥5 cm H2O時(shí)，100 mm Hg＜(O2)/FiO2≤200 mm Hg或(O2)/FiO2≤100 mm Hg；腹腔感染符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；氣管插管機(jī)械通氣治療；年齡＞18歲且＜80歲；患者及其家屬知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病24 h內(nèi)死亡者，或臨終狀態(tài)；合并外傷、免疫缺陷性疾患、嚴(yán)重心血管疾病、終末期肝腎疾病、惡性腫瘤；近期內(nèi)使用免疫抑制劑（如激素等）；艾滋病或慢性炎癥性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）；各種原因中途退出者。

1.3 儀器

纖維支氣管鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司、液相芯片懸浮系統(tǒng)購(gòu)自Flexmap 3D公司；免疫分析試劑盒、手持式磁力洗板機(jī)、渦流攪拌機(jī)、微量滴定搖版機(jī)、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1 清肺承氣湯活性成分的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入關(guān)鍵詞“大黃、枳實(shí)、厚樸、黃連、半夏、栝樓”得出化合物信息。計(jì)算機(jī)模擬吸收、分布、代謝和排泄系統(tǒng)評(píng)估模型用于評(píng)估清肺承氣湯的潛在活性成分?？诜锢枚龋╫ral bioavailability，OB）用于評(píng)估體內(nèi)藥物的藥動(dòng)學(xué)和藥物形成特性，藥物相似性（drug-likeness，DL）用于評(píng)估分子在生物利用度等方面的“藥物樣”程度，根據(jù)DL≥0.18、OB≥30%對(duì)化合物進(jìn)行篩選。

2.2 藥物活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和ARDS相關(guān)靶點(diǎn)的搜集

利用TCMSP對(duì)78種活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中查找ARDS疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 “化合物-疾病-靶點(diǎn)”和蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用R語(yǔ)言得到化合物、疾病和靶點(diǎn)的共同作用靶點(diǎn)，基于STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，相互作用置信度＞0.4，采用Cytocape 3.7.1軟件構(gòu)建“化合物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2.4 京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)疾病和化合物的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析。

2.5 臨床研究的分組與治療方法

共納入ARDS患者27例，隨機(jī)分為對(duì)照組（13例）和治療組（14例）。對(duì)照組參照2012年膿毒癥指南[8]，進(jìn)行抗感染、改善循環(huán)、血液凈化、機(jī)械通氣支持等治療；治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予清肺承氣湯治療。清肺承氣湯由大黃、枳實(shí)、厚樸、黃連、半夏、瓜蔞組成，制成的中藥顆粒規(guī)格：3 g/袋；2袋中藥顆粒溶于200 mL溫水口服或胃管注入，4袋中藥顆粒溶于400 mL溫水，保留灌腸，2次/d。

2.6 患者一般情況的統(tǒng)計(jì)

根據(jù)患者入院后的血常規(guī)、血?dú)夥治鲋岛蜕w征計(jì)算24 h內(nèi)的APACHE Ⅱ評(píng)分，統(tǒng)計(jì)患者年齡、性別等基本信息和ICU住院時(shí)間、總住院費(fèi)用以及治療3 d后死亡狀況。

2.7 肺泡灌洗液的采集

操作前了解患者病情、主要病征和生理狀態(tài)，備好呼吸、血壓、心電、氧飽和度檢測(cè)和急救的器材及藥物。術(shù)前iv 5 mg咪唑安定，2%利多卡因經(jīng)氣道霧化，行氣道局部黏膜麻醉；纖維支氣管鏡經(jīng)氣管插管插入氣管，嵌入右肺中葉或左肺舌葉段支氣管管口，注入2～3 mL 2%利多卡因局麻后，用50 mL注射器將37 ℃生理鹽水分次注入，每次25～50 mL，總量100～300 mL；注入后立即通過(guò)負(fù)壓吸引裝置吸引、回收至硅質(zhì)灌洗液收集瓶?jī)?nèi)；回收液用雙層無(wú)菌紗布濾過(guò)，除去黏液，記錄總回收液量，裝入硅質(zhì)容器中；灌洗液1500 r/min離心15 min，棄去上清液，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種于96孔板，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.8 觀察指標(biāo)

