張 秀，譚正懷，馬苗苗，李曉媛，周 雪

豆豉AprE9912D血栓溶解酶的制備與活性評價

張 秀，譚正懷*，馬苗苗，李曉媛，周 雪

四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，防治重大疾病中藥藥效學(xué)評價平臺，四川省中藥質(zhì)量評價重點實驗室，四川 成都 610041

通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)的豆豉血栓溶解酶，研究其安全性及溶栓功效。采用酪蛋白平板從豆豉中分離獲得具有纖溶活性的候選菌株，利用基因工程技術(shù)將其基因在大腸桿菌BL21（DE3）-pDE1中過表達(dá)AprE9912D重組蛋白。經(jīng)過Ni-NTA純化柱和透析純化AprE9912D重組蛋白，體外采用纖維蛋白平板、溶解混合血栓考察溶栓作用，體內(nèi)采用動靜脈旁路血栓模型進行功效評價。同時對其安全性進行初步評估。經(jīng)過分子鑒定，篩選出具有纖溶酶活性的菌株是貝萊斯芽孢桿菌9912D（9912D）。序列分析發(fā)現(xiàn)基因的開放閱讀框有382個氨基酸，屬于S8家族堿性絲氨酸蛋白，使用SWISS-MODEL同源預(yù)測AprE9912D蛋白3D模型。經(jīng)過Ni-NTA柱純化，AprE9912D纖溶酶蛋白相對分子質(zhì)量約為36 000。體外測得AprE9912D纖溶酶酶活力為442.6 kU/mg，2.0 kU/mL AprE9912D纖溶酶就能有效溶解混合血栓，其溶解率為40.0%。在體內(nèi)，4.0 kU/kg能顯著抑制動靜脈旁路血栓形成，抑制率為32.9%。體外溶血顯示AprE9912D纖溶酶93.0 U/mL時，其溶血率為3.33%；測得小鼠靜脈注射AprE9912D纖溶酶半數(shù)致死量（LD50）＞102.6 kU/kg。AprE9912D纖溶酶具有活性較強、安全性較高的特點，具有進一步開發(fā)的廣闊前景。

貝萊斯芽孢桿菌；過表達(dá)；安全性；溶栓活性；血栓溶解酶；基因工程技術(shù)；大腸桿菌

流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，我國心腦血管疾病的發(fā)生率不斷上升，心腦血管疾病死亡人數(shù)大約占人口總死亡數(shù)的40%～50%；在歐美，其死亡率更高。血栓是引起心肌梗塞、腦中風(fēng)的重要原因。治療血栓有介入、手術(shù)、抗凝藥和溶栓藥等方法。盡管血管支架搭橋技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，但由于支架引起的再狹窄等不良反應(yīng)大大限制了支架技術(shù)的臨床應(yīng)用。至于抗凝療法多用于預(yù)防，難以起到治療血栓性疾病的目的[1-2]。

而溶栓藥物療法因具有起效快、操作簡單、對患者損傷小、相對價廉等特點而為眾多醫(yī)患所接受。溶栓藥發(fā)展至今已有3代，其中第1代溶栓藥物具有無纖維蛋白特異性、開通率低和易出血等缺點，如尿激酶；第2代溶栓藥物則具有半衰期短、顱內(nèi)易出血和價格貴等缺點，如重組組織型纖溶酶原激活劑t-PA；第3代溶栓藥物多采用基因工程制備，具有快速溶栓、半衰期長和開通率高等優(yōu)點，如瑞替普酶。目前，天然新型溶栓藥物如蛇毒、蚯蚓、水蛭素等中藥有溶栓作用，雖然價格便宜，但是溶栓效果不佳、有過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)[1-2]。因此，尋找效果優(yōu)良、半衰期長、價格低、不良反應(yīng)小的溶栓藥是目前醫(yī)藥科研工作的當(dāng)務(wù)之急[3]。

