蔡梓紅 何可人 婁愛菊 葉文斌 葉苗漫 宋李治 黃闖 曾裕威 魏建國* 王簕*

1.廣州醫(yī)科大學，廣東 廣州 510089 2.廣州市荔灣中心醫(yī)院，廣東 廣州 510140 3.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院3D打印中心，廣東 廣州 510150 4.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510150

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種由多病因引起的破骨細胞和成骨細胞(osteoblast，OB)失衡，以單位體積內(nèi)骨量減少的代謝性骨疾病，嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，OP患者體內(nèi)氧化還原反應失衡，機體中AOPP水平越高則單位體積內(nèi)骨量越低[2]。晚期氧化蛋白(advanced oxidation protein products，AOPPs)作為氧化應激(oxidative stress，OS)的終產(chǎn)物之一，可以促進活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成[3]。因此推測OS可能與OP發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，AOPPs是OP進展的重要危險因素之一。

新近研究認為，HUMSCs可在組織損傷時分泌外泌體，促進組織再生，調(diào)控炎癥，抵抗OS作用[4]。單純移植干細胞由于其在體內(nèi)存活率較低[5]，不能持續(xù)發(fā)揮其對OS的調(diào)控效應。因此，近來應用干細胞條件培養(yǎng)基進行治療組織損傷已成為研究熱點[6]。

AOPPs可導致OB凋亡，線粒體(mitochondrion)是細胞發(fā)揮正常功能，保持活性的重要結(jié)構(gòu)。OS導致的細胞內(nèi)ROS過量積累，可引發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)受損,最終導致細胞凋亡[7]。有報道稱，干細胞來源的線粒體可以向損傷組織轉(zhuǎn)移，從而起到組織保護作用[8]。因此推測，干細胞可以通過保護線粒體，繼而為OB提供保護作用。本研究擬通過AOPPs刺激OB，觀察靶細胞內(nèi)線粒體的活性變化，探討線粒體在OS中的作用以及HUMSCs培養(yǎng)基是否能為氧化損傷后的OB提供保護作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、噻唑藍(MTT)、Annexin V-FITC/Propidium lodide(PI)細胞凋亡試劑盒購自sigma公司；胎牛血清購買自Hyclone公司；DMEM低糖培養(yǎng)基、干細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；Mito Tracker deep Red購自Thermo Fisher Scientific公司；Caspase-3單克隆抗體購買自Santa Cruz公司。

1.2 晚期氧化蛋白的體外制備

將20 mg/mL HSA無毒溶液與40 mmol/L次氯酸(HOCL)同體積混合培養(yǎng)，然后室溫下放置30 min，制得HSA與HOCL摩爾濃度比1∶140的AOPP。為了除去游離的HOCL，將上述制得的AOPPs在PBS無內(nèi)毒素溶液中透析24 h，后用0.22 μmol/L的微孔濾膜過濾除菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩BS與20 mg/mL HSA溶液同體積混合作為對照。在酸性條件下，以氯胺T為標準，測定AOPP在340 nm的吸光度值。

1.3 HUMSCs提取和條件培養(yǎng)基的制備

臍帶來自廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科干細胞庫，實驗室已建立完善的相關(guān)細胞培養(yǎng)鑒定方案，并發(fā)表相關(guān)文章[9]。臍帶取材后用PBS反復沖洗，洗凈臍動脈、靜脈內(nèi)殘留血液。剪碎至約1 cm×1 cm×1 cm組織塊，置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加入DMEM培養(yǎng)基直至完全覆蓋組織塊，1周后換液，觀察細胞形態(tài)，棄除非貼壁組織塊，以后每3 d換液，觀察細胞形態(tài)。細胞長至80%細胞融合度時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取第2代HUMSCs，按一定比例接種于培養(yǎng)皿中，當達到80%細胞融合度時，更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Fetal bovine serum DMEM Medium，F(xiàn)M)，繼續(xù)孵育48 h以后，收集培養(yǎng)基上清液，離心(4 000 r/min，20 min)，0.22 μmol/L過濾器過濾獲得條件培養(yǎng)基(HUMSC Conditioned Medium，CM)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 OB的培養(yǎng)與鑒定及實驗分組

第2代人成骨細胞由南方醫(yī)科大學創(chuàng)傷骨科贈予，南方醫(yī)科大學有完善的成骨細胞檢測方法流程，并發(fā)表相關(guān)文章[10]。實驗分為4組，正常對照組(Control組)；AOPP刺激組(AOPP組)：無血清DMEM中加入終濃度為200 μg/mL的AOPP；常規(guī)培養(yǎng)基組(AOPP+FM組)：在FM中加入最終濃度為200 μg/mL的AOPPs；條件培養(yǎng)基組(AOPP+CM組)：在CM中加入最終濃度為200 μg/mL的AOPPs。各組作用時間均為1 h。

