陳 紅，李春花，王文軍，曾 戎，閆歡歡，張 宏

(1.西安市第四醫(yī)院眼科，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710049)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，由其導(dǎo)致的失明的發(fā)生率也越來(lái)越高[1]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，微血管并發(fā)癥是常見(jiàn)的糖尿病性視網(wǎng)膜病之一。慢性高血糖癥會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，使周細(xì)胞減少和無(wú)細(xì)胞毛細(xì)血管形成，血管通透性增加和白細(xì)胞黏附[2，3]。盡管控制好血糖可以降低發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病的風(fēng)險(xiǎn)，但是仍有血糖控制良好的患者中，疾病繼續(xù)發(fā)展至晚期[4]。因此，迫切需要實(shí)施能夠預(yù)防或減輕糖尿病視網(wǎng)膜病進(jìn)展的新的有效治療策略。近年來(lái)，干細(xì)胞療法為臨床治療糖尿病視網(wǎng)膜疾病提供了新的治療思路[5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)是來(lái)源于骨髓的一類非造血干細(xì)胞，具有增殖力強(qiáng)、分化潛力大與免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，已有研究表明，其在DR中能夠發(fā)揮一定的作用[6，7]。α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin)是一種主要由肝細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聯(lián)合高爾基復(fù)合體共同參與合成的糖蛋白[8]，可抑制蛋白酶過(guò)度活化引發(fā)的組織損傷，在炎癥急性期α1-抗胰蛋白酶血清水平明顯增高以減輕炎性反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損害[9]。本研究運(yùn)用α1-抗胰蛋白酶聯(lián)合BMSC移植對(duì)DR大鼠進(jìn)行干預(yù)，探究其對(duì)DR的治療效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性Wistar大鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重為200～250 g，飼養(yǎng)在溫度為20～25 ℃，濕度為35%～40%的動(dòng)物飼養(yǎng)箱內(nèi)，飼養(yǎng)室定期進(jìn)行消毒。本研究所做實(shí)驗(yàn)獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

主要試劑：α1-抗胰蛋白酶(美國(guó) Sigma公司)，Wistar大鼠BMSC(美國(guó)ATCC公司)，IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒及胰島素檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京百奧萊博公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉生物公司)，TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó) Roche 公司)，Trizol試劑、PrimeScriptTM RT試劑盒與SYBR Premix ExTaqTM PCR試劑盒(日本Takara 公司)，山羊抗小鼠CD45單克隆抗體(美國(guó) R&D 公司)，RIPA 裂解緩沖液、BCA試劑盒與ECL化學(xué)發(fā)光液(上海碧云天生物研究所)，兔抗p38、p-p38、p65、p-p65、p-IκBα、IκBα及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(美國(guó)Abcam 公司)。

1.2 方法

1.2.1造模及分組 將50只體重為200～250 g的健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組10只，實(shí)驗(yàn)組40只。實(shí)驗(yàn)組大鼠參考文獻(xiàn)[10]方法建立DR模型，使用高脂高糖的飼料喂養(yǎng)8周，對(duì)照組大鼠使用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。8周后所有大鼠均禁食12 h，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素，對(duì)照組注射等體積的生理鹽水，連續(xù)注射5 d，第7天時(shí)斷尾并采集大鼠尾部靜脈血進(jìn)行血糖檢測(cè)，當(dāng)血糖>11.1 mmol/L時(shí)說(shuō)明建模成功。將造模成功的36只大鼠給予基礎(chǔ)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)自由活動(dòng)4周后，觀察大鼠眼底出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血、毛細(xì)血管擴(kuò)張及動(dòng)靜脈異常等情況。