豆豉為常見的大豆發(fā)酵食品。有研究顯示豆豉中枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌等可以產(chǎn)生纖溶酶，對血栓具有溶解作用[4-5]，但這些菌株所產(chǎn)生的酶至今沒有走向市場。本實驗報道在重慶永川生產(chǎn)的豆豉中發(fā)現(xiàn)了一種能產(chǎn)生溶栓酶的貝萊斯芽孢桿菌9912D（9912D），然后利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)出活性強、安全性高的AprE9912D纖溶酶，為其后期發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌種及其質(zhì)粒

豆豉，配料為黃豆，批號為20181113，重慶市永川區(qū)嘉泰實業(yè)有限公司出品；TreliefTM5α感受態(tài)（TSC01）、pClone007載體（TSV-007S）、BL21（DE3）感受態(tài)（TSV-A09）以及pDE1表達(dá)載體（TSV-E1）均由北京擎科生物科技有限公司出品。

1.2 試劑

酪蛋白瓊脂（貨號HB0252，批號20180526）購于青島海博生物公司；牛肉纖維蛋白原（貨號FB051，批號514M021）、凝血酶（貨號T8021，批號218D0310）、尿激酶（貨號U8120，批號715N011）購于北京索萊寶科技有限公司；卡那霉素硫酸鹽（kanamycln sulfate，Kan，貨號S17025-25 g，批號S09M9Y55277）購于上海源葉生物技術(shù)有限公司；-還原型谷胱甘肽（批號EZ3413A111）和-氧化型谷胱甘肽（批號EZ3412C306）購于BioFroxx公司；異丙基-β--硫代半乳糖苷（isopropyl β--1- thiogalactopyranoside，IPTG，貨號I6758-1G，批號027M4001V）購于Sigma公司。

1.3 試劑盒

細(xì)菌總基因組核酸提取試劑盒（貨號D1600，批號20181109），北京索萊寶科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號C600596，批號F708DA0001），BBI Life Sciences Corporation；I-5TM2*High-Fidelity Master mix（貨號I5HM-200，MCLAB）、膠回收試劑盒（貨號GE0101-50，批號020180516）和質(zhì)粒提取試劑盒（貨號PM0201-50，批號020180508），北京擎科生物科技有限公司；一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒（貨號C500023，批號EC26DA0003），生工生物工程（上海）股份有限公司；Ni-NTA柱（貨號DP101- 01，批號N10306），北京全式金生物技術(shù)有限公司；SP132572-1m再生纖維素透析袋（截留相對分子質(zhì)量大小為10 000，批號S10J10G902 19），上海源葉生物技術(shù)有限公司；濃縮管10 000 NMWL（貨號UFC801096，批號R8NA37711），德國Merck Millipore公司。

1.4 動物

昆明種小鼠，SPF級，四川省中醫(yī)藥科學(xué)院動物中心提供，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，生產(chǎn)許可證號SCXY（川）2018-19；SD大鼠，SPF級，購買于成都達(dá)碩實驗動物公司，雄性，體質(zhì)量220～260 g，生產(chǎn)許可證號SYXK（川）2015-030。

所有動物實驗遵循四川省中醫(yī)藥科學(xué)院動物福利倫理委員會有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。所有動物均飼養(yǎng)在四川省中醫(yī)藥科學(xué)院動物中心SPF動物屏障系統(tǒng)中。環(huán)境使用許可證號SYXK（川）2018-100。燈光照明，12 h光照，12 h黑暗。自由飲水、攝食，全營養(yǎng)顆粒飼料由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心提供。

1.5 儀器

HJ-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺，上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；2K15離心機，Sigma公司；LGJ-10冷凍干燥機，北京松源華光科技發(fā)展有限公司；S1000thermal cycler PCR儀，美國BIO-RAD公司；DYCP-31D水平核酸電泳儀和24DN垂直蛋白電泳儀，北京六一生物技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 分離、篩選及鑒定纖溶菌株

取豆豉5.0 g加入預(yù)置10個無菌玻璃珠的三角瓶中，加入100 mL無菌生理鹽水，37 ℃、100 r/min震蕩培養(yǎng)72 h[6]。吸取100 μL培養(yǎng)液，用梯度稀釋法稀釋培養(yǎng)液，采用平板擴散法將不同稀釋度（1×10?4、1×10?5、1×10?6）的培養(yǎng)液涂布在酪蛋白平板中上培養(yǎng)、分離菌株，選擇有透明圈的菌株，再重復(fù)驗證1次。

