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        百合病毒檢測技術研究進展?

        2021-01-19 15:00:09趙斌安吳文靜浦心祎袁文天趙悅琪趙恒震
        生物學通報 2021年7期
        關鍵詞:百合特異性引物

        楊 丹 趙斌安 許 燕 張 琪 吳文靜浦心祎 袁文天 趙悅琪 趙恒震 史 斌

        (1 上海師范大學生命科學學院 上海 200234 2 同濟大學醫(yī)學院十院臨床醫(yī)學院 上海 200092 3 上海博滿生物科技有限公司 上海 201106)

        百合,除了可食用、入藥外,還因美好寓意備受人們的喜愛。百合科百合屬為多年生植物,其繁殖方式主要靠無性繁殖技術——扦插、分球等,這種方式會使感染百合的病毒不斷傳代,在開放環(huán)境下擴散感染其他植株,擴大病毒傳播范圍,最終對花卉種植業(yè)造成嚴重的經濟損失。因此,百合脫毒苗制備和相應病毒檢測技術對切斷病毒傳播、減少經濟損失至關重要。

        1 百合主要病毒種類及危害

        在百合種植過程中,百合斑駁病毒(lily mot‐tle virus,LMoV)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)與百合無癥病毒(lily symptomless vi‐rus,LSV)是最易感染百合、危害最大的3 種病毒。百合斑駁病毒和百合無癥病毒屬于線狀植物病毒,傳播廣、危害大,被我國明令禁止入境,是三類檢疫有害生物。黃瓜花葉病毒則造成葉萎縮黃化、變皺、莖變形等病癥。然而,上述3 種病毒常伴隨出現,導致百合花葉斑駁、花葉變形、植株矮化或無主桿、百合切花或鱗莖品質不合格。

        2 病毒形態(tài)觀察鑒定

        病毒粒子的形態(tài)結構和寄主病變情況清晰且直觀,是植物病毒鑒定和研究的重要依據。百合病毒的光學顯微診斷法是在光鏡下觀察病毒粒子的形態(tài)結構和存在狀態(tài)、寄主細胞的結構變化,以及病毒的復制和裝配等過程。隨著生命科學、物理學、化學和電子信息學的發(fā)展與相互滲透,電子顯微鏡技術包括負染色法(negative staining)、電 鏡 超 薄 切 片 法(electron microscopy ultrathin section)、免 疫 電 鏡 法(immuno special electronic microscope,ISEM)、膠體金免疫電鏡法(immunogold labeling)等逐漸成為主要研究手段,能提供更多的病毒信息。

        梁巧蘭等[3]利用負染色和超薄切片技術,在電鏡下觀察百合病毒和內含體形態(tài)、大小并配合間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)鑒定病毒侵染種類。電鏡檢測技術可直觀觀測到樣品,但需專業(yè)實驗室,配備電鏡等精密昂貴設備及高超嫻熟的專業(yè)操作技能,因此,不適用田間大量樣本檢測[4]。

        3 酶聯(lián)免疫吸附法

        酶聯(lián)免疫吸附法將植物病毒作為抗原,注射至動物體內產生抗體。每種病毒產生的抗血清具有特異性識別功能,可根據已知病毒的抗血清檢測未知病毒。該方法靈敏度較高,但納克級別以下無法檢測,且需制備高質量的抗血清,易出現假陰性??乖贵w反應具有專一性,但不同百合植株中病毒抗原會有所差異,常會漏檢某一病毒或某一株系病毒。此外,病毒感染植株也呈現不均勻分布、病毒分離多樣性及季節(jié)性差異,這些都會影響酶聯(lián)免疫的最終結果[5]。

        4 分子生物學方法

        4.1 PCR、RT-PCR 及多重PCR 技術 以核酸檢測為代表的分子生物學檢測技術因高特異性、高靈敏度、快速、便捷的特性得到廣泛關注并被快速普及。聚合酶鏈式反應技術(polymerase chain reaction,PCR):首先將雙鏈DNA 變性解旋成單鏈,在DNA 聚合酶的參與下,以單鏈DNA 為模板,特定引物為起點,利用4 種脫氧核苷酸,按照堿基互補配對原則復制成新的DNA,通過變性、退火、延伸等多個循環(huán),實現特定基因的體外放大。逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)則是在常規(guī)PCR基礎上運用逆轉錄酶,將逆轉錄與基因擴增在一個反應管內進行。而多重PCR 技術則是在同一反應液中加入多對特定引物對,擴增多段特定DNA 序列的過程。

        鄒迎春等[6]依據公開的百合斑駁病毒、百合無癥病毒序列保守區(qū),分別設計了能擴增出不同大小的目的片段的特異引物對,以18S rRNA 為內參基因,優(yōu)化多重RT-PCR 反應條件,實現了同時快速檢測多種病毒。該體系未檢測出其他病毒,特異性好,能分辨出2 種病毒和內參基因。

