楊青坡 穆合塔爾·買買提熱夏提 王法正* 高廣文 付岳松

1.新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院運動醫(yī)學(xué)科，新疆 喀什 844000 2.新疆維吾爾自治區(qū)哈密市中心醫(yī)院骨科，新疆 哈密 839000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)患者臨床特征較為明顯，骨量減少、骨組織結(jié)構(gòu)突變?yōu)樘卣鳎抢夏耆巳褐卸喟l(fā)的骨骼系統(tǒng)疾病[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松是由于骨骼形成能力低于骨吸收速度所致，臨床西醫(yī)的治療藥物價格偏高、患者耐受程度、藥物吸收程度不同，遠(yuǎn)期療效欠佳[2]。機體組織由于老化、炎癥、雌激素缺乏等原因使線粒體損傷，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB炎癥信號的激活，減少骨細(xì)胞形成，使骨細(xì)胞增殖，分化能力降低，加重病情[3-4]。姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，其對骨質(zhì)疏松亦有一定的防治作用，但關(guān)于其作用機制尚未完全闡明[5]。運動干預(yù)在改善骨質(zhì)疏松上有重要作用，且不會增加患者腎臟負(fù)擔(dān)，還能減少藥物對患者身體的進一步損害[6]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

姜黃素200 mg/kg(南京景竹生物)，Trizol試劑(浙江AMEKO)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢賽維爾)，RPMI-1640培養(yǎng)基(上海一研)，直線數(shù)字化雙能 X 線骨密度儀(法國邁迪)。

1.2 模型建立和分組

自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心購買40只體重為180～225 kg的SPF級雌性大鼠，按照骨密度水平平均分成4組，Dd組(OP模型+姜黃素)、Lh組(OP模型+姜黃素+有氧運動)、Op組(OP模型)、Zc組(假手術(shù)組)。

1.3 治療方法和有氧運動

姜黃素干預(yù)方法參考文獻(xiàn)[7]。大鼠自由活動，Lh組除正?；顒油饷咳者€要進行跑臺訓(xùn)練，前2周適應(yīng)性訓(xùn)練。跑步速度從最開始的10 m/min逐漸增加到25 m/min，訓(xùn)練時間從最開始的15 min/d逐漸增加到60 min/d，從第三周開始，每天的訓(xùn)練時間固定為60 min/d，共訓(xùn)練10周[8]。

1.4 骨密度、氧化應(yīng)激能力測定

血清NOS、SOD活力、MDA水平檢測：取大鼠尾靜脈血，離心分離血清，運用生化法測血清中NOS、SOD活力、MDA水平。骨密度：采血完畢后，麻醉大鼠處死，取股骨，利用X射線骨密度儀測定大鼠股骨密度。組織提取參考文獻(xiàn)[8]。

1.5 骨小梁體積百分比檢測

將低溫保存骨組織，采用全自動圖像數(shù)字化學(xué)分析儀檢測骨小梁體積百分比(TBV%)：指骨小梁體積占骨髓腔總體積的百分比。

1.6 HE染色

將大鼠右側(cè)脛骨切片后，甲醛溶液固定，脫水時用乙醇溶液，石蠟包埋后切片4 μm，封閉時中性樹膠，蘇木精和伊紅染色液復(fù)染分別為6～8 min和10 s，于顯微鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)改變情況。

1.7 RT-PCR檢測NF-κB水平變化

將胰蛋白酶加入大鼠右側(cè)脛骨組織中進行消化反應(yīng)，總RNA采用rizol法來提取，總RNA提取反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，按全說明書進行實驗，內(nèi)參采用β-actin，60℃，10 min，95 ℃、72℃，各 30 s，95 ℃，5 min，循環(huán)次數(shù)以40為準(zhǔn)，實驗次數(shù)至少3次，用相對定量2-ΔΔCT計算NF-κB表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 Western blot法檢測NF-κB蛋白表達(dá)

取大鼠右側(cè)脛骨組織用PBS溶液來洗滌，并與胰蛋白酶提取液按照1∶100進行混合，使組織完全裂解，成為E溶液；在EP管中按照1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 mL，使組織完全裂變成為F溶液，把E和F溶液以80∶1的體積進行搖勻，放入37.5 ℃的保溫箱中20 min，冷卻后計算NF-κB蛋白濃度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

用 SPSS 19.0 軟件對各組的指標(biāo)變化情況進行統(tǒng)計和分析，用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示計算出的結(jié)果，Dd組、Lh組、Op組、Zc組進行對比，采用χ2或t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度變化情況

與Zc組比較，其余3組腿股骨骨密度均下降(P<0.05)，與Op組比對，Dd組腿股骨骨密度提升(P<0.05)，與Dd組比對，Lh組骨密度增長(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠骨密度變化情況Fig.1 Changes of bone mineral density of rats in each group注：與Dd組比較，aP<0.05；與Lh組比較，bP<0.05；與Op組比較，cP<0.05。

2.2 骨小梁體積百分比比較

Zc組骨小梁體積百分比[(29.15±5.45)%]顯著高于OP組[(10.11±4.09)%](P<0.05)，Dd組后升高至(21.08±5.03)%，聯(lián)合運動干預(yù)后LH組為(25.55±6.33)%，均與OP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 氧化應(yīng)激能力