候選菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基（10 g/L蛋白胨，5 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH 7.2～7.6）37 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)72 h[4,7-8]。離心收集上清液。用酪蛋白平板再次驗證候選菌株發(fā)酵上清液的纖溶活性，發(fā)現(xiàn)有透明圈及顏色由綠變?yōu)樗{(lán)，說明篩選菌株具有纖溶活性，結(jié)果見圖1-a。

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取候選菌株基因組DNA，然后采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增候選菌株的基因和基因，S-30 （5’-GTGATCGCAG-3’）單一引物進行隨機擴增多態(tài)性DNA聚合酶鏈反應(yīng)（RAPD-PCR），并與已有基因庫序列進行比對分析，種屬鑒定[9]，引物序列見表1。

采用引物27-F和1527-R擴增基因，在以下條件下進行PCR：預(yù)變性94.0 ℃、5 min；94.0 ℃、30 s，56.3 ℃、30 s，72.0 ℃、1 min 40 s，共35個循環(huán)；再延長72.0 ℃、10 min。采用引物recA-F和recA-R擴增基因，在以下條件下進行PCR：預(yù)變性94.0 ℃、5 min；94.0 ℃、30 s，52.0 ℃、30 s，72.0 ℃、1 min，共35個循環(huán)；72.0 ℃、10 min。RAPD-PCR擴增條件：預(yù)變性94.0 ℃、5 min；94.0 ℃、1 min，32.0 ℃、1 min，72.0 ℃、2 min，共40個循環(huán)；再延長72.0 ℃、10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳分析；DNA核苷酸測序（擎科生物科技股份有限公司完成）；利用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）進行基因序列比對（BLAST）分析同源性。

擴增出約1.4 kb的基因同源性分析表明，具有纖溶活性的菌株可能是枯草芽孢桿菌、sp芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌；同源性比對結(jié)果均為100%，可以判斷屬于芽孢桿菌屬，但是不能判斷出種屬。以S-30單一引物擴增結(jié)果表明，所有菌株均擴增出1.1、1.5、1.8 kb條帶片段，依其方法無法判斷篩選菌株是否屬于解淀粉芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌或者地衣芽孢桿菌[9]。擴增出約0.9 kb的基因同源性分析表明，篩選出的目標(biāo)菌株是來自貝萊斯芽孢桿菌，與注釋recA蛋白完全一致。綜上結(jié)果，篩選出具有纖溶活性的菌株為貝萊斯芽孢桿菌。

2.2 AprE9912D基因開放閱讀框比對分析

使用I-5TM2*High-Fidelity Master mix，采用401和722-2引物對來自貝萊斯芽孢桿菌的開放閱讀框纖溶基因（open reading frame，ORF）進行擴增，引物序列見表1：預(yù)變性98.0 ℃、2 min；98.0 ℃、10 s，56.0 ℃、15 s，72.0 ℃、20 s，共35個循環(huán)；再延伸72.0 ℃、5 min。纖溶基因DNA序列（結(jié)果未呈現(xiàn)）BLAST比對分析，是來自貝萊斯芽孢桿菌9912D菌株。篩選出具有纖溶活性的菌株是為貝萊斯芽孢桿菌9912D，纖溶基因名為基因（ORF）。

在NCBI上對基因（ORF）比對分析。ORF分析：為1個ORF片段，有382個氨基酸（aa）；蛋白功能分析，由信號肽（1-30aa、1-5aa為N區(qū)，6-18aa為H區(qū)，19-30aa為C區(qū)）、肽抑制劑19和成熟肽組成，蛋白為可分泌型，由此判斷AprE9912D蛋白主區(qū)域在信號肽后面，過表達(dá)時選用去信號肽后的主區(qū)域，不同于采用信號肽的過表達(dá)[10]。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析：蛋白質(zhì)的分子大小為39 093.10，pI 9.24，去除信號肽后，有352aa，其蛋白質(zhì)分子大小為35 886.22，pI 8.93；保守區(qū)域分析見圖2，AprE9912D蛋白，屬于堿性絲氨酸蛋白酶，與細(xì)胞內(nèi)堿性絲氨酸蛋白酶S8家族具有高度同源性，活性位點（139、171、213、232、261、328），催化位點（Asp139、His171、Ser328）。

