岳海振 蔡軍 馬新強(qiáng) 王英

聊城市中醫(yī)醫(yī)院骨科，山東 聊城 252000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是指絕經(jīng)后婦女卵巢功能衰退，雌激素分泌下降，成骨細(xì)胞性骨形成減少，破骨細(xì)胞功能性骨吸收增強(qiáng)，骨吸收大于骨形成，出現(xiàn)以骨量減少、骨強(qiáng)度降低、骨顯微結(jié)構(gòu)退變，骨脆性增加為特征的一種代謝性骨疾病[1]。PMOP又稱為Ⅰ型骨質(zhì)疏松癥，雌激素缺乏是PMOP的主要原因[2]。雌激素替代療法(estrogen replacement therapy，ERT)已被廣泛證實(shí)能有效地預(yù)防PMOP，但長(zhǎng)期應(yīng)用ERT也引發(fā)了一些副作用，如陰道流血、靜脈血栓、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤性疾病[3]。葛根素(puerarin，Pue)屬于植物雌激素，具有雌激素樣活性，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化，抑制破骨細(xì)胞性骨吸收和分化，同時(shí)具有改善骨代謝，減少骨吸收，促進(jìn)骨形成，增加骨密度作用[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察研究葛根素對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨密度、骨生物力學(xué)和骨代謝的影響，探索其潛在的作用機(jī)制，旨在為臨床運(yùn)用葛根素防治PMOP提供新方法和新思路。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與材料

SPF級(jí)16周齡雌性SD大鼠55只，體重320～350 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0005。葛根素注射液(100 mg/支，陜西安康制藥廠)，骨化三醇軟膠囊(蓋三淳，0.25 μg×10 s，正大制藥青島有限公司)。核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)、I型原膠原分子N端前肽(PINP)、人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)和骨鈣素(BGP)試劑盒均購于美國(guó)CUSABIO公司，雌激素受體(ER)多克隆抗體購于美國(guó)R & D公司，SP試劑盒購于武漢博士德公司。LunariDXA型雙能X射線骨密度檢測(cè)儀購于美國(guó)GE公司，MTS-858型骨生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)購于美國(guó)MA公司。

1.2 方法

1.2.1絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型：參考“雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)方法”構(gòu)造骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型[5]。嚴(yán)格無菌操作于大鼠背部正中線做長(zhǎng)約3 cm縱向切口，鈍性分離，逐層進(jìn)入腹腔，找到雙側(cè)菜花狀卵巢，結(jié)扎切除，徹底止血后間斷縫合，術(shù)后青霉素5萬U/d預(yù)防感染，1周后拆線。

1.2.2分組及藥物處理：術(shù)后8周評(píng)估造模成功率，成功造模評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：骨密度(BMD)峰值減少≥2.5 SD(標(biāo)準(zhǔn)差)。SD大鼠造模成功48只，造模成功率87%。按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、去卵巢組、葛根素組、骨化三醇組。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》(第4版)：人與動(dòng)物體表面積等效劑量比值，換算成大鼠的給藥劑量給予不同藥物干預(yù)6周[6]。正常組和去卵巢組：5 mL/kg 0.9%Nacl，ih，qd；葛根素組：葛根素35 mg/kg，ih，qd；骨化三醇組：0.25 μg，po，qd，連續(xù)給藥6周。

1.2.3標(biāo)本取材：藥物干預(yù)結(jié)束后，采用急性大失血法處死大鼠，取血8～10 mL，高速離心，3 000 r/min×10 min，EP管收集血清1～2 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。逐層剝離L4腰椎和雙側(cè)股骨，無菌生理鹽水濕紗布包裹，20 ℃保存。另留取椎體10%甲醛溶液固定，15%乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脫鈣14 d，制備石蠟切片，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4檢測(cè)各組血清骨代謝指標(biāo)：取出上清液，所有操作嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組血清RANKL、PINP、TRACP5b和BGP水平。

1.2.5檢測(cè)各組骨組織骨密度(BMD)和礦物含量(BMC)：取出待測(cè)大鼠L4腰椎和右股骨，在LUNAR雙能X線吸收掃描儀掃測(cè)，采用小物體Discovery Wi掃描模式，用儀器選定興趣區(qū)，以2.0 mm×2.0 mm為中心區(qū)域，應(yīng)用軟件分析計(jì)算BMD和BMC值。