2.8.1細(xì)胞因子分泌 將肺泡灌洗液以渦流法攪拌均勻，10 000×離心5～10 min去除顆粒。將珠瓶渦旋30 s，加入5 mL珠溶液，渦流30 s。使用多通道移液管將50 μL珠狀混合物加入96孔板中，加入樣品類型特異性緩沖液、樣品各25 μL，孵育后清洗磁珠并加入抗體混合物，封閉磁珠，搖床室溫孵育30 min；加入50 μL Streptavidin-PE，封閉磁珠，搖床室溫孵育30 min；重懸磁珠，加入120 μL讀數(shù)緩沖液，封閉磁珠，搖床室溫孵育30 min。在Luminex 100/200上將標(biāo)準(zhǔn)的期望濃度與每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)生成的MFI作圖，計(jì)算細(xì)胞因子質(zhì)量濃度。

2.8.2肺巨噬細(xì)胞凋亡 肺泡灌洗液采集后的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整至細(xì)胞密度為5×104/mL，1000×離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻；加入10 μL碘化丙啶（PI）染色液，混勻，室溫避光孵育10～20 min，采用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 清肺承氣湯活性成分的篩選結(jié)果

通過(guò)檢索TCMSP，得到78個(gè)活性成分，其中與大黃相關(guān)的化學(xué)成分16個(gè)，與枳實(shí)相關(guān)的化學(xué)成分22個(gè)，與厚樸相關(guān)的化學(xué)成分2個(gè)，與黃連相關(guān)的化學(xué)成分14個(gè)，與半夏相關(guān)的化學(xué)成分13種，與瓜蔞相關(guān)的化學(xué)成分11個(gè)，見(jiàn)表1。

表1 清肺承氣湯活性成分信息

續(xù)表1

3.2 清肺承氣湯治療ARDS的潛在靶點(diǎn)篩選

從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得ARDS相關(guān)靶點(diǎn)476個(gè)，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選清肺承氣湯活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)225個(gè)，將疾病和活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行交叉篩選獲得共同潛在靶點(diǎn)63個(gè)，如圖1和表2所示。

3.3 清肺承氣湯“化合物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

如圖2所示，“化合物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)由110個(gè)節(jié)點(diǎn)（44個(gè)化合物、63個(gè)靶點(diǎn)）和324個(gè)邊緣組成。紅色四邊形代表ARDS，藍(lán)色六邊形代表清肺承氣湯，紫色四邊形代表化合物，綠色圓圈代表靶點(diǎn)，每條邊代表靶點(diǎn)和化合物之間的相互關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)圖表明清肺承氣湯通過(guò)多種成分靶向發(fā)揮各種治療作用，體現(xiàn)了中藥方劑的特性。網(wǎng)絡(luò)圖中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值代表與節(jié)點(diǎn)連接的線路的數(shù)量，度值越大代表節(jié)點(diǎn)越重要。度值越高的化合物和靶點(diǎn)在清肺承氣湯治療ARDS過(guò)程中起到的作用越高，見(jiàn)表3。檞皮素與52個(gè)靶點(diǎn)相連，通過(guò)調(diào)節(jié)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）參與細(xì)胞凋亡，通過(guò)調(diào)控白細(xì)胞介素發(fā)揮抗炎作用。多個(gè)靶點(diǎn)與多個(gè)化合物相結(jié)合，如Bcl-2、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、雄激素受體（androgen receptor，AR）分別與7、16、19個(gè)化合物結(jié)合，在細(xì)胞增殖、炎癥、細(xì)胞凋亡等方面起到關(guān)鍵作用。