采用網(wǎng)站EMBL-EBI中MAFFT進行氨基酸同源比對，基因（ORF）氨基酸分別與來源于解淀粉芽孢桿菌的（NCBI GenBank: JF739176.1）、（NCBI GenBank: DQ132806.1）和（NCBI GenBank: P00782.1）；與來源于貝萊斯芽孢桿菌的（NCBI GenBank: MH378165.1）和（NCBI GenBank: MN119493.1）；與來源于枯草芽孢桿菌（NCBI GenBank: CAA74536.1）；與來源于納豆枯草芽孢桿菌（NCBI GenBank: FJ374767.1）進行氨基酸同源比對分析，結(jié)果見圖3。氨基酸同源比對分析發(fā)現(xiàn)其與同源性為98.43%[11]，與同源性為32.60%[12]，與同源性為99.74%，與同源性為99.21%，與納豆激酶同源性為85.86%，與同源性為85.08%，與同源性為97.12%。使用SWISS-MODEL同源構(gòu)建AprE9912D蛋白3D模型，結(jié)果見圖4。

貝萊斯芽孢桿菌9912D與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和納豆枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌菌屬能夠產(chǎn)生相似的纖溶酶，而此類纖溶酶具有較多相似特點：屬于AprE類型堿性絲蛋白；有高度相似的氨基酸序列；同源S8家族蛋白；相似的催化位點、蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性；成熟肽相對分子質(zhì)量大約是27 000～29 000[13-14]。

2.3 AprE9912D纖溶酶基因過表達(dá)

使用I-5TM2*高保真緩沖液，采用Pro490和722-2引物對來自貝萊斯芽孢桿菌包含前導(dǎo)肽和成熟肽的基因進行擴增，擴增條件同基因（ORF），引物見表1。擴增產(chǎn)物1.1 kb構(gòu)建Trelief5α-pClone007-AprE9912D重組轉(zhuǎn)化子。經(jīng)抗生素篩選、酶切、PCR擴增外源片段、測序和NCBI BLAST比對分析后鑒定重組轉(zhuǎn)化子是否正確。

采用高純度質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取目標(biāo)pClone007質(zhì)粒。使用Pro490-pDE1和722-2-pDE1引物擴增目的基因，引物序列見表1。目的片段經(jīng)純化后插入大腸桿菌BL21（DE3）pDE1，采用熱休克處理轉(zhuǎn)化外源質(zhì)粒。大腸桿菌BL21（DE3）pDE1-AprE9912D重組轉(zhuǎn)化子經(jīng)抗生素Kan篩選、PCR擴增外源片段、測序和NCBI BLAST比對分析后鑒定重組轉(zhuǎn)化子是否正確。纖溶酶基因包括前導(dǎo)肽和成熟肽，采用啟動子啟動表達(dá)，6*His標(biāo)簽篩選表達(dá)蛋白。重組大腸桿菌BL21（DE3）pDE1-AprE9912D構(gòu)建圖，如圖5，獲得基因過表達(dá)菌株。

單克隆菌落大腸桿菌BL21（DE3）-pDE1- AprE9912D經(jīng)過活化和擴大培養(yǎng)，菌液濃度在600 nm處的吸光度達(dá)到0.6～0.8時，添加0.6 mmol/L IPTG，20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h[13,15-16]。收集菌體，用PBS緩沖溶液沖洗菌體3次。采用細(xì)菌蛋白提取試劑盒提取活性可溶性蛋白，一步法提取試劑盒處理細(xì)菌包涵體。SDS-PAGE電泳分析可溶蛋白及包涵體蛋白相對分子質(zhì)量，見圖6。

