張小鈺 陳慧 馬敬祖 馬志榮 汪玉海*

1.西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院)，寧夏 銀川 750012 2.解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)940醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)的骨病，其特征是骨量降低和骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆弱性增加和骨折風(fēng)險(xiǎn)升高[1-2]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為一種日益重要的健康問(wèn)題，給全世界數(shù)百萬(wàn)人的家庭和本人帶來(lái)了嚴(yán)重的影響[3]。目前，治療這類骨質(zhì)疏松癥最常用的藥物包括二膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、甲狀旁腺激素(1～34)、RANK配體抑制劑和性激素[4]。然而，這些藥物的臨床療效受到藥物耐受性較差和長(zhǎng)期不良副作用的影響[5]，因此急需新的藥物來(lái)改善這類情況。黃芪多糖(astragalus polysaccharide，ASNT)是從中藥黃芪中提取、分離，純化所得主要有效活性成分，具有刺激骨髓造血和增強(qiáng)免疫功能的作用；近年來(lái)有研究指出ASNT能減輕絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的癥狀，但治療機(jī)理尚不清楚[6-7]。本研究的目的是研究黃芪多糖對(duì)雙側(cè)去卵巢手術(shù)誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松模型骨密度和骨量的影響，并探索獲得這種療效的可能機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立和治療

6月齡雌性Sprague-Dawley大鼠購(gòu)買(mǎi)于上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并飼養(yǎng)在12 h光暗循環(huán)，溫度控制在(22±2)℃和濕度控制在50%～60%的環(huán)境中。所有大鼠能自由接觸到實(shí)驗(yàn)室提供的標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物食物和水。在實(shí)驗(yàn)之前所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。隨后對(duì)大鼠進(jìn)行背側(cè)雙側(cè)去卵巢術(shù)(OVX)或假手術(shù)(Sham)，并將大鼠正常條件下飼養(yǎng)12周以達(dá)到成功構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥模型；隨機(jī)選擇10只OVX及Sham大鼠(每組5只大鼠)，通過(guò)測(cè)試骨密度(bone mineral density，BMD)驗(yàn)證成功建模。然后將大鼠分成3組，每組10只。CON組：Sham大鼠+生理鹽水。OVX組：OVX大鼠+生理鹽水；ASNT組：OVX大鼠給予400 mg/(kg·d)黃芪多糖(天津賽諾制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字220040086，藥物融入生理鹽水)灌胃治療，藥物劑量參考[8]。藥物治療12周后取出左股骨，用10%中性緩沖福爾馬林固定24 h，進(jìn)行BMD微型計(jì)算機(jī)斷層掃描檢查(Micro-CT)。將右股骨切片并在液氮中冷凍以用于Western印跡(WB)分析。所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2019016)。

1.2 血清測(cè)定中骨代謝指標(biāo)

給藥12周后稱重每組動(dòng)物，以10%水合氯醛4 mL/kg麻醉，并從腹腔動(dòng)脈取血以測(cè)量血清中雌二醇(E2)、鈣(Ca)、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OC)水平。使用原子吸收光譜儀檢測(cè)大鼠的血清鈣和雌二醇的水平；血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物包括堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OC)使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)，試劑盒由北京中肽生物科技有限責(zé)任公司提供。

1.3 骨密度測(cè)量

在10%中性緩沖福爾馬林中固定24 h后，左側(cè)股骨用生理鹽水沖洗2 h。骨密度使用專門(mén)的小動(dòng)物高分辨率骨密度儀(Discovery A/SL/W/C；HOLOGY，Bedford，MA，01730 USA)通過(guò)雙能量X射線吸收測(cè)量法測(cè)量大鼠股骨骨密度。

1.4 Micro-CT檢查

在骨密度測(cè)量后，左側(cè)股骨通過(guò)錐束臺(tái)式微型CT測(cè)量(μCT80，Sanco Medical，Brüttisellen，Switzerland)，并通過(guò)相關(guān)分析軟件(μCT80 Evaluation Program v6.51，Sanco Medical，Switzerland)進(jìn)行評(píng)估。掃描后選擇股骨遠(yuǎn)端高于生長(zhǎng)板1 mm的松質(zhì)骨作為VOI，該VOI僅限于股骨內(nèi)部區(qū)域，其中通過(guò)使用CT分析器軟件繪制自由形式等高線來(lái)提取小梁和皮質(zhì)骨。使用標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)勾勒松質(zhì)骨的微觀結(jié)構(gòu)，通過(guò)多平面重組獲得三維(3D)圖像；以確定骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV，%)、表面積體積分?jǐn)?shù)(BS/TV，mm-1)、骨小梁厚度(Tb.Th，μm)、骨小梁數(shù)目(Tb.N，mm-1)和骨小梁間隙(Tb.Sp，μm)。