骨質(zhì)疏松大鼠Op組GSH-Px、SOD值下降、MDA值升高(P<0.05)，運動聯(lián)合藥物干預(yù)后Lh組大鼠GSH-Px、SOD值升高、MDA值下降(P<0.05)，4組氧化應(yīng)激能力比對差距顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激能力Table 2 Oxidative stress capacity of rats in each group

2.4 HE染色

Zc組骨小梁結(jié)構(gòu)良好未有明顯病理改變，Op組骨小梁病理改變較重，骨小梁粗細(xì)不均，排列不規(guī)則，且有多處骨髓區(qū)未見骨小梁結(jié)構(gòu)，Dd組較Op組有所好轉(zhuǎn)，部分骨髓區(qū)無骨小梁結(jié)構(gòu)，排列狀態(tài)好于Op組，Lh組部分骨小梁結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，骨髓區(qū)均有骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，僅有少數(shù)排列不均。見圖2。

圖2 各組大鼠HE染色(×200)Fig.2 HE staining of rats in each group (×200)

2.5 RT-PCR檢測NF-κB mRNA水平變化

與Zc組比對，Op組大鼠NF-κB mRNA水平上升(P<0.05)，與Op組比對，Dd組、Lh組大鼠NF-κB mRNA水平均下降(P<0.05)，且Lh組NF-κB mRNA水平低于Dd組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠NF-κB mRNA水平變化情況Fig.3 Changes of NF-κ B mRNA level of rats in each group注：與Dd組比較，aP<0.05；與Lh組比較，bP<0.05；與Op組比較，cP<0.05。

2.6 Western blot法檢測NF-κB蛋白表達(dá)

與Zc組比對，Op組NF-κB蛋白上升(P<0.05)，與3組大鼠NF-κB蛋白下降(P<0.05)，且Lh組NF-κB蛋白表達(dá)低于Dd組(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠NF-κB蛋白表達(dá)變化Fig.4 Changes of NF-κ B protein expression of rats in each group注：與Dd組比較，aP<0.05；與Lh組比較，bP<0.05；與Op組比較，cP<0.05。

3 討論

姜黃素從姜科植物根莖中提取出來，在抑制過氧化反應(yīng)較為出色，同時具有抗炎癥作用[9-10]。NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控眾多疾病因子，不少研究均已證實NF-κB 在OP的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用[11]。研究顯示，適度舒適的有氧運動會使大腦分泌一種生物活性物質(zhì)，可與腦循環(huán)的免疫細(xì)胞結(jié)合，幫助免疫細(xì)胞維持正常功能，增加抗氧化酶SOD等活性，通過調(diào)控細(xì)胞對OP患者骨組織起到保護作用[12-13]。

OP大鼠組織中GSH-Px、SOD活性降低，使不飽和脂肪酸受到攻擊，導(dǎo)致組織細(xì)胞膜磷脂出現(xiàn)過氧化，通過有氧運動干預(yù)手段提升其活性后，病情能得到明顯改善[14]。OP患者機體組織細(xì)胞呈現(xiàn)過氧化狀態(tài)，自由基的氧化性改變，發(fā)生糖基化，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)功能異常使骨質(zhì)疏松癥狀加重，而姜黃素有清除自由基的作用。有研究者證實，姜黃素對去卵巢絕經(jīng)后OP大鼠、甲酸誘導(dǎo)OP大鼠的骨組織均有保護作用，促進骨小梁再生，提高骨密度并通過誘導(dǎo)抗氧化酶將多種超氧化物、過氧化物進行分解或還原從而起到抗氧化的作用。

有文獻(xiàn)報道，炎癥信號最先轉(zhuǎn)入細(xì)胞膜中，通過細(xì)胞中I-κB 激酶等途徑使增加NF-κB活性進行特異性識別，出現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控引發(fā)炎癥損傷，NF-κB 的活性增加引起免疫抑制，使OP處于進展?fàn)顟B(tài)。本實驗中大鼠由于雌激素缺乏出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀，而雌激素缺乏會使機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致骨小梁數(shù)量減少、厚度變薄、骨密度降低等狀況發(fā)生。有研究證實，姜黃素可作用于靶基因減弱NF-κB 活性，對炎性因子的釋放產(chǎn)生抑制效果，能夠顯著抑制果酸、雌激素缺乏大鼠的OP發(fā)展進程。目前臨床上已經(jīng)把運動和藥物治療聯(lián)合在一起，大量文獻(xiàn)表明骨質(zhì)疏松后經(jīng)過臨床治療和運動訓(xùn)練是可以改善患者的病情，有些患者還可以提高生活自理能力，骨質(zhì)疏松患者沒有經(jīng)過長期的運動訓(xùn)練僅僅依靠藥物治療，恢復(fù)的能力和患者的體質(zhì)和心理狀況，都遠(yuǎn)不及參加運動和臨床一起治療的患者的恢復(fù)程度[15]。

綜上所述，姜黃素聯(lián)合有氧運動能明顯改善OP大鼠骨密度、氧化應(yīng)激能力，降低骨組織中NF-κB表達(dá)。