圖1 清肺承氣湯治療ARDS潛在靶點(diǎn)的韋恩圖

3.4 清肺承氣湯治療ARDS潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將63個(gè)潛在靶點(diǎn)通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3，PPI圖有68個(gè)節(jié)點(diǎn)和1078條邊，其中節(jié)點(diǎn)代表蛋白，連線代表蛋白與蛋白之間的相互作用。根據(jù)相關(guān)靶點(diǎn)間的數(shù)量即度值排序，度值越高，其起到的作用越關(guān)鍵，度值前30位的潛在靶點(diǎn)見(jiàn)圖4，存在較多與炎癥密切相關(guān)的靶點(diǎn)，如排名第1位的白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）與巨噬細(xì)胞的分泌、肺組織細(xì)胞的修復(fù)密切相關(guān)，MacLaren等[9]發(fā)現(xiàn)IL-6可通過(guò)激活中性粒細(xì)胞，從而介導(dǎo)肝臟分泌大量急性期蛋白，最終促進(jìn)炎癥反應(yīng)的爆發(fā)。

表2 清肺承氣湯治療ARDS潛在靶點(diǎn)相關(guān)信息

表3 “化合物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

3.5 潛在靶點(diǎn)的KEGG通路分析

通過(guò)DAVID平臺(tái)對(duì)63個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路統(tǒng)計(jì)，63個(gè)潛在靶點(diǎn)映射到78條KEGG通路，與炎癥相關(guān)的通路27條，包括核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路、白細(xì)胞介素家族通路等；與細(xì)胞凋亡作用相關(guān)通路11條，包括p53通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路等。圖5列出了20條最重要的通路。TNF通路、NF-κB通路、T細(xì)胞受體通路等與炎癥的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。TNF通路屬于細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡的交互通路[10]，既能通過(guò)活化NF-κB通路調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素家族的分泌，又可通過(guò)TNF-α來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)的活化。

圖3 潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3.6 清肺承氣湯治療腹腔感染所致ARDS的臨床結(jié)果

3.6.1 患者一般資料比較 納入嚴(yán)重腹腔感染所致ARDS患者27例，其中男性19例，女性8例；年齡32～73歲，平均（54.19±14.30）歲；原發(fā)?。褐匕Y急性胰腺炎20例（74.07%），急性梗阻性化膿性膽管炎5例（18.52%），腸梗阻2例（7.41%）；APACHE Ⅱ 12～26分，平均（19.52±7.07）分；3 d后死亡11例，存活16例，存活率59.26%。治療組患者年齡（55.14±12.89）歲，對(duì)照組（53.15±16.15）歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療組男性9例、女性5例，對(duì)照組男性10例、女性3例，性別比例無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療組APACHE Ⅱ（17.36±5.58）分，對(duì)照組APACHE Ⅱ（21.84±7.96）分，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.6.2 2組患者肺泡巨噬細(xì)胞凋亡比較 如圖6、表4所示，治療前對(duì)照組和治療組患者肺泡巨噬細(xì)胞凋亡無(wú)顯著差異。與對(duì)照組治療后比較，治療組患者肺泡巨噬細(xì)胞凋亡顯著降低（＜0.001）。

3.6.3 2組患者肺泡細(xì)胞因子水平比較 如表5所示，治療前2組患者肺泡白細(xì)胞介素-4（interleukin 4，IL-4）、IL-6、白細(xì)胞介素-10（interleukin 10，IL-10）水平無(wú)明顯差異，與對(duì)照組治療后比較，治療組患者肺泡IL-6水平顯著升高（＜0.05），IL-10水平顯著降低（＜0.05）。

4 討論

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多功能的特點(diǎn)，如清肺承氣湯有6味中藥、78個(gè)活性成分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將多向藥理學(xué)和生物學(xué)結(jié)合，對(duì)大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，在整體上考慮藥物與疾病的相關(guān)性、系統(tǒng)性和整體性，從活性成分與疾病相互作用靶點(diǎn)出發(fā)，反映中藥多成分-多靶點(diǎn)的作用關(guān)系，為闡明中藥的復(fù)雜性提供了新的研究思路。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，分析清肺承氣湯中活性成分治療ARDS的作用機(jī)制。