2.4 AprE9912D纖溶蛋白純化與復(fù)性

結(jié)合Ni-NTA柱，對“2.3”項所述方法獲得的包涵體和可溶性蛋白，進行分離、純化和透析法復(fù)性[14,17-18]，結(jié)果見圖7。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析AprE9912D纖溶酶的相對分子質(zhì)量為36 000，如圖6。采用纖維蛋白平板法測定纖溶酶纖溶活性，纖溶活性表示為kU/mg蛋白，孔中分別加入不同濃度的AprE9912D纖溶酶，37 ℃孵育16 h。以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品，用透明圈大小制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算纖維酶活性。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，用Bradford法測定蛋白濃度。在纖維蛋白平板上發(fā)現(xiàn)都具有纖溶活性，纖溶酶酶活力為442.6 kU/mg，如圖1-b。纖維蛋白平板有2種形式鑒定纖溶活性：無纖溶酶原和富有纖溶酶原。沒有纖溶酶原平板適合于鑒定類纖溶酶活性，富有纖溶酶原平板適合于鑒定類纖溶酶原激活劑，而本試驗條件下發(fā)現(xiàn)AprE9912D纖溶酶屬于類纖溶酶[4,19]。AprE9912D纖溶酶液體經(jīng)真空冷凍干燥機干燥成粉末，供后續(xù)試驗使用及驗證其安全性和溶栓功效[17-18,20]。

2.5 溶栓功效評價

2.5.1 體外對混合血栓的影響 采用雄性大鼠腹主動脈取血制備混合血栓[21]。將混合血栓切成103.0～116.0 mg的血塊，根據(jù)混合血栓質(zhì)量隨機分為3組：對照組、AprE9912D纖溶酶組和尿激酶組。在等反應(yīng)體系條件下，AprE9912D纖溶酶組的試管中分別添加AprE9912D纖溶酶，濃度分別為0.5、1.0、2.0 kU/mL；尿激酶組的試管中添加尿激酶，濃度為2.0 kU/mL；對照組的試管中添加0.5 mL生理鹽水，37 ℃孵育16 h。試驗結(jié)束時，取剩余血栓在濾紙上吸去水份，稱質(zhì)量[22-25]。溶栓率（）計算公式為＝(0－1)/0，其中0為初始血栓的質(zhì)量，1為殘余血栓的質(zhì)量。平行試驗3次。與對照組相比，AprE9912D纖溶酶2.0 kU/mL可顯著溶解血栓，減輕混合血栓質(zhì)量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，溶栓率為40.0%，結(jié)果見表2。

2.5.2 體內(nèi)對動靜脈旁路形成血栓的影響 結(jié)合“2.5.1”項體外對混合血栓的溶解情況，故體內(nèi)驗證實驗采用4.0 kU/kg的劑量。取雄性SPF級SD大鼠（220～260 g），根據(jù)體質(zhì)量隨機分為模型組、尿激酶組和AprE9912D纖溶酶組，分別尾靜脈注射尿激酶4.0 kU/kg、AprE9912D纖溶酶4.0 kU/kg或等量生理鹽水。10 min后，用動靜脈導(dǎo)管制備動靜脈旁路血栓模型，體外循環(huán)15 min，取出血栓線，立即稱定質(zhì)量[26-28]，總質(zhì)量減去6 cm干縫合線質(zhì)量即得血栓質(zhì)量。血栓率（）計算公式：＝(0－1)/0，其中0為模型組血栓質(zhì)量，1為藥物組血栓質(zhì)量。與模型組相比，AprE9912D纖溶酶4.0 kU/kg可以顯著性抑制大鼠動靜脈旁路血栓形成，血栓形成抑制率為32.9%[27-29]，結(jié)果見表3。

與對照組比較：**＜0.01***＜0.001

**< 0.01***< 0.001control group

與模型組比較：**＜0.01

**< 0.01model group

2.6 安全性評估

2.6.1 靜脈注射對小鼠急性毒性作用 經(jīng)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)其急性毒性作用甚小，無法測出其半數(shù)致死量LD50，故測定其最大耐受量。正式實驗時，取SPF級18～22 g昆明種小鼠20只，雌雄各半，隨機分為對照組和實驗組。在禁食不禁水16 h后，實驗組分別尾靜脈注射AprE9912D纖溶酶（102.6 kU/kg），對照組給予等量生理鹽水。觀察并記錄給藥后14 d內(nèi)動物的中毒情況[5,26]。分別于第7天和第14天稱定質(zhì)量，2周后用脫臼法處死未死動物，稱量心、肝、脾、腎、肺等臟器的濕質(zhì)量，按照公式計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)＝組織濕質(zhì)量/體質(zhì)量