1.5 WB檢測(cè)

左側(cè)股骨在液氮中粉碎后，用IP裂解緩沖液從骨組織中提取總蛋白。用BCA蛋白試劑盒定量測(cè)定蛋白濃度。將蛋白與加載緩沖液混合，在100 ℃煮沸5 min，使其變性。用10%和15%SDS-PAGE分離50 μg總蛋白，轉(zhuǎn)移到0.45 m聚偏氟乙烯(PVDF)膜中。用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h后，將膜分別和BMP-2、Smad1、p-Smad1、Smad5、p-Smad5一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。用ECL試劑(美國(guó)Thermo Scientific)顯影印跡。使用GAPDH蛋白進(jìn)行歸一化。用Image J軟件測(cè)量各蛋白條帶的總和密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 22.0軟件進(jìn)行。基于方差結(jié)果的同質(zhì)性檢驗(yàn)，使用Student’st檢驗(yàn)比較兩個(gè)不同組間差異。P<0.05判斷差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度和骨代謝指標(biāo)分析

各組大鼠之間的平均BMD結(jié)果如表1所示。CON組和OVX組比較時(shí)發(fā)現(xiàn)OVX組股骨BMD值和E2、Ca水平較CON組顯著降低(P<0.05)；而ASNT組BMD和Ca、E2水平較OVX組明顯升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。和CON組比較，OVX組ALP和OC顯著升高(P<0.05)；而ASNT組ALP和OC水平較OVX組明顯降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些結(jié)果表明ASNT能提高去卵巢大鼠骨密度和降低骨轉(zhuǎn)換速度。

表1 各組大鼠之間的平均BMD值結(jié)果Table 1 Mean BMD values results in the

2.2 ASNT對(duì)OVX大鼠股骨干骺端骨微結(jié)構(gòu)的影響

大鼠股骨干骺端骨小梁三維重建如圖1所示；骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)包括BV/TV、BS/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp，如圖2所示。與CON組相比，OVX組大鼠BV/TV(P=0.043)、BS/TV(P=0.000)、Tb.Th(P=0.002)和Tb.N(P=0.033)的水平顯著下降，而Tb.Sp(P=0.000)顯著增加。ASNT組的Tb.Sp水平顯著下降，而其他參數(shù)明顯增加(和OVX組比較，BV/TV：P=0.024；BS/TV：P=0.002；Tb.Th：P=0.000；Tb.N：P=0.025；Tb.Sp：P=0.000)。

圖1 ASNT骨質(zhì)疏松大鼠股骨三維重建顯微CT圖像的影響Fig.1 Assessment of the effect of ASNT on the femur of the osteoporosis rats in 3D-reconstructed micro-CT images

圖2 ASNT對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠微結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響Fig.2 Assessment of ASNT effect on micro-architectural parameters in osteoporosis rat model注：和CON組比較，**P<0.05，*P<0.01；和OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 ASNT增強(qiáng)OVX大鼠中的BMP-2/Smads信號(hào)傳導(dǎo)和骨形成

BMP-2、Smad1、p-Smad1、Smad5、p-Smad5的蛋白表達(dá)如圖3所示，OVX組大鼠BMP-2(P=0.000)、Smad1(P=0.009)、p-Smad1(P=0.000)、p-Smad5(P=0.009)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下調(diào)。而ASNT治療能有效上調(diào)BMP-2(P=0.000)、p-Smad1(P=0.000)和p-Smad5(P=0.025)的表達(dá)水平。

