謝 玲，程 豐，龔國富

(鄂州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 鄂州 436000)

2019新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)是由SARS-CoV-2病毒感染引發(fā)的一種具有極強(qiáng)傳染性和致病性的新型傳染病。眾多研究報(bào)道表明[1]，免疫系統(tǒng)紊亂是COVID-19患者的重要臨床表現(xiàn)，也是導(dǎo)致患者進(jìn)展為重癥的重要因素。淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的核心成分，具備抵御和清除細(xì)菌、病毒等外來病原微生物的功能。然而，COVID-19患者表現(xiàn)出外周血T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞亞群顯著減少以及功能衰竭的現(xiàn)象[2-5]，說明COVID-19患者存在嚴(yán)重的免疫缺陷。鎂是人體正常新陳代謝所需的重要微量元素，具有重要的生理功能，而Mg2+缺乏與冠心病、X連鎖鎂離子通道缺陷原發(fā)性免疫缺陷病(XMEN)、高血壓等多種疾病相關(guān)。有研究顯示[6]，胞內(nèi)游離Mg2+減少可以導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面活化受體NKG2D表達(dá)缺陷，進(jìn)而降低免疫系統(tǒng)的抗病毒作用。林曉娥等[7]研究顯示，Mg2+內(nèi)流障礙可能是導(dǎo)致慢性HBV感染者CD8+T淋巴細(xì)胞功能耗竭的重要原因。Iotti等[8]根據(jù)COVID-19患者臨床表現(xiàn)和病理特征與Mg2+缺陷疾病所描述的癥狀和體征有相似之處，猜測Mg2+匱乏可能是導(dǎo)致COVID-19患者疾病進(jìn)程加重的重要原因。因此，人體內(nèi)Mg2+水平變化可能對COVID-19患者疾病進(jìn)程有重要影響。然而COVID-19患者血清或免疫細(xì)胞內(nèi)Mg2+變化如何？其與COVID-19患者淋巴細(xì)胞減少及部分淋巴細(xì)胞功能衰竭有無關(guān)聯(lián)？目前還不明確。為此本研究初步分析COVID-19患者血清和外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中Mg2+水平變化情況，并探討其變化對CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月20日～2月20日期間在鄂州市中心醫(yī)院收治的經(jīng)確診為COVID-19患者165例。COVID-19診斷標(biāo)準(zhǔn)符合由國家衛(wèi)生健康委辦公廳和國家中醫(yī)藥管理局辦公室聯(lián)合發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》，根據(jù)該診療方案中臨床分型標(biāo)準(zhǔn)將患者分為輕型/普通型組和重型/危重型組。輕型/普通型組98例，其中男性53例，女性45例，平均年齡(57.15±11.35)歲；重型/危重型組67例，其中男性32例，女性35例，平均年齡(59.74±13.64)歲。同時(shí)選取34例健康體檢者作為對照組，其中男性18例，女性16例，平均年齡(57.81±14.15)歲。所有患者年齡、性別、基礎(chǔ)病史(高血壓、糖尿病、心腦血管疾病等)等基本資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 儀器與試劑

FITC-CD3、APC-Cy7-CD8、PE-Cy7-CD56、APC-PD-1和PE-NKG2D熒光抗體購自美國BD公司；熒光探針Mag-Fura4-AM購自美國Thermo Fisher Scientific公司；流式細(xì)胞儀(型號：DxFLEX)和全自動(dòng)生化分析儀(型號：AU5800)均購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 外周血PBMCs分離

采集患者和健康體檢者空腹靜脈血樣5 mL，置于含有肝素鈉的抗凝管中，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMCs，并將細(xì)胞重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞計(jì)數(shù)