        PCR 技術操作簡單、特異性強,但在PCR 檢測過程中,假陽性或假陰性結果仍常存在。在RTPCR 檢測時,因RNA 病毒逆轉錄的過程中容易被RNA 酶污染,易出現假陰性。而多重PCR 技術因反應液中存在多對引物對,擴增時引物相互干擾,不同片段擴增效率不同,短片段優(yōu)先擴增,而且易出現人工片段,出現非特異性擴增,無法判斷是否存在假陽性,有時需添加假陽性檢測步驟。

        4.2 基因芯片 基因芯片又稱生物芯片,該技術將序列一致的靶序列的探針固定在支持物表面,再與待測樣本中的源核酸雜交,最終,通過測定熒光強度變化,對樣品序列信息進行解讀和分析,高通量獲取相關生物信息[7]。賈慧等[8]根據百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒和百合斑駁病毒及另外2 種常見的植物病毒——煙草花葉病毒和馬鈴薯Y 病毒的外殼蛋白基因,設計引物和寡核苷酸探針,通過芯片雜交反應條件(變性處理、時間、溫度)及雜交組分和濃度的不斷優(yōu)化,制備高特異性基因芯片。但基因芯片技術屬于綜合性的高新技術,不僅需要昂貴的芯片制作系統(tǒng),還需昂貴的激光共聚焦掃描儀輔助,且對操作人員的專業(yè)要求較高,這使得該技術的推廣受到了限制[9]。

        4.3 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP) 環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)由日本學者Notomi[10]提出,在恒溫條件下(65℃左右),具有鏈置換特性的Bst DNA 聚合酶的作用下,利用4 條可特異性識別靶基因上的6 個特異區(qū)域的引物(F3/B3 和FIP/BIP),可實現目標序列的109~1010倍擴增。

        本實驗室從百合斑駁病毒、百合無癥病毒、黃瓜花葉病毒的CP基因上尋找保守區(qū)域,選擇保守區(qū)域時避開所有的突變位點設計獲得LAMP 特異性引物,能識別靶序列上的6 個特異區(qū)域。建立的百合病毒的LAMP 和RT-LAMP 方法具有高特異性,與常見侵染百合的多種病毒無交叉,靈敏度高,可在模板純度只有10 個拷貝數下進行擴增,反應結果通過添加SYBR GreenⅠ染料,肉眼可視,顯色為綠色的樣品為陽性,含有百合病毒,顯色為橘色的樣品為陰性,不含百合病毒[11-12]。

        LAMP 反應時間短,靈敏度高,受樣本質量影響小,可省略DNA 或RNA 純化步驟[13]。本實驗室對現有的環(huán)介導等溫技術又進一步優(yōu)化,即實現LAMP 試劑預分裝和配套的樣本直擴技術,現場只需加樣1 次,無需電泳,實驗結果用熒光進行顯色判斷,陽性產物為綠色,陰性產物為橘紅色。LAMP 反應檢測靈敏度高,最低檢測限為2 個拷貝,檢測時間為20 min。整個反應只需要金屬浴或水浴鍋,3 支移液器即可操作,設備簡單,總費用6 000 元左右。

        LAMP 試劑預分裝。在百級凈化車間,將試劑分裝為2 個部分,A 試劑吹干在管蓋上,B 試劑分裝在PCR 管中,封裝好。由于核酸染料在反應前體系配制時加入,反應后無需開蓋添加染料進行顯色,避免因開蓋產生的氣溶膠污染。試劑放置室溫可長達7 個月。

        樣本直擴技術意味著樣本進一步處理即可直接加入反應體系,無需進行純化。固體樣品加入裂解液,95℃裂解10 min,上清液即可作為模板,無需純化。極大簡化了樣品制備的步驟,減少了勞動強度,也減少了污染的風險?,F場操作步驟簡單,高中生訓練2 h 即可操作。然而,LAMP 檢測方法也具有一定的局限性:靶序列要求較長,低于100 bp 無法設計引物。

        5 不同測定方法的比較

        目前,常用的百合病毒檢測方法雖多,但不同的方法會因植物病毒和寄主的不同而有不同的效果。雖然電鏡觀察法較直觀,但其需高倍數的電子顯微鏡,且樣品的制備費用昂貴。免疫學方法較為復雜,對實驗人員的操作能力要求較高,且實驗需制備大量的高質量的抗血清,成本高,不易廣泛推行。PCR 和LAMP 擴增時引物結合位點不同,PCR 引物只需與靶序列的上、下游位點結合且引物不完全匹配時,PCR 仍能擴增出片段,但易出現非特異性片段,而LAMP 4 條引物只有與靶序列的6 個區(qū)域完全匹配,才能進行有效擴增。與常規(guī)PCR 和RT-PCR 相比,LAMP 檢測具有特異性和靈敏度更高、用時更短。LAMP 只需在等溫條件下完成,用恒溫水浴鍋就可完成反應,適合在基層和現場快速檢測,操作簡便,是一項快速、便捷但又準確性高的新技術,具有很廣的發(fā)展前景。簡而言之,自LAMP 技術發(fā)展以來,因其操作簡單、不需要昂貴儀器設備、快速、高效、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點,更適用于田間樣本檢測。

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