圖3 Western blot分析BMP-2、Smad1、p-Smad1、Smad5、p-Smad5蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blotting analysis of protein expressions of BMP-2, Smad1, p-Smad1, Smad5, and p-Smad5注：和CON組比較，**P<0.05，*P<0.01；和OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的形成是一個(gè)長(zhǎng)期的病理過(guò)程。骨密度和骨小梁微觀結(jié)構(gòu)變化可以反映出骨量的細(xì)微變化[9]。血清中的骨代謝指標(biāo)可以反映骨代謝的狀態(tài)，因此可以作為評(píng)價(jià)藥物療效的另一標(biāo)準(zhǔn)[10]。黃芪多糖在以往的研究已經(jīng)表現(xiàn)出促進(jìn)成骨和改善骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效果[11-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)以骨密度、血清骨代謝指標(biāo)和骨微觀結(jié)果變化為主要指標(biāo)研究黃氏多糖對(duì)取卵巢大鼠治療的效果。

絕經(jīng)后雌激素水平降低，并且T細(xì)胞被激活以促進(jìn)破骨細(xì)胞形成[13]。血清中的OC可以表明新形成的成骨細(xì)胞處于活躍狀態(tài)，而ALP是骨形成和骨轉(zhuǎn)換的重要生化指標(biāo)。血清中的OC水平可以表明新形成的成骨細(xì)胞處于活躍狀態(tài)，而ALP是骨形成和骨轉(zhuǎn)換的重要生化指標(biāo)[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組血清E2明顯降低，而OC水平顯著升高，表明成功建立了高轉(zhuǎn)化性骨質(zhì)疏松癥模型，與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的臨床特征相符[15]。黃芪多糖可以顯著增加大鼠血清中E2、ALP和OC的水平，表明黃芪多糖具有雌激素樣作用，并且可以通過(guò)降低血清中的ALP和OC來(lái)預(yù)防卵巢切除術(shù)后骨質(zhì)疏松的形成。本研究進(jìn)一步對(duì)股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行Micro-CT掃描發(fā)現(xiàn)去卵巢術(shù)后12周，OVX組大鼠的BV/TV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N明顯降低，而Tb.Sp明顯升高。在本研究中，ASNT治療12周后，BV/TV、BS/TV、Tb.Th和Tb.N與OVX大鼠相比顯著升高。相反，ASNT組大鼠股骨遠(yuǎn)端Tb.Sp與OVX組相比明顯降低。因此，本研究表明ASNT可以改善股骨的BMD和骨微結(jié)構(gòu)特性，和之前研究得出相似的結(jié)果[11-12]。

低BMP-2表達(dá)與低BMD和骨折高風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[16]。由于BMP-2可以通過(guò)激活I(lǐng)型激活素受體樣激酶和II型跨膜絲氨酸蘇氨酸Ki-Nase受體的異源四聚體復(fù)合物發(fā)揮作用，后者隨后磷酸化并激活受體調(diào)控因子Smad1、5、8；而磷酸化的Smad1、5、8因子與Smad4結(jié)合并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中以介導(dǎo)成骨相關(guān)基因的表達(dá)[17]。在本研究中，卵巢切除可以在蛋白質(zhì)水平上顯著下調(diào)BMP-2 和Smad1、p-Smad1和p-Smad5因子的表達(dá)。ASNT治療可以顯著逆轉(zhuǎn)OVX大鼠這些蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，明顯上調(diào)BMP-2 和Smad1、p-Smad1和p-Smad5的表達(dá)；上述結(jié)果表明ASNT治療可以刺激BMP-2/Smads信號(hào)通路的激活。

本研究有其不足之處，首先研究模型限制了研究結(jié)果進(jìn)一步推廣；其次劑量選取的原因只能證實(shí)本研究選取的劑量對(duì)去卵巢引起骨量流失保護(hù)作用，是否合適其他類型的骨質(zhì)疏松癥就不得而知了；由于沒(méi)有進(jìn)一步研究該藥物對(duì)細(xì)胞的影響，因此需要進(jìn)一步進(jìn)行體外研究驗(yàn)證其對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的影響。

本研究的結(jié)果表明黃芪多糖對(duì)BMD的積極影響，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)它對(duì)骨微結(jié)構(gòu)具有顯著的積極保護(hù)作用。另外，黃芪多糖治療后BMP-2/Smads信號(hào)通路的激活?？傊?，黃芪多糖可以作為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的有潛力治療藥物之一，治療效果可歸因于BMP-2/Smads信號(hào)通路的激活，具體效果如何還需要進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。