1.2.6檢測(cè)各組骨生物力學(xué)指標(biāo)：取出右側(cè)股骨，游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨長(zhǎng)度，將置于電子萬能生物力學(xué)材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行三點(diǎn)彎曲力學(xué)試驗(yàn)，固定骨標(biāo)本位置，保持標(biāo)本上下面水平，支點(diǎn)跨距20 mm，最大量程1 000 N，加載速度1 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄儀記錄載荷-變形曲線。

1.2.7免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測(cè)各組骨組織ER表達(dá)：參照SP法進(jìn)行操作，脫蠟水化，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶，高溫高壓修復(fù)抗原，血清封閉特異性蛋白，加ER抗體孵育50 μL(1∶200)，4 ℃冰箱過夜，添加二抗(IgG，1∶200)室溫下孵育，DAB顯色，復(fù)染脫水，透明封片，顯微鏡下觀察，高倍鏡每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)視野，取其均值。

1.2.8HE染色觀察各組骨組織形態(tài)學(xué)變化：參照HE染色法操作步驟，二甲苯、無水乙醇脫蠟水化，蘇木精染/伊紅染色，梯度乙醇脫水，甲苯透明后封片，顯微鏡觀察染色效果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)

去卵巢組血清RANKL、PINP、TRACP5b和BGP水平較正常組均顯著增高(P<0.05)，骨化三醇組和葛根素組血清RANKL、PINP、TRACP5b和BGP水平較去卵巢組均顯著降低(P<0.05)，葛根素組血清水平較骨化三醇組均降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)比較Table 1 Comparison of serum bone metabolism markers between each group

2.2 各組大鼠骨組織BMD和BMC

去卵巢組腰椎和股骨BMD和BMC較正常組顯著降低(P<0.05)，骨化三醇組和葛根素組BMD和BMC較去卵巢組均增高(P<0.05)，葛根素組BMD和BMC較骨化三醇組均增高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腰椎和股骨BMD和BMC比較Table 2 Comparison of BMD and BMC in the lumbar spine and femur between each group

2.3 各組大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)

去卵巢組股骨最大載荷、最大應(yīng)力、最大位移和剛度較正常組均顯著降低(P<0.05)，骨化三醇組和葛根素組骨生物力學(xué)指標(biāo)較去卵巢組均顯著增高(P<0.05)，葛根素組骨生物力學(xué)指標(biāo)較骨化三醇組均增高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較Table 3 Comparison of biomechanical indexes of the femur between each group

2.4 各組大鼠骨組織ER表達(dá)

ER蛋白主要表達(dá)于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞胞核，陽性反應(yīng)呈棕黃色顆粒狀。正常組、去卵巢組、骨化三醇組、葛根素組分別為(ER陽性細(xì)胞數(shù)/個(gè))：2.02±0.36、0.97±0.23、1.34±0.25、1.86±0.30。去卵巢組ER蛋白表達(dá)較正常組均顯著降低(P<0.05)，骨化三醇組和葛根素組ER蛋白表達(dá)較去卵巢組均顯著增高(P<0.05)，葛根素組ER蛋白表達(dá)較骨化三醇組均增高(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)各組大鼠骨組織ER表達(dá)(10×40)A：正常組；B：去卵巢組；C：骨化三醇組；D：葛根素組Fig.1 Immunohistochemical detection to observe the ER expression in bone tissue of rats in each group (10×40)A: Normal group; B: Ovariectomized group; C: Calcitriol group; D: Puerarin group

2.5 各組大鼠腰椎骨形態(tài)學(xué)改變

正常組骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)致密完整，骨小梁飽滿粗大，排列密集有序，髓腔小。去卵巢組骨皮質(zhì)明顯變薄，骨小梁稀疏纖細(xì)或斷裂，排列紊亂，髓腔明顯擴(kuò)大，空泡樣脂肪細(xì)胞增多。骨化三醇組骨皮質(zhì)變厚，骨小梁數(shù)量稍增多，排列尚規(guī)則，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)略微修復(fù)，骨髓腔稍小，造血細(xì)胞數(shù)量稍多。葛根素組骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)較完整，小梁數(shù)目明顯增多，致密均勻粗壯，骨髓腔變小，造血細(xì)胞數(shù)量較多。見圖2。