1.2.2給藥處理 將糖尿病視網(wǎng)膜病變模型建模成功的30只大鼠隨機(jī)分為模型組、BMSC組、聯(lián)合組(BMSC+α1-抗胰蛋白酶)，每組10只。將BMSC與LG-DMEM混勻，制備細(xì)胞懸液，造模后24 h，BMSC組經(jīng)視網(wǎng)膜注射300 μL BMSC懸液(含5×106個(gè)細(xì)胞)，并注射生理鹽水。聯(lián)合組注射BMSC懸液的同時(shí)，給予腹腔注射α1-抗胰蛋白酶(100 mg/kg)，每天注射一次，連續(xù)注射3 d。持續(xù)4周正常飼養(yǎng)后，將大鼠禁食過(guò)夜，次日麻醉后通過(guò)心臟穿刺收集血液，并迅速解剖視網(wǎng)膜，在預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽水中沖洗，以去除視網(wǎng)膜上的血漬，將左視網(wǎng)膜組織固定于10%福爾馬林液中，右視網(wǎng)膜組織在液氮中速凍后，保存于-80℃。

1.2.3大鼠血清血糖值、胰島素水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠前測(cè)定各組大鼠血糖和血清胰島素水平。使用羅氏血糖儀測(cè)定大鼠血糖，采用胰島素檢測(cè)試劑盒測(cè)定胰島素含量，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4大鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α檢測(cè) 將處死大鼠后收集的各組大鼠血液在低溫離心機(jī)中以3 000 r/min離心20 min，靜置后收集分離的上層血清，ELISA法測(cè)定血清液中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量，具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察 將固定于在福爾馬林緩沖液中各組大鼠視網(wǎng)膜組織，進(jìn)行石蠟包埋，切成厚度約為5 μm的切片，常規(guī)脫蠟，在梯度酒精中水化。蘇木精染色5 min，流水沖洗后，伊紅染色液染色3 min，經(jīng)脫水、透明后，使用中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察并拍照。

1.2.6TUNEL染色 各組大鼠視網(wǎng)膜組織石蠟切片在60℃下烤片2 h脫蠟，加入20 μg/mL 不含 DNase 的蛋白酶 K，室溫孵育 30 min，滴加50 μL TUNEL 檢測(cè)液于樣品上，在37℃下孵育 1 h，再加入過(guò)氧化物酶轉(zhuǎn)化劑37℃孵育30 min，沖洗后滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min后封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)凝集，胞核固縮，核染呈綠色。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色 將各組大鼠視網(wǎng)膜組織石蠟切片脫蠟脫水，采用檸檬酸在高溫下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，將切片在3%H2O2中孵育10 min來(lái)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。然后加入山羊血清在37 ℃下孵育1 h以阻斷非特異性標(biāo)記，滴加CD45單克隆抗體(1∶100)在4 ℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌3次后，在室溫下與二抗孵育1 h。PBS洗滌，加 DAB染色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察并拍照。

1.2.8實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡ mRNA的表達(dá) 使用Trizol試劑提取視網(wǎng)膜組織總RNA，根據(jù)PrimeScriptTM RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為底物進(jìn)行 qRT-PCR 擴(kuò)增，根據(jù)SYBR Premix ExTaqTM PCR試劑盒進(jìn)行操作，以GAPDH為內(nèi)參基因。擴(kuò)增條件是在95 ℃下進(jìn)行10 min，并在以下參數(shù)下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95°C 30 s， 56°C 30 s，72°C 1 min。具體序列如下：VEGF(上游引物: 5'-GGCGAGGCAGCTTGAGTTAC-3', 下游引物：5'-CTGTCGACGGTGACGATGGT-3')，HIF-1α(上游引物：5'-CGCGAACGACAAGAAAAAGGC-3', 下游引物：5'-CGTATATAAAGATGCGAACTCAC-3'),ANG Ⅱ(上游引物:5'-CAGAAGAATGGAAGAGTCTCAG-3', 下游引物：5'-CAGATATGCAGGGAGTCACC-3')，GAPDH(上游引物：5'-AGTATGACTCCACTCACG GCAA-3',下游引物：5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3')。使用2-ΔΔCt法來(lái)計(jì)算各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.9Western blot法檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜組織中p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 使用RIPA 裂解緩沖液對(duì)視網(wǎng)膜組織總蛋白進(jìn)行裂解提取，BCA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)定量。以25 μg蛋白加樣并用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜。加入稀釋后的兔抗p38、p-p38、p65、p-p65、p-IκBα與IκBα為一抗，4℃下孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，加入稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜，采用ECL液顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro Plus分析蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血糖與胰島素的變化