小鼠在給藥后2周內(nèi)，未出現(xiàn)死亡或行為學(xué)、排泄物、分泌物等異常現(xiàn)象，解剖時肉眼未見各主要器官異常。從表4、5可見，AprE9912D纖溶酶對小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)等指標(biāo)無明顯影響，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。AprE9912D纖溶酶半數(shù)致死量（LD50）＞102.6 kU/kg。

2.6.2 體外溶血作用 溶血性測定采用改進的2019版中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范化學(xué)藥部分—溶血與凝聚檢查法[30]。從大鼠腹主動脈取血，玻璃珠去除纖維蛋白原后，生理鹽水清洗3次。采用生理鹽水稀釋成2.0%紅細(xì)胞懸液用于試驗，每支試管中添加2.5 mL紅細(xì)胞懸液，隨機分為3組：陽性組、AprE9912D纖溶酶組和陰性組。在等體積的條件下，取不同濃度的AprE9912D纖溶酶分別添加到2.5 mL紅細(xì)胞懸液中，用生理鹽水補足5.0 mL；陽性組加入2.5 mL蒸餾水；陰性組加入2.5 mL生理鹽水。37 ℃水浴3 h，每30 min觀察溶血及凝聚情況。3 h后收集上清液，檢測波長540 nm處吸光度（）值，溶血率按公式溶血率＝(樣本－陰性)/(陽性－陰性)計算。重復(fù)3次溶血實驗。

經(jīng)過3 h觀察，2.0%紅細(xì)胞懸液在體外添加AprE9912D纖溶酶之前或之后沒有明顯的溶血及聚集現(xiàn)象。AprE9912D纖溶酶最大濃度為93.0 U/mL時，溶血率為3.33%，結(jié)果見表6。溶血率不超過5.0%，與中國國家醫(yī)藥產(chǎn)品管理局《中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》和《中國藥典》2020年版相符。

2.7 統(tǒng)計方法

3 討論

目前，臨床上常用溶栓酶存在有不良反應(yīng)問題，如蝮蛇抗栓酶具有較強的抗原性，引起患者產(chǎn)生過敏反應(yīng)，干擾治療效果[31]。其次，這些酶劑量難以把握，劑量過小，溶栓效果不佳，影響愈后；劑量稍大，則可引起出血，嚴(yán)重者可給患者帶來生命危險。再次，這些藥品普遍存在價格高，許多患者家庭難以承受。因此，積極尋找溶栓效果好、安全性高的溶栓藥物，是許多國內(nèi)外制藥大公司追求的目標(biāo)之一。

豆豉是人們喜愛的食品，早期有人發(fā)現(xiàn)豆豉中含有調(diào)血脂成分[32]，但由于含量甚微，無法用于臨床；近年來，有報道顯示豆豉所含的枯草芽孢桿菌具有產(chǎn)生溶栓酶的作用，但由于其含量甚低[33]，無法實現(xiàn)直接從豆豉中提取、分離溶栓酶的目的。本研究首次發(fā)現(xiàn)豆豉中所含貝萊斯枯草芽孢桿菌9912D同樣具有很好的溶栓活性[11-12]，但常規(guī)狀態(tài)下，含量甚微，難以實現(xiàn)用于臨床治療血栓性疾病的目的。因此，本實驗在確定其基因序列的基礎(chǔ)上，采用基因工程技術(shù)，使大腸桿菌大腸桿菌BL21（DE3）-pDE1過表達(dá)基因，初步實現(xiàn)了使用較低的成本可以大量生產(chǎn)具有溶栓活性的AprE9912D酶的目的，體內(nèi)外活性研究結(jié)果顯示AprE9912D酶具有溶栓活性高、無溶血等不良反應(yīng)。初步研究表明AprE9912D酶具有價廉、活性強且安全的特點，初步克服了目前市場上溶栓酶的諸多不確定，提示其廣闊的應(yīng)用前景。

