陳清霖

(遼寧林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110036)

小葉白蠟為木犀科白蠟屬落葉喬木，是第三紀(jì)闊葉殘遺樹(shù)種，擁有“闊葉林活化石”的美譽(yù)。樹(shù)干筆直，枝葉茂盛，樹(shù)形優(yōu)美，為速生樹(shù)種，極具觀賞價(jià)值，是園林綠化的優(yōu)良樹(shù)種[1]。隨著城市園林綠化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，小葉白蠟成為城市綠化的一道靚麗風(fēng)景線，因此對(duì)小葉白蠟優(yōu)質(zhì)苗木的需求也逐年增加。但采用傳統(tǒng)方法播種育苗，培育周期長(zhǎng)，且苗木易發(fā)生變異。組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖速度快，繁殖系數(shù)高，且不受季節(jié)限制，可廣泛應(yīng)用于一些特殊品種及瀕危樹(shù)種等，可以挽救瀕危樹(shù)種，滿足園林綠化生產(chǎn)苗木需求。近年來(lái)，關(guān)于白蠟屬植物的研究主要集中在器官發(fā)生途徑[2-10]、體胚發(fā)生途徑等方面[11-13]。為解決園林生產(chǎn)綠化用苗，快速獲得小葉白蠟優(yōu)質(zhì)苗木，本研究以小葉白蠟成熟種子的胚為外植體，通過(guò)不同消毒處理確定最適消毒時(shí)間，篩選出初代、增殖、生根階段的最佳培養(yǎng)基，建立小葉白蠟快繁體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為小葉白蠟成熟種子的胚。2018年9-10月在遼寧省北票市采種，種子去除其它雜質(zhì)后放在4 ℃冰箱中貯藏。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)

成熟種子去翅后用洗衣粉水洗凈，清水浸泡種子1～2 h，然后流水沖洗0.5～1 h。將種子置于超凈工作臺(tái)上用70%酒精浸潤(rùn)30 s，0.1%HgCl2消毒8、10、12 min，無(wú)菌水清洗5～7次，置于無(wú)菌濾紙上取出胚，分別接種于MS、WPM、DKW誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)處理20粒種子，重復(fù)3次，7 d后統(tǒng)計(jì)污染率和成活率。

1.2.2 繼代培養(yǎng)

將長(zhǎng)勢(shì)良好的無(wú)菌苗接種至繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基為WPM，分別附加6-BA(0.5、1.5、2.5 mg·L-1)、NAA(0.05、0.15、0.25 mg·L-1)、蔗糖20 g·L-1、瓊脂6 g·L-1。2周后觀察無(wú)菌苗生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)的無(wú)菌試管苗接種在生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。以WPM為基本培養(yǎng)基，分別添加IBA 1.0 mg·L-1，IBA 1.0 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1，6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1，光照條件下培養(yǎng)10 d，統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.4 煉苗移栽

將小葉白蠟生根苗用流水沖洗掉根部瓊脂，然后快速蘸取多菌靈，移栽至草炭土∶蛭石=1∶1混合基質(zhì)中，2周后統(tǒng)計(jì)移栽苗成活率及生長(zhǎng)狀況。

1.2.5 培養(yǎng)條件

光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，每天光照14 h，溫度(25±2)℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件處理，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)小葉白蠟無(wú)菌外植體的影響

從表1可以看出，隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)，污染率均下降，消毒10 min的污染率最低15.2%，成活率最高84%，因此小葉白蠟種子最適宜的消毒方法為70%酒精消毒30 s、0.1%HgCl2消毒10 min。

表1 消毒時(shí)間對(duì)小葉白蠟外植體的影響

2.2 基本培養(yǎng)基種類(lèi)對(duì)小葉白蠟誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

從表2可以看出，接種在WPM培養(yǎng)基內(nèi)的胚啟動(dòng)較快，接種3～5 d后開(kāi)始萌動(dòng)，下胚軸開(kāi)始出現(xiàn)白色胚根，然后逐漸伸長(zhǎng)并逐漸轉(zhuǎn)綠，培養(yǎng)4周后開(kāi)始展開(kāi)為兩片綠色子葉，葉色正常，誘導(dǎo)率最高90%，因此WPM培養(yǎng)基為后續(xù)試驗(yàn)的最佳基本培養(yǎng)基。

表2 基本培養(yǎng)基對(duì)小葉白蠟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

2.3 激素組合對(duì)繼代培養(yǎng)的影響

從表3可以看出，6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1處理的增殖系數(shù)最大，無(wú)菌苗生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于其他處理。因此，小葉白蠟增殖培養(yǎng)最佳激素組合為6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1。

表3 激素種類(lèi)及濃度對(duì)小葉白蠟繼代培養(yǎng)的影響

2.4 激素組合對(duì)小葉白蠟生根培養(yǎng)的影響

從表4可以看出，添加NAA 0.5 mg·L-1、IBA 1.0 mg·L-1的生根率最高93%，平均生根數(shù)5.68條。添加IBA 1.0 mg·L-1處理的生根時(shí)間雖早，但主根細(xì)弱，后期生長(zhǎng)緩慢。添加6-BA 0.5 mg·L-1可能抑制了根的生長(zhǎng)。因此小葉白蠟最佳生根培養(yǎng)基為 WPM+NAA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂6 g·L-1。

表4 激素組合對(duì)小葉白蠟無(wú)菌苗生根培養(yǎng)的影響

2.5 煉苗移栽

在培養(yǎng)室將組培瓶打開(kāi)，讓無(wú)菌生根苗適應(yīng)外界環(huán)境，煉苗2～3 d后，用鑷子將無(wú)菌苗取出，用流水沖洗掉根部瓊脂，然后快速蘸取多菌靈，移栽至草炭土·蛭石=1·1基質(zhì)中，成活率82.3%，苗較高，葉片大而綠，無(wú)萎蔫及黃化現(xiàn)象，植株健壯。

3 結(jié) 論

小葉白蠟成熟種子用70%酒精浸潤(rùn)30 s，然后用0.1%HgCl2消毒10 min，外植體污染率較低，成活率較高。選擇MS、WPM、DKW培養(yǎng)基對(duì)胚進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)接種于WPM培養(yǎng)基的成熟胚誘導(dǎo)率達(dá)90%，葉色健康，苗生長(zhǎng)正常。最佳增殖培養(yǎng)基WPM+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1，增殖系數(shù)6.5，無(wú)菌苗長(zhǎng)勢(shì)最好。最佳生根培養(yǎng)基為WPM+NAA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1，無(wú)菌苗主根健壯，須根較多，平均生根數(shù)5.68條；將試管苗移栽至草炭土∶蛭石=1∶1基質(zhì)中，成活率可達(dá)82.3%，成功獲得小葉白蠟再生植株。