與同組治療前比較：**＜0.01；與對(duì)照組治療后比較：###＜0.001

**0.01the same group before treatment;###0.001control group after treatment

表5 對(duì)照組和治療組患者肺泡細(xì)胞因子水平的比較

與同組治療前比較：*＜0.05**＜0.01；與對(duì)照組治療后比較：#＜0.05

*0.05**0.01the same group before treatment;#0.05control group after treatment

肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，引起過(guò)度炎癥反應(yīng)和大量炎癥細(xì)胞因子分泌，從而引發(fā)ARDS。炎癥細(xì)胞因子是在炎癥過(guò)程中細(xì)胞分泌的小分子蛋白，參與炎癥的發(fā)生、發(fā)展。IL-6主要由T淋巴細(xì)胞分泌，部分由單核巨噬細(xì)胞合成釋放。研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松可以通過(guò)抑制內(nèi)毒素介導(dǎo)的ARDS小鼠模型IL-6的分泌，從而減輕肺部炎癥反應(yīng)，緩解ARDS的病情發(fā)展[11]。TNF超家族由19個(gè)家族成員組成。研究發(fā)現(xiàn)，ARDS發(fā)生過(guò)程中，TNF-α表達(dá)明顯增加。TNF-α與腫瘤壞死因子受體1結(jié)合，進(jìn)而活化NF-κB，上調(diào)細(xì)胞因子IL-1、IL-8、IL-6的表達(dá)，從而導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生[12-13]；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGFβ）屬于致病性細(xì)胞因子，參與急性肺損傷早期發(fā)展，可以通過(guò)減少肺上皮細(xì)胞鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致肺泡水腫，影響ARDS[14-15]；炎癥早期，M1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6、IL-12等促炎因子，M2巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-10[16]；急性肺損傷患者肺泡灌洗液中IL-1β有較高生物活性，可以通過(guò)p38 MAPK通路，抑制上皮鈉通道，促進(jìn)炎癥發(fā)展[17]；過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ（proliferator-activated receptor γ，PPARγ）是核激素受體超家族的成員，其特定的PPARγ受體激動(dòng)劑羅格列酮可以抑制ARDS的炎癥反應(yīng)，防止細(xì)胞損傷[18]；趨化因子配體2（CXC chemokine ligand 2，CXCL2）與趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）結(jié)合，加重炎癥反應(yīng)，與肺纖維化后急性炎癥的病理發(fā)展相關(guān)[19-20]；魯斯可皂苷元可通過(guò)抑制Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）/NF-κB信號(hào)通路保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞，減少ARDS發(fā)病過(guò)程中的細(xì)胞凋亡[10]。

IL-10是肺內(nèi)重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，在ARDS早期屬于促炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和一氧化氮合酶的產(chǎn)生，一氧化氮的積累進(jìn)一步加重ARDS的病情[21-22]。IL-10可通過(guò)抑制骨髓干細(xì)胞向Ⅱ型肺泡表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化來(lái)促進(jìn)ARDS發(fā)展[23]。在ARDS后期，IL-10可通過(guò)促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞并抑制M1型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化起到炎癥修復(fù)作用。D'Alessio等[24]發(fā)現(xiàn)IL-4可增強(qiáng)ARDS小鼠M2型巨噬細(xì)胞分化，促進(jìn)肺組織修復(fù)。本研究臨床數(shù)據(jù)顯示清肺承氣湯通過(guò)調(diào)節(jié)IL-4、IL-6、IL-10的分泌并抑制肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡，影響ARDS不同階段M1和M2型巨噬細(xì)胞的分化，促進(jìn)肺組織修復(fù)，從而影響ARDS病情進(jìn)展。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出，Bcl-2為“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值排前10位的靶點(diǎn)，可以通過(guò)其映射的p53通路和凋亡通路下調(diào)半胱氨酸蛋白酶3，從而抑制細(xì)胞凋亡；TNF信號(hào)通路作為KEGG通路排序靠前的通路，為凋亡作用的核心通路。IL-6、IL-10、AR、CXCL8、PPARγ等靶點(diǎn)屬于PPI網(wǎng)絡(luò)及“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)度值靠前的靶點(diǎn)，NF-κB、T細(xì)胞受體通路、白細(xì)胞介素信號(hào)通路在KEGG分析中為排序靠前的通路，表明清肺承氣湯中的化合物可能調(diào)控IL-6、IL-10、AR、CXCL8、PPARγ等多個(gè)靶點(diǎn)，以及上述多條炎癥通路，調(diào)節(jié)患者白細(xì)胞介素的分泌。