1.5 OB凋亡檢測

收集上述分組細胞，用預冷的PBS液重懸細胞2次，加入適量1x結(jié)合緩沖液，輕吹打以重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×109/L，取100 μL細胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室內(nèi)溫度避光孵育15 min，加入5 μL PI輕輕混勻染色。按照Annexin V-FITC/PI雙染色法凋亡試劑盒說明書操作，準備好樣品后，上流式細胞儀進行凋亡率檢測。

1.6 Mito Tracker deep Red標記線OB內(nèi)線粒體

各組培養(yǎng)皿內(nèi)滴加同等適量無血清DMEM培養(yǎng)基并覆蓋蓋玻片進行爬片培養(yǎng)，當細胞長至80%融合度，洗除培養(yǎng)基，加入37 ℃預熱的Mito Tracker Red 染色工作液，孵育15 min后使用無菌PBS輕輕洗除表面殘余物，染色結(jié)束置于熒光顯微鏡下觀察，采用Image J v1.58軟件對視野下線粒體紅色標記的OB進行半定量計數(shù)。

1.7 OB線粒體活性定量檢測

按上述分組進行干預，收集細胞，用PBS稀釋至105個/mL，采用流式細胞儀進行檢測。激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為520～545 nm。

1.8 Caspase-3凋亡蛋白表達檢測

采用Western-Blot法。取各組細胞，PBS清洗，冰上裂解，離心后取蛋白上清液，用BCA試劑盒以定量檢測蛋白濃度，取25 g蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶(5%)封閉3 h，室溫封閉1 h。加入1∶1000稀釋的兔抗人Caspase-3抗體，4 ℃過夜，同1∶2000稀釋后二抗反應，室溫孵育1 h，ECL顯色，暗室曝光觀察。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 HUMSCs條件培養(yǎng)基細胞形態(tài)

按本研究設(shè)立方法提取和培養(yǎng)可獲得具有活性的HUMSCs，細胞生長情況良好(圖1)，HUMSCs條件培養(yǎng)基獲得后(圖1)，4 ℃保存?zhèn)溆谩嶒炇乙呀⑼晟频南嚓P(guān)細胞培養(yǎng)鑒定方法，并發(fā)表相關(guān)文章，有成骨分化圖[11]。

圖1 HUMSCs培養(yǎng)與條件培養(yǎng)基收集情況Fig.1 HUMSCs culture and collection of conditioned medium

2.2 各組OB凋亡檢測結(jié)果

流式細胞儀分析顯示，Control組中細胞凋亡率為2.5%，AOPP組為42.5%，AOPP+FM組為32.3%，AOPP+CM組為22.3%。其中，加入CM后，可以明顯降低AOPP作用下引起的OB凋亡率，并且AOPP+CM組細胞凋亡率明顯低于AOPP+FM組(P<0.05)(圖2)。

2.3 Mito Tracker deep Red標記各組OB內(nèi)活性線粒體實驗結(jié)果

與對照組相比，給予AOPP刺激后，OB內(nèi)活性線粒體染色數(shù)目明顯減少；在此基礎(chǔ)上，給予FM和CM后，可以降低AOPP作用，增加OB內(nèi)活性線粒體染色數(shù)目。特別是應用CM后，OB內(nèi)活性線粒體染色要多于FM作用組(圖3)。

2.4 OB內(nèi)線粒體活性定量分析實驗結(jié)果

進一步對各種條件干預后OB內(nèi)活性線粒體定量分析提示，對照組中OB活性線粒體為84.2%，AOPP組為29.5%，AOPP+FM組為64.9%，AOPP+CM組為77.4%。在AOPP+CM組中，OB內(nèi)活性線粒體染色率明顯高于AOPP+FM組(P<0.05)(圖4)。

2.5 Caspase-3凋亡蛋白表達檢測實驗結(jié)果

Western-Blot分析不同條件作用下，OB內(nèi)Caspase-3凋亡蛋白表達水平?？梢娊?jīng)過AOPP誘導的氧化損傷后，OB內(nèi)Caspase-3凋亡蛋白表達水平明顯升高，在加入FM或CM后可降低Caspase-3凋亡蛋白表達水平，其中AOPP+CM組下降最明顯(P<0.05)(圖5)。