?：沒有作用；＋：有作用

?: no; ＋: yes

當(dāng)然，本實驗在后續(xù)研究中還有許多地方有待進一步完善：如分離純化技術(shù)的效率較低，相關(guān)參數(shù)不能與工業(yè)化生產(chǎn)接軌，目前還不能實現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)，因此有必要在后期研究中進一步引進高效的分離、純化技術(shù)，使其與工業(yè)化大生產(chǎn)接軌；其次，其安全性評價也有待進一步完善，特別是需要回答該藥的致敏性問題；在藥效學(xué)研究中也有待進一步深入研究，特別是其溶栓機理或特點有待進一步系統(tǒng)闡述，以準(zhǔn)確回答其成藥性問題。

綜上所述，在本實驗條件下，通過基因工程產(chǎn)生的AprE9912D纖溶酶作為一種天然新型溶栓劑，克服了豆豉中含量少、不能靜脈注射實現(xiàn)快速溶栓的缺點，大大提高了其臨床應(yīng)用前景；同時與目前臨床上常用治療血栓的藥物尿激酶比較，具有純化質(zhì)量高、溶栓活性好、無明顯不良反應(yīng)等優(yōu)點。其詳細(xì)作用機制有待深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and fibrinolytic activity evaluation of thrombolytic enzyme AprE9912D from Douchi

ZHANG Xiu, TAN Zheng-huai, MA Miao-miao, LI Xiao-yuan, ZHOU Xue

Sichuan Key Laboratory of TCM Quality Evaluation, Evaluation Platform of Pharmacodynamics of TCM for Major Disease Prevention and Treatment, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China

To study safety and thrombolytic effect of Douchi thrombolytic enzyme produced by genetic engineering technology.Acandidate strainwith fibrinolytic activity was isolated and obtained from Douchi by casein plate.gene of the candidate strain was expressed inBL21 (DE3) - pDE1 to produce the recombinant protein AprE9912Dby genetic engineering technology. This protein was purified by Ni-NTA column and dialysis, the fibrin plate and dissolution of themixed thrombus were using for observing the thrombolytic effect; The rat arteriovenous shunt thrombosis modelwas used for efficacy evaluation. At the same time, the safety was evaluated preliminarily.The strain with fibrinolytic activity from screening was9912D bymolecularidentification. Sequence analysis indicated thatthe open reading framework ofgenehad 382 amino acids, and belonged to a S8 family Alkaline serine protease; three-dimensional structure of AprE9912D protein was predicted by SWISS-MODEL. The protein molecular weight of AprE9912D fibrinolytic enzyme was 36 000 after purification by Ni-NTA column. Fibrinolytic activity of AprE9912D enzymewas 442.6 kU/mg; 2.0 kU/mL AprE9912D fibrinolytic enzyme could dissolve mixed thrombus effectively, and the thrombolytic ratio was 40.0%., 4.0 kU/kg AprE9912D fibrinolytic enzyme could significantly inhibit thrombosis in the rat arteriovenous shunt thrombosis model, the inhibition ratio was 32.9%., thehemolysis test showed that when the concentration of the AprE9912D fibrinolytic enzyme was 93.0 U/mL, the hemolysis ratio was 3.33%. The median lethal dose (LD50) of the AprE9912D fibrinolytic enzyme was greater than 102.6 kU/kg by iv.The AprE9912D fibrinolytic enzyme has stronger activity and higher safety.It would have broad prospects for further development.

; overexpression; safety; fibrinolytic activity; thrombolytic enzyme; genetic engineering technology;

R283.6

A

0253 - 2670(2021)02 - 0367 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.02.009

2020-08-18

四川省科技廳基本業(yè)務(wù)專項（A-2018N-27）；四川省中醫(yī)藥管理局科學(xué)技術(shù)研究專項項目（2018QN040）

張 秀（1986—），女，碩士，助理研究員，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail: 771428588@qq.com

譚正懷，男，博士，研究員，主要從事中藥藥理與毒理研究。E-mail: tanzhh616@sohu.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]