圖2 HE染色觀察各組腰椎骨組織形態(tài)學(xué)變化(10×40)A：正常組；B：去卵巢組；C：骨化三醇組；D：葛根素組Fig.2 HE staining to observe the morphological changes of the lumbar vertebrae in each group (10×40)A: Normal group; B: Ovariectomized group; C: Calcitriol group; D: Puerarin group

3 討論

PMOP已成為中老年婦女的常見病和多發(fā)病，列為“世紀(jì)慢性隱形疾病”，骨折是PMOP的常見并發(fā)癥，嚴(yán)重危害中老年人健康生活[7]。女性卵巢功能衰竭所致雌激素分泌下降是PMOP發(fā)病的主要原因[8]。雌激素通過與成骨細(xì)胞受體結(jié)合，直接促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及其基質(zhì)蛋白合成，通過與破骨細(xì)胞的受體結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的溶骨性骨吸收功能[9]。當(dāng)雌激素水平下降，其對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用減弱，溶骨破骨功能增強(qiáng)，破骨與成骨明顯失衡，骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致骨質(zhì)逐漸丟失[10]。ERT可以減少或預(yù)防雌激素不足引起的骨量丟失，并能防治PMOP。ERT曾被認(rèn)為是治療PMOP的首選方案，但其副作用、危險(xiǎn)性突出，限制了其臨床上治療PMOP[11]。因此尋找探索更安全有效、副作用更少的藥物代替ERT是一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。研究表明植物雌激素可替代治療PMOP[12]。

Pue是從天然植物豆科植物野葛根中提取分離出的一種異黃酮類化合物，屬于植物雌激素，與雌激素結(jié)構(gòu)類似，藥理作用廣泛，具有多種藥理活性作用[13]。近年來，其在防治骨質(zhì)疏松方面日益受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)Pue能與內(nèi)源性雌激素受體結(jié)合，對(duì)骨產(chǎn)生雌激素樣作用，不僅能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化功能，直接抑制破骨細(xì)胞性骨吸收和分化，改善骨代謝；而且還能增加骨礦密度和骨強(qiáng)度含量，改善骨生物力學(xué)，使其有抗骨吸收、促進(jìn)骨形成的作用[14]。

本研究結(jié)果提示葛根素組大鼠血清骨代謝指標(biāo)、腰椎和股骨BMD和BMC、股骨骨生物力學(xué)指標(biāo)較去卵巢組顯著升高(P<0.05)，葛根素組骨組織ER陽性細(xì)胞數(shù)較去卵巢組顯著增加(P<0.05)。葛根素組骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)較完整，骨小梁數(shù)目增多，致密均勻粗壯，連接成網(wǎng)狀，髓腔變小，造血細(xì)胞數(shù)量較多。說明葛根素通過提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠雌激素水平，調(diào)節(jié)維持骨代謝，增加骨密度和骨強(qiáng)度，提高骨生物力學(xué)性能，改善骨組織病態(tài)結(jié)構(gòu)。所以作者推測(cè)葛根素預(yù)防PMOP的主要作用機(jī)制可能是通過作用于骨細(xì)胞雌激素受體，發(fā)揮雌激素樣生理效應(yīng)，調(diào)節(jié)骨代謝，增加骨量骨強(qiáng)度，改善骨結(jié)構(gòu)，起到抗骨質(zhì)疏松作用。黃彤等[15]研究表明葛根素可增加去卵巢大鼠骨礦含量、骨密度和骨強(qiáng)度作用，改善骨質(zhì)疏松的生物學(xué)效應(yīng)。大量體外細(xì)胞學(xué)研究表明葛根素能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化功能，促進(jìn)骨形成，并呈濃度依賴性[16-17]。臨床研究表明葛根能明顯改善絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松患者骨密度、VAS、活動(dòng)能力等方面的臨床癥狀，且安全性高[18-19]。

綜上所述，中醫(yī)藥在防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有著悠久的歷史，葛根素通過提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠雌激素水平，調(diào)節(jié)骨代謝，增加骨密度和骨強(qiáng)度，改善骨生物力學(xué)性能和骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，起到抗骨質(zhì)疏松療效和骨保護(hù)作用。葛根素因其毒副作用小，安全有效，給絕經(jīng)后婦女帶來了福音，但還需進(jìn)一步做大量的基礎(chǔ)和臨床研究。中草藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的巨大寶庫，期待進(jìn)一步在分子水平上更深入的研究，提高其生物利用度及藥物的靶向作用，使其能充分發(fā)揮藥理活性，提高藥物的臨床療效。