取100 μL抗凝血，加入20 μL熒光抗體(FITC-CD3、APC-Cy7-CD8、PE-Cy7-CD56)，室溫避光孵育15 min。加入2 mL溶血?jiǎng)?，混勻，室溫避光孵?0 min，300 g離心5 min，棄上清，再加入2 mL PBS重懸細(xì)胞，300 g離心5 min，棄上清。加入1 mL含有1%多聚甲醛的PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測并計(jì)數(shù)，以“CD3+CD8+”雙陽性細(xì)胞表示CD8+T淋巴細(xì)胞，以“CD3-CD56+”細(xì)胞表示NK細(xì)胞。

1.5 血清及PBMCs細(xì)胞中Mg2+水平檢測

采用全自動(dòng)生化分析儀直接檢測血清中Mg2+水平。取分離的PBMCs細(xì)胞，經(jīng)HEPES緩沖液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取0.5 mL細(xì)胞懸液(5×105個(gè))于EP管中，再加入10 μL終濃度為3 μmol/L的鎂離子熒光探針Mag-Fura4-AM溶液，室溫避光孵育30 min，300 g離心5 min，棄上清，加入0.5 mL HEPES緩沖液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.6 CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面抑制受體PD-1和激活受體NKG2D水平檢測

取分離的PBMCs細(xì)胞，經(jīng)HEPES緩沖液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取0.5 mL細(xì)胞懸液(5×105個(gè))于EP管中，依次加入FITC-CD3、APC-Cy7-CD8、PE-Cy7-CD56、APC-PD-1、和PE-NKG2D熒光抗體，混勻后室溫孵育1 h，300 g離心5 min，棄上清，加入0.5 mL HEPES緩沖液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。以“CD3+CD8+PD-1+”和“CD3+CD8+NKG2D+”細(xì)胞亞群比例分別表示CD8+T淋巴細(xì)胞表面抑制受體PD-1和活化受體NKG2D表達(dá)水平；以“CD3-CD56+PD-1+”和“CD3-CD56+NKG2D+”細(xì)胞亞群比例分別表示NK細(xì)胞表面抑制受體PD-1和活化受體NKG2D表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 COVID-19患者外周血CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞計(jì)數(shù)變化

與對照組比較，輕型/普通型組和重型/危重型組患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低，同時(shí)重型/危重型組患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于輕型/普通型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 外周血CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞計(jì)數(shù)比較(個(gè)

2.2 COVID-19患者血清及PBMCs中Mg2+水平變化

與對照組比較，輕型/普通型組和重型/危重型組患者血清及PBMCs中Mg2+水平均明顯降低，而重型/危重型組患者血清及PBMCs中Mg2+水平均低于輕型/普通型組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組Mg2+水平比較

2.3 COVID-19患者CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面受體表達(dá)變化

與對照組比較，輕型/普通型組和重型/危重型組患者CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面抑制受體PD-1表達(dá)水平明顯升高，而活化受體NKG2D表達(dá)水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與輕型/普通型組比較，重型/危重型組CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面抑制受體PD-1表達(dá)水平升高，活化受體NKG2D表達(dá)水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞表面抑制受體PD-1和活化受體NKG2D表達(dá)水平比較

2.4 COVID-19患者M(jìn)g2+水平與細(xì)胞表面受體表達(dá)相關(guān)性分析

COVID-19患者血清和PBMCs中Mg2+水平與CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面抑制受體PD-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，而與活化受體NKG2D表達(dá)水平呈正相關(guān)性(P<0.05)。見表4。

表4 Mg2+水平與CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面受體PD-1和NKG2D表達(dá)相關(guān)性