與對(duì)照組比較，模型組血糖明顯增加，胰島素水平則明顯下降；與模型組比較，BMSC組和聯(lián)合組血糖明顯降低而胰島素含量明顯增加，且聯(lián)合組血糖的降低與胰島素含量的增加較BMSC組更為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組血糖與胰島素含量比較

2.2 各組血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α含量比較

模型組血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α含量較對(duì)照組明顯升高；與模型組比較，BMSC組和聯(lián)合組血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α含量均明顯下降，且聯(lián)合組IL-1β、IL-6 和TNF-α含量小于BMSC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α含量比較

2.3 各組視網(wǎng)膜病理組織學(xué)觀察

對(duì)照組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚、排列整齊；模型組視網(wǎng)膜內(nèi)出現(xiàn)明顯水腫，各層細(xì)胞排列雜亂；BMSC組視網(wǎng)膜內(nèi)水腫有所減輕，但仍出現(xiàn)內(nèi)外核層細(xì)胞排列不整齊；聯(lián)合組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)界膜水腫明顯減輕，各層細(xì)胞排列趨于規(guī)則，未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)圖1。

A:對(duì)照組 B:模型組 C: BMSC組 D: 聯(lián)合組 圖1 各組視網(wǎng)膜病理組織學(xué)觀察圖 (HE染色，×200)Fig 1 Histopathological observation of retina of rats in each group (HE staining, ×200)

2.4 各組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

對(duì)照組視網(wǎng)膜未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞；模型組視網(wǎng)膜內(nèi)大量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI) 明顯高于對(duì)照組；BMSC組和聯(lián)合組視網(wǎng)膜發(fā)現(xiàn)部分陽(yáng)性細(xì)胞，BMSC組、聯(lián)合組視網(wǎng)膜細(xì)胞AI 明顯低于模型組，而聯(lián)合組視網(wǎng)膜陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于BMSC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， 見(jiàn)表 3、圖 2。

2.5 各組視網(wǎng)膜組織CD45表達(dá)比較

CD45在對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)很弱，而在模型組大鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)較強(qiáng)，染色為棕黃色和褐色。與模型組比較，BMSC組和聯(lián)合組大鼠視網(wǎng)膜中CD45的表達(dá)明顯減弱，與BMSC組比較，聯(lián)合組減弱更明顯，見(jiàn)圖3。

表3 各組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI比較

A:對(duì)照組; B:模型組; C: BMSC組; D: 聯(lián)合組 圖2各組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL染色，×100)Fig 2 Detection of apoptosis of retinal nerve cells in each group (TUNEL staining, ×100).

A:對(duì)照組; B:模型組; C: BMSC組; D: 聯(lián)合組 圖3 各組視網(wǎng)膜組織 CD45表達(dá)檢測(cè)(免疫組化染色，×200)Fig 3 The expression of CD45 in retina of rats in each group (immunohistochemistry staining, ×200)

2.6 各組視網(wǎng)膜組織VEGF、HIF-1α、ANGⅡ mRNA的表達(dá)比較

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α及ANGⅡ mRNA表達(dá)明顯升高；而B(niǎo)MSC組和聯(lián)合組視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α及ANGⅡ mRNA的表達(dá)水平有所下降，且聯(lián)合組較BMSC組下降更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， 見(jiàn)表 4。

表4 各組視網(wǎng)膜組織中VEGF、HIF-1α、ANGⅡmRNA表達(dá)比較

注:與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與 BMSC組比較，▲P<0.05。

2.7 各組視網(wǎng)膜組織p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組視網(wǎng)膜組織中p-p38、p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯升高；與模型組比較，BMSC組和聯(lián)合組p-p38、p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)明顯下降，且聯(lián)合組較BMSC組下降更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而各組間p38、p65與IκBα蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4、表5。

表5 各組視網(wǎng)膜組織中p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

A:對(duì)照組； B:模型組； C: BMSC組； D: 聯(lián)合組 圖4 各組視網(wǎng)膜組織中p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)Fig 4 Expression of p38 MAPK / NF-κ B signaling pathway related proteins in retina of rats in each group