圖2 各組OB凋亡檢測結(jié)果A：各組OB細胞凋亡百分比流式細胞圖；B：各組OB細胞凋亡百分比柱形圖Fig.2 Detection results of OB apoptosis in each group A: The percentage of apoptosis of OB cells in each group with flow cytometry; B: The histogram of the percentage of apoptosis of OB cells in each group注：*表示AOPP+CM組凋亡率要明顯低于AOPP+FM組(P<0.05)。

圖3 Mito Tracker deep Red 標記線粒體半定量分析結(jié)果A：標記各組OB內(nèi)活性線粒體實驗結(jié)果，紅色為活性線粒體；B：Image J細胞計數(shù)半定量分析柱狀圖Fig.3 The results of semi-quantitative analysis of mitochondria labeled with Mito Tracker deep RedA: The results showed that the active mitochondria in OB were marked in red; B: Histogram of image J cell count semi-quantitative analysis.

圖4 OB內(nèi)線粒體活性定量分析實驗結(jié)果A：各組OB內(nèi)線粒體活性定量分析百分比流式細胞圖；B：各組OB內(nèi)線粒體活性定量分析百分比柱形圖Fig.4 Experimental results of quantitative analysis of mitochondrial activity in OBA: The percentage flow cytometry was used for quantitative analysis of mitochondrial activity in OB in each group; B: Column chart of quantitative analysis percentage of mitochondrial activity in OB in each group.注：*表示AOPP+CM組活性線粒體含量要明顯高于AOPP+FM組(P<0.05)。

圖5 Caspase-3凋亡蛋白表達檢測實驗結(jié)果A：Western-blot印跡圖；B：Caspase-3凋亡蛋白定量分析百分比柱狀圖Fig.5 Experimental results of the expression of apoptotic protein Caspase-3 A: Imprint map of Western blotting; B: Caspase-3 Percentage histogram of apoptotic protein with quantitative analysis.注：*表示AOPP+CM組Caspase-3凋亡蛋白表達水平要明顯水平低于AOPP+FM組(P<0.05)。

3 討論

先前研究已經(jīng)證實，OS是OP發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，其表現(xiàn)主要為骨破壞的增加，影響老年人骨密度[2]。骨組織中ROS會隨年齡增長而增多，通過對相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)，影響細胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄表達，引起骨重建過程中OB生成減少，骨細胞凋亡增加，破骨細胞活性增強等，介導OP的發(fā)生發(fā)展[12]。本研究證實AOPPs可誘導OB凋亡。

那么，如何才能降低AOPPs誘導下OB的凋亡率？近年來，隨著對干細胞認識的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)干細胞具有調(diào)節(jié)炎癥作用，能降低局部OS效應，促進靶細胞功能恢復。Wang等[13]用MSCs與受氧化應激損傷的小鼠胰島微血管內(nèi)皮細胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞功能明顯改善，其成活率明顯提高。本研究也發(fā)現(xiàn)，采用HUMSCs條件培養(yǎng)基作用OB后，可以明顯降低AOPPs對OB的負性作用，減低OB凋亡率，同時OB凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達也明顯降低。Zhu等[14]的研究結(jié)果與此類似，這也證明了干細胞能夠有效保護OB免受氧化應激損傷。

目前認為線粒體是參與細胞凋亡調(diào)節(jié)的重要細胞器之一[11]。研究發(fā)現(xiàn)，ROS過量會導致線粒體膜電位顯著降低，線粒體膜通透性升高，線粒體功能障礙。同時，促凋亡蛋白表達上調(diào)，引導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和Ca2+超載，內(nèi)源性凋亡通路激活，最終導致細胞凋亡[9]。這與本研究結(jié)果一致，即AOPP刺激OB后，可顯著降低OB內(nèi)活性線粒體的數(shù)量，引起細胞凋亡。

但是，當將氧化損傷OB置于人體臍帶干細胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，OB凋亡明顯減低，可能是由于HUMSCs條件培養(yǎng)基中含有大量抗氧化應激相關(guān)因子，這些因子可以有效減少線粒體破壞，降低細胞凋亡率。Jiang等[15]用MSCs與角膜上皮細胞共同培養(yǎng)，以魚藤酮誘導的OS反應，發(fā)現(xiàn)MSCs作用下角膜上皮細胞愈合增強，線粒體轉(zhuǎn)移增加，這進一步表明干細胞能通過線粒體功能的活化來修復或保護靶細胞。

綜上所述，HUMSCs條件培養(yǎng)基可緩解氧化應激反應導致的線粒體功能與結(jié)構(gòu)損傷，并下調(diào)Caspase-3凋亡蛋白的表達，降低OB的凋亡。