3 討論

在病毒早期感染過程中，NK細(xì)胞可無需抗原預(yù)先致敏就可以殺死靶細(xì)胞，而在病毒持續(xù)性感染過程中T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)起著重要作用[9]。CD8+T淋巴細(xì)胞的活化可以釋放穿孔素、顆粒酶、IFN-γ等小分子物質(zhì)，特異性介導(dǎo)靶細(xì)胞裂解或凋亡，從而有效清除宿主病毒。而CD4輔助T細(xì)胞可輔助CD8+T淋巴細(xì)胞活化，增強(qiáng)其病毒清除能力。然而大多數(shù)COVID-19患者出現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞減少的現(xiàn)象[10]，具體原因還不明確。本研究結(jié)果顯示，COVID-19患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞減少，并且在重型/危重型患者中表現(xiàn)的更為顯著。而李泉等[11]研究顯示，在SARS-CoV-2病毒感染的無癥狀患者中并未表現(xiàn)出外周血淋巴細(xì)胞減少的現(xiàn)象。據(jù)此推測，COVID-19患者出現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞減少的現(xiàn)象可能是因淋巴細(xì)胞功能缺陷導(dǎo)致自身大量被消耗所致。

眾所周知，在病毒持續(xù)性感染的過程中普遍存在T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞功能缺陷的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致疾病進(jìn)展較快[12]。目前，普遍認(rèn)為該現(xiàn)象與免疫細(xì)胞表面PD-1、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)、NKG2A等抑制受體高表達(dá)以及NKG2D、CD38、人類白細(xì)胞DR抗原(HLA-DR)等活化受體低表達(dá)相關(guān)[13]。淋巴細(xì)胞功能缺陷將導(dǎo)致機(jī)體對病毒感染的控制能力降低，使患者病情難以控制以及進(jìn)一步惡化。Zheng等[5]研究顯示，COVID-19患者CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少以及出現(xiàn)明顯的功能耗竭，而恢復(fù)期患者CD8+T和NK細(xì)胞數(shù)量及功能逐漸恢復(fù)。與此同時(shí)，Diao等[14]研究也顯示，COVID-19患者T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，T淋巴細(xì)胞表面抑制性受體PD-1和Tim-3表達(dá)明顯升高。提示，COVID-19患者也出現(xiàn)不同程度的淋巴細(xì)胞功能耗竭的現(xiàn)象。而本研究結(jié)果也顯示，COVID-19患者CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面抑制性受體PD-1表達(dá)水平升高，而活化性受體NKG2D表達(dá)水平降低，說明COVID-19患者存在CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞耗竭的現(xiàn)象，并且在重型/危重型患者中尤為突出。淋巴細(xì)胞功能耗竭一方面可導(dǎo)致其抗病毒能力減弱，另外一方面其表面抑制受體的高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15]。因此，COVID-19患者T淋巴細(xì)胞減少可能與細(xì)胞功能耗竭有關(guān)。

Mg2+可作為第二信使通過淋巴細(xì)胞受體通路調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞活性，對淋巴細(xì)胞的抗病毒活性具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。Diao等[16]研究證實(shí)，胞內(nèi)Mg2+水平降低可導(dǎo)致HBV患者外周血CD8+T 細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能耗竭。林曉娥等[7,17]研究顯示，Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(MagT1)表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)的Mg2+內(nèi)流障礙可能是導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞功能耗竭的重要原因。然而，COVID-19患者CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞功能耗竭是否與患者體內(nèi)Mg2+水平變化有關(guān)，目前還不明確。本研究結(jié)果顯示，COVID-19患者血清及PBMCs中Mg2+水平顯著降低，而且在重型/危重型患者M(jìn)g2+水平降低地更為明顯。隨后相關(guān)性分析結(jié)果顯示COVID-19患者血清及PBMCs中Mg2+水平變化與CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表面抑制分子PD-1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性，而與激活分子NKG2D表達(dá)水平呈正相關(guān)性。說明，COVID-19患者CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞功能耗竭可能與Mg2+水平降低有關(guān)。

綜上所述，COVID-19患者外周血CD8+T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞明顯減少并出現(xiàn)明顯的功能耗竭，其原因可能與體內(nèi)Mg2+水平降低有關(guān)，當(dāng)然該結(jié)論還需要更多的研究予以驗(yàn)證，但可提示補(bǔ)充Mg2+攝入量或許對COVID-19治療有輔助作用。