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變作為引起致盲的多因素微血管疾病，是糖尿病最常見(jiàn)并發(fā)癥之一，其發(fā)病率也不斷上升[4]。DR發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展與持續(xù)性代謝紊亂有關(guān)，由其引起的血液中炎性細(xì)胞因子水平升高會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管滲漏和水腫，視網(wǎng)膜血管基底膜逐漸增厚以及周細(xì)胞丟失等現(xiàn)象[2,11]。為了闡明DR的復(fù)雜性，以及探究診治該疾病的新藥物或有效的療法，使用糖尿病動(dòng)物模型進(jìn)行研究是必不可少的。目前，使用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)是常見(jiàn)的糖尿病模型構(gòu)建方法之一，已廣泛用于常規(guī)的基礎(chǔ)研究和藥物治療實(shí)驗(yàn)中[12]。本研究采用此方法來(lái)構(gòu)建大鼠糖尿病模型，觀察大鼠視網(wǎng)膜病變情況。研究結(jié)果顯示，經(jīng)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)后，模型組血糖明顯增加，胰島素水平明顯下降，大鼠血清中炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α含量均明顯升高，通過(guò)組織病理學(xué)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜組織發(fā)生明顯病變。以上結(jié)果均說(shuō)明成功構(gòu)建了大鼠DR模型。

目前，BMSC在不同疾病如腫瘤、傷口愈合過(guò)程和自身免疫性疾病中均具有治療作用[13，14]。BMSC能夠分泌多種生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子可以調(diào)節(jié)其周圍微環(huán)境，有利于細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用以及與不同細(xì)胞類型間的交流。BMSC的分化潛能與其多能性也密切相關(guān)，這種效力使其能夠分化為受損或丟失的細(xì)胞類型，以便在損傷部位短暫地替換細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)和對(duì)抗應(yīng)激細(xì)胞損傷[15]。已有研究表明，在糖尿病視網(wǎng)膜病變中注射BMSC具有降低炎癥細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡和ROS水平的作用[16]。

已知α1-抗胰蛋白酶通過(guò)抑制胱天蛋白酶活性和氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)肝細(xì)胞、肺細(xì)胞和β細(xì)胞，并減少促炎細(xì)胞因子的分泌[9]。此外，α1-抗胰蛋白酶還可以抑制某些細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。研究表明，α1-抗胰蛋白酶能夠使自身胰島素抗體水平降低[17]，將α1-抗胰蛋白酶基因?qū)胄∈篌w內(nèi)能夠明顯減少T細(xì)胞對(duì)胰島B細(xì)胞的損害[18]。在胰腺移植模型中，α1-抗胰蛋白酶治療的糖尿病小鼠血清中TNF-α水平降低，且淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的減少。

高血糖、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元功能障礙是糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要因素[19]。在本研究中，通過(guò)α1-抗胰蛋白酶和BMSC作用的糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型中，血糖降低、胰島素含量增加，血清中炎癥因子含量下降，視網(wǎng)膜水腫明顯減輕，各層細(xì)胞排列趨于規(guī)則，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少。CD45廣泛存在于除成熟紅細(xì)胞和血小板外所有白細(xì)胞上，是細(xì)胞膜上信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵分子[20]。本研究結(jié)果顯示，α1-抗胰蛋白酶和BMSC聯(lián)合組視網(wǎng)膜組織中CD45表達(dá)明顯減弱，同時(shí)VEGF、HIF-1α、ANGⅡ mRNA的表達(dá)水平均明顯下降。VEGF作為促進(jìn)血管新生的關(guān)鍵性因子，HIF-1α、ANG Ⅱ參與DR的發(fā)生[21]。此結(jié)果說(shuō)明α1-抗胰蛋白酶聯(lián)合BMSC抑制了VEGF、HIF-1α、ANGⅡ的異常表達(dá)從而發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用。

綜上所述，α1-抗胰蛋白酶聯(lián)合BMSC能夠有效保護(hù)DR大鼠的視網(wǎng)膜組織，可能通過(guò)作用于p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α水平，抑制CD45 以及降低VEGF、HIF-1α、ANGⅡ 的表達(dá)，改善DR嚴(yán)重程度。本研究為臨床上治療DR提供了理論依據(jù)。