本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)清肺承氣湯治療腹腔感染所致ARDS患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行了初步的潛在分子機(jī)制分析，結(jié)果顯示，清肺承氣湯通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用于細(xì)胞因子和細(xì)胞凋亡，從而延緩疾病進(jìn)展。本研究為ARDS的中西醫(yī)結(jié)合治療提供了新的思路和治療靶點(diǎn)，課題組后續(xù)將通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)清肺承氣湯的具體作用進(jìn)行深入探究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Qingfei Chengqi Decoction on acute respiratory distress syndrome caused by abdominal infection based on network pharmacology and multi-center clinical data

WANG Xin-pei1, WANG Zi-yu2, FU Qiang1,3, DU Chao4, GONG Chuan-yong5, WANG Bing6

1. Graduate School, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China 2. Department of Critical Medicine, Hubei Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Wuhan 430015, China 3. Department of Critical Medicine, Tianjin Fourth Central Hospital, Tianjin 300140, China 4. Emergency Department, The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China 5. Department of Critical Medicine, Tianjin Nankai Hospital, Tianjin 300102, China 6. Department of Critical Medicine, Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300190, China

To elucidate the underlying molecular mechanism of Qingfei Chengqi Decoction (清肺承氣湯) in treatment of patients with acute respiratory distress syndrome (ARDS) caused by abdominal infection using network pharmacology and multi-center clinical data.Through the database of Chinese Medicine System Pharmacology Analysis Platform (TCMSP), the chemical constituents and targets of Qingfei Chengqi Decoction was retrieved. Cytoscape 3.7.1 software was used to establish a “compound-target” network, a predicted protein-protein interaction (PPI) network between predicted targets, and a KEGG enrichment analysis of predicted targets. A total of 27 patients with ARDS due to celiac infection were selected from three hospitals and were randomly divided into Qingfei Chengqi Decoction group (14 cases) and control group (13 cases). Alveolar lavage fluid was taken 3 d before and after treatment; Levels of IL-4, IL-6, IL-10 were detected by microsphere detection; Alveolar macrophage apoptosis was analyzed by flow cytometry.A total of 78 active compounds and 63 potential targets of Qingfei Chengqi Decoction were screened. From “compound-target” network and PPI network, targets ranked the top were PPARγ, Bcl-2, IL-6, IL-10 and INFG; Compounds were quercetin and luteolin. Inflammatory pathways ranked higher in KEGG pathway analysis were NF-κB, TNF signaling pathway, IL-17 pathway and T cell receptor pathway. Compared with control group, level of IL-6 was significantly increased (< 0.05), level of IL-10 was significantly decreased (< 0.05), and apoptotic area of alveolar macrophages was significantly decreased (< 0.001) in Qingfei Chengqi Decoction group.Compounds in Qingfei Chengqi Decoction could regulate multiple signal pathways through targets such as IL-6, Bcl-2, IL-10, and CXCL2 to regulate the secretion of IL-4,IL-6,IL-10 and cell apoptosis to treat ARDS.

Qingfei Chengqi Decoction; abdominal infection; acute respiratory distress syndrome; network pharmacology; quercetin; luteolin; interleukin; apoptosis

R285.6

A

0253 - 2670(2021)02 - 0437 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.017

2020-06-06

天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（15KG121）

王馨培，碩士研究生，研究方向?yàn)橥饪莆Ｖ匕Y的中西醫(yī)結(jié)合治療。E-mail: qq563531789@163.com

傅 強(qiáng) E-mail